CN111172025B - 一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置；包括：上层板和下层板，所述上层板和下层板通过固定嵌入所述下层板内部，所述上层板内嵌圣诞树网络结构，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度。本发明所涉及的装置将浓度形成层设置在上层板，细胞培养层设置在下层板，达到将两者分开的目的，避免细胞存留在培养腔之外的通道内，阻塞管道；细胞引入过程中，细胞首先加到纸芯片上，待细胞完全附着在纸基底上后，再和浓度梯度产生系统结合，每个培养腔内的细胞数量也是极其相似的，这样就保证了分析数据的重现性和准确性。

Description

一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置
技术领域
本发明涉一种检测装置领域；尤其涉及一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置。
背景技术
传统的基于细胞的化合物检测主要是在微孔板上进行，微孔板中的暴露溶液是相对静止的，这就造成细胞的代谢物不能及时自动排除；更为重要的是，多孔板是开放的系统，由于液体或待测物的挥发，导致不可控的溶液浓度变化。
硫化氢是一种重要的生理信号分子，在许多生理和病理功能中起着重要的作用。然而对于硫化氢供体(NaHS和GYY4137)的促进/抑制细胞生长的功能存在争议，一个重要原因是相关的研究实验都是在微孔板中进行的，而硫化氢是一种气体分子，硫化氢供体释放出的硫化氢气体会很从微孔板中挥发，导致实际检测的硫化氢气体浓度的不稳定性，给实验带来不可靠性。
微流控芯片自20世纪90年代发展以来，以其众多的优势而引起人们的关注，已逐渐成为细胞研究的重要工具，与微孔板相比微流控芯片能提供细胞更接近体内的生长条件。在传统的用于细胞培养的微流控芯片中，液流管道直接连接细胞培养腔，细胞与液流通过同一条线路进入到芯片中，这种结构使细胞培养腔中细胞数量得不到控制，细胞的分布受操作影响大，重现性很差，细胞由液流口引入，容易存在于管道的各个角落，阻塞液流管道。
发明内容
本发明的目的是提供了一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置。
第一方面，本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明涉及一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置，包括：上层板和下层板，所述上层板和下层板通过固定嵌入所述下层板内部；上层板的尺寸是90mm×70mm，下层板的尺寸是100mm×80mm。
优选地，所述上层板内嵌圣诞树网络结构，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度。
优选地，所述下层板设置有凹槽，其凹槽的尺寸为：长和宽是8mm,深4mm。
优选地，所述凹槽为放置纸芯片的部件，凹槽是纸芯片放置处。
优选地，所述上层板和下层板螺纹固定连接。
优选地，所述下层板设置有废液流出口，宽4mm,深为2.5mm，废液流出口的管道直径为4mm，所述凹槽与废液流出口连接。
优选地，所述圣诞树网络结构的上端面设置有2个浓度梯度流入口，其孔径是1.8mm。，其下端面设置有5个浓度梯度流出口。
优选地，所述浓度梯度流入口与圣诞树网络结构的上端面连接；所述浓度梯度流出口与所述圣诞树网络结构的下端面连接，且当上层板与下层板固定连接时，至凹槽的正上方。
优选地，所述圣诞树网络结构由管道组成，其直径为1.0mm。
本发明针对基于细胞的硫化氢活性检测中，硫化氢气体挥发导致的气体浓度不稳定性，及微流控芯片中细胞残留管道中造成管道堵塞及培养腔中细胞数量不可控的问题提出了一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置。
本发明涉及一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置，分为上下两层板，圣诞树网络结构嵌入上层板中，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度，下层带有凹槽，纸芯片放入凹槽内作为细胞培养的介质，有液流出口与凹槽相连，上层浓度梯度出口在凹槽的正上方；利用结晶紫染色法表征细胞的增殖率，利用荧光法检测细胞的凋亡情况。
在本发明的方法有以下优点：
(1)本发明基于在微流控芯片上检测硫化氢供体对细胞活性的影响，硫化氢供体溶液连续不断滴加到细胞上，对细胞进行刺激，上层各出口处流出的液体能够连续滴加到纸芯片上，液流在滴加到细胞之前处于密闭注射泵中，保证作用于细胞的液体中硫化氢气体的浓度稳定，代谢物能随着废液及时排出，可以在该装置中实现细胞的长时间培养。
(2)本发明所涉及的装置由3D打印技术，一步制作完成，简单方便，以生物兼容性高的纸芯片作为细胞培养和分析的介质，方便细胞染色和分析，并能大大减少试剂的用量。
(3)本发明所涉及的装置将浓度形成层设置在上层板，细胞培养层设置在下层板，达到将两者分开的目的，避免细胞存留在培养腔之外的通道内，阻塞管道；细胞引入过程中，细胞首先加到纸芯片上，待细胞完全附着在纸基底上后，再和浓度梯度产生系统结合，每个培养腔内的细胞数量也是极其相似的，这样就保证了分析数据的重现性和准确性。
(4)本发明基于硫化氢细胞增殖活性的影响，可以对纸芯片上的细胞进行结晶紫染色，根据纸芯片染色后的吸光度表征细胞的增殖活性，该方法简单方便成本低。
(5)本发明所涉及的装置通过硫化氢作用后，细胞的凋亡情况可以用荧光染料染色，通过激光扫描共聚焦显微镜观察。
附图说明
图1为本发明微流控芯片和纸芯片联合的细胞分析装置工作原理示意图；
图2为本发明微流控芯片的上、下层板结构拆卸图；
图3为本发明微流控芯片的上、下层板结构组装图；
图4为利用本装置检测不同浓度NaHS对细胞增殖的影响；
图5为利用本装置检测不同浓度NaHS作用后细胞的凋亡情况。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例1
本实施例涉及一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置，其结构见附图2、3所示：包括：上层板1和下层板2，所述上层板1和下层板2通过固定嵌入所述下层板内部；上层板的尺寸是90mm×70mm，下层板的尺寸是100mm×80mm。
本发明的工作原理见附图1所示。本实施例涉及一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置分为上下两层板，圣诞树网络结构嵌入上层板中，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度，下层带有凹槽，纸芯片放入凹槽内作为细胞培养的介质，有液流出口与凹槽相连，上层浓度梯度出口在凹槽的正上方；利用结晶紫染色法表征细胞的增殖率，利用荧光法检测细胞的凋亡情况。
优选地，所述上层板1内嵌圣诞树网络结构3，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度。
优选地，所述下层板2设置有凹槽4，其凹槽4的尺寸为：长和宽是8mm,深4mm。
优选地，所述凹槽4为放置纸芯片的部件。
优选地，所述上层板1和下层板2螺纹固定连接。
优选地，所述下层板2设置有废液流出口5，宽4mm,深为2.5mm，废液流出口5的管道直径为4mm，所述凹槽4与废液流出口5连接。
优选地，所述圣诞树网络结构3的上端面设置有2个浓度梯度流入口6，其孔径是1.8mm。，其下端面设置有5个浓度梯度流出口7。
优选地，所述浓度梯度流入口6与圣诞树网络结构3的上端面连接；所述浓度梯度流出口7与所述圣诞树网络结构6的下端面连接，且当上层板1与下层板2固定连接时，至凹槽4的正上方。
优选地，所述圣诞树网络结构3由管道组成，其直径为1.0mm。
实施例2
本实施例涉及本发明基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置所使用的纸芯片上细胞的种殖和培养，具体步骤如下：
将培养瓶中的细胞消化，离心收集细胞，调整细胞浓度到5×106个/mL，放在冰上预冷，取细胞悬夜和Matrigel 1:1混合，取2μL混合好的悬夜加到冰上预冷的纸芯片亲水区，待细胞悬液分布完全后，加入37℃预热的培养基，将纸芯片放入培养箱中30min，使Matrigel胶凝固。微流控设备、管和玻璃注射器利用蒸汽灭菌并烘干，用恒流注射泵将从流控设备的一个进液口注入含有NaHS的培养基，另一个进液口注入培养基，待形成稳定的浓度梯度后，将种有细胞的纸芯片放入微流控设备下部的凹槽内，将微流控设备的上下两层组合并用用螺丝固定，恒流泵的流速设定为2.5μL/min。微流控设备放入培养箱中培养特定的时间后，将设备拆开取出纸芯片进行处理和分析。
实施例3：
本实施例涉及本发明基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置的工作原理所涉及到的硫化氢连续作用对细胞增殖的影响，具体步骤如下：
1)细胞增殖活性检测，利用本装置检测不同浓度NaHS对细胞增殖的影响，效果可见附图4，将纸芯片上的细胞在连续暴露于NaHS 48小时后(芯片一端进200μM的NaHS,一端进培养基)，拆开装置，取出纸芯片，加入4％多聚甲醛固定20分钟，PBS洗三次，加入结晶紫染色液染色10分钟，用双蒸水彻底漂洗，检测光密度。
2)Annexin V/PI染色实验。利用本装置检测不同浓度NaHS作用后细胞的凋亡情况，其效果见附图5，将纸芯片上的细胞在连续暴露于NaHS 48小时后，拆开装置，取出纸芯片，细胞用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒染色，染色步骤按照试剂盒的说明书进行，纸芯片上的细胞用共聚焦显微镜成像观察。
本发明针对基于细胞的硫化氢活性检测中，硫化氢气体挥发导致的气体浓度不稳定性，及微流控芯片中细胞残留管道中造成管道堵塞及培养腔中细胞数量不可控的问题提出了一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置。
本发明涉及一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置，分为上下两层板，圣诞树网络结构嵌入上层板中，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度，下层带有凹槽，纸芯片放入凹槽内作为细胞培养的介质，有液流出口与凹槽相连，上层浓度梯度出口在凹槽的正上方；利用结晶紫染色法表征细胞的增殖率，利用荧光法检测细胞的凋亡情况。
在本发明的方法有以下优点：
(1)本发明基于在微流控芯片上检测硫化氢供体对细胞活性的影响，硫化氢供体溶液连续不断滴加到细胞上，对细胞进行刺激，上层各出口处流出的液体能够连续滴加到纸芯片上，液流在滴加到细胞之前处于密闭注射泵中，保证作用于细胞的液体中硫化氢气体的浓度稳定，代谢物能随着废液及时排出，可以在该装置中实现细胞的长时间培养。
(2)本发明所涉及的装置由3D打印技术，一步制作完成，简单方便，以生物兼容性高的纸芯片作为细胞培养和分析的介质，方便细胞染色和分析，并能大大减少试剂的用量。
(3)本发明所涉及的装置将浓度形成层设置在上层板，细胞培养层设置在下层板，达到将两者分开的目的，避免细胞存留在培养腔之外的通道内，阻塞管道；细胞引入过程中，细胞首先加到纸芯片上，待细胞完全附着在纸基底上后，再和浓度梯度产生系统结合，每个培养腔内的细胞数量也是极其相似的，这样就保证了分析数据的重现性和准确性。
(4)本发明基于硫化氢细胞增殖活性的影响，可以对纸芯片上的细胞进行结晶紫染色，根据纸芯片染色后的吸光度表征细胞的增殖活性，该方法简单方便成本低。
(5)本发明所涉及的装置通过硫化氢作用后，细胞的凋亡情况可以用荧光染料染色，通过激光扫描共聚焦显微镜观察。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (3)

1.一种基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置，其特征在于，包括：上层板和下层板，所述上层板和下层板通过固定嵌入所述下层板内部；
所述上层板内嵌圣诞树网络结构，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度，所述圣诞树网络结构的上端面设置有2个浓度梯度流入口，其下端面设置有5个浓度梯度流出口，所述浓度梯度流入口与圣诞树网络结构的上端面连接；所述浓度梯度流出口与所述圣诞树网络结构的下端面连接，且当上层板与下层板固定连接时，至凹槽的正上方，所述圣诞树网络结构由管道组成，其直径为1.0mm；
所述下层板设置有凹槽；所述凹槽为放置纸芯片的部件。
2.如权利要求1所述的基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置，其特征在于，所述上层板和下层板螺纹固定连接。
3.如权利要求1所述的基于细胞的硫化氢活性检测复合微流控芯片装置，其特征在于，所述下层板设置有废液流出口，所述凹槽与废液流出口连接。
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