CN111876328A - 一种细胞低氧实验装置及分析方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种细胞低氧实验装置及分析方法；一种细胞低氧实验装置，其特征在于，包括：下层板(2)，所述下层板(2)内嵌圣诞树网络结构的气体管道，所述气体管道由蜿蜒通道(4)和水平通道(5)组成，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度；所述下层板(2)设置有细胞培养室(6)；所述下层板设置有细胞培养室，不同氧气浓度的气体进入独立、封闭的细胞培养室，使各培养室内的培养基含有不同的氧气浓度，培养室内的细胞即处于不同的氧气浓度中；由于氧气浓度梯度的存在，可以更加直接地将不同氧气浓度对细胞造成的影响进行比较；实现了氧气浓度及检测方法的多元化，为深入探究低氧环境对细胞的影响奠定了基础。

Description

一种细胞低氧实验装置及分析方法
技术领域
本发明属于检测领域；尤其涉及一种细胞低氧实验装置及分析方法。
背景技术
氧气在细胞的各种信号通路中发挥着重要作用，当氧气需求超过供应时，细胞内氧气水平下降，细胞经历低氧。低氧环境会对细胞造成急、慢性危害，还会有致癌、致畸、致突变等远期危害，因此低氧关系到细胞及生物体的生存和发展。
为了研究细胞在低氧环境下的生理反应，低氧室、低氧工作站和低氧微流控芯片已经被用来创造低氧环境。然而，这些工具有的成本高且一次只能提供单一水平的低氧环境，有的制作过程复杂且低氧细胞的分析主要依赖荧光显微镜，使得细胞的一些生理改变无法分析。
基于上述现有技术的不足，本发明针对基于细胞的低氧研究中，低氧设备成本高，制作过程繁琐，不能实现氧气浓度梯度及检测方法单一的问题，提出了一种细胞低氧实验装置，并建立了低氧装置中相关的细胞分析方法，以探究低氧环境对细胞的影响，由于氧气梯度的存在，可以更加直接地比较不同氧气浓度对其造成影响程度的不同。
发明内容
本发明的目的是提供了一种细胞低氧实验装置及分析方法。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明涉及一种细胞低氧实验装置，包括：下层板2，所述下层板2内嵌圣诞树网络结构的气体管道，所述气体管道由蜿蜒通道4和水平通道5组成，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度；所述下层板2设置有细胞培养室6；本发明装置可以产生氧气梯度，可以更加直接地将不同氧气浓度对细胞造成的影响程度进行比较。
优选地，所述圣诞树网络结构的气体管道的上端面设置有气体入口3，其下端面与所述细胞培养室6连接。将氮气和空气分别从圣诞树网络结构的气体管道中气体入口3进入，最后进入细胞培养室6，对培养室内的细胞进行低氧浓度梯度处理。
优选地，所述细胞培养室6设有带螺丝孔的上层盖板1，且通过螺丝孔与所述细胞培养室6连接。
优选地，所述上层盖板1设有软硅胶垫，所述上层盖板1通过软硅胶垫与所述细胞培养室6连接，通过软硅胶垫密封培养室，使培养室与体系外的气体隔绝，进行低氧浓度梯度处理过程中只接受来自上游气体通道(来自从圣诞树网络结构的气体管道中气体入口进入的气体)的气体，多余的气体经与培养室相连的排气通道排出。
优选地，所述细胞培养室6设置有气体出口7，将细胞培养室6内多余的气体经与细胞培养室6相连的气体出口7排出。
优选地，所述圣诞树网络结构的气体管道的上端面设置有2个气体入口3，其下端面设置有5个浓度梯度气体流出口。
优选地，所述5个浓度梯度流出口通往所述细胞培养室6内，每个浓度梯度流出口对应一个细胞培养室6，每个细胞培养室6均是独立的，封闭的。
第二方面，本发明还涉及前述的细胞低氧实验装置的分析方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1，将带有细胞的纸芯片放入所述细胞培养室6中，进行低氧浓度梯度处理；
步骤2，荧光成像法检测纸芯片上细胞内的相关信号变化；
步骤3，将带有细胞的纸芯片放入离心管中消化收集细胞，进行流式细胞仪分析；
步骤4，带有细胞的纸芯片放入离心管进行细胞裂解，收集蛋白进行western blot分析或提取细胞RNA进行逆转录PCR(reverse transcription PCR)或实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR)。
优选地，步骤1中，具体步骤为：将纸芯片的两面紫外照射过夜灭菌，将纸芯片上加入稀释40倍的基质胶(Matrigel)，4℃过夜，然后在37℃放置1小时让Matrigel凝固，将纸芯片放在24孔板中，加入细胞悬液，待细胞贴壁牢固后，将带有细胞的纸芯片放入提前加入培养基的培养室中，将上层板嵌入所述下层板内，两个气体入口以同样的压力分别输入空气和氮气，将细胞低氧实验装置放入细胞培养箱，细胞在低氧梯度装置中处理。
本分发明的原理：一种细胞低氧实验装置分为上下两层，圣诞树网络结构的气体管道嵌入下层板中，氮气和空气分别进入装置的两个气体入口，利用通道内层流和混流效应产生氧气浓度梯度，气体通道连通培养室，nitrocellulose(NC)膜为材料制作的纸芯片放入培养室作为细胞培养的介质，培养室有上盖板，通过软硅胶垫密封使培养室与体系外的气体隔绝，只接受来自上游气体通道的气体，多余的气体经与培养室相连的排气通道排出。
本发明的方法有以下优点：
(1)本发明所涉及的细胞低氧实验装置中，氮气和空气通过气体缓冲瓶分别进入3D打印芯片的两个气体入口，利用圣诞树网络结构内层流和混流效应产生氧气浓度梯度，使得不同氧气浓度的气体进入独立、封闭的细胞培养室，使各培养室内的培养基含有不同的氧气浓度，培养室内的细胞即处于不同的氧气浓度中。
(2)本发明所涉及的细胞低氧实验装置由3D打印技术，一步制作完成，简单方便。
(3)本发明所涉及的细胞低氧实验装置中，以生物兼容性高的nitrocellulose(NC)膜为材料制作纸芯片，纸芯片作为装置中细胞生长的介质，细胞在纸芯片上贴壁生长后，转入低氧装置中进行低氧处理。
(4)本发明所涉及的细胞低氧实验装置中，纸芯片上的细胞在细胞低氧实验装置中进行一定时间的低氧浓度处理后，可以通过激光扫描共聚焦显微镜荧光成像法检测细胞内相关信号的变化。
(5)本发明所涉及的细胞低氧实验装置中，纸芯片上的细胞在细胞低氧实验装置中进行一定时间的低氧浓度处理后，可将纸芯片放入离心管中消化收集细胞，进行流式细胞仪分析。
(6)本发明所涉及的细胞低氧实验装置中，纸芯片上的细胞在细胞低氧实验装置中进行一定时间的低氧浓度处理后，可将纸芯片放入离心管进行细胞裂解，收集蛋白进行western blot分析或提取细胞RNA进行逆转录PCR(reverse transcription PCR)或实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR)。
附图说明
图1为本发明低氧装置整体工作过程示意图；
图2为3D打印微流控芯片的上下层板结构图；其中，1.上层盖板；2.下层板；3.气体入口；4蜿蜒通道；5.水平通道；6.细胞培养室；7.气体出口
图3各通道培养室内氧气荧光成像图及氧气浓度与理论氧气浓度的线性关系图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。应当指出的是，以下的实施实例只是对本发明的进一步说明，但本发明的保护范围并不限于以下实施例。
实施例
本实施例涉及一种细胞低氧实验装置，其结构见附图2所示：本发明涉及一种细胞低氧实验装置，包括：下层板2，所述下层板2内嵌圣诞树网络结构的气体管道，所述气体管道由蜿蜒通道4和水平通道5组成，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度；所述下层板2设置有细胞培养室6；本发明装置可以产生氧气梯度，可以更加直接地将不同氧气浓度对细胞造成的影响程度进行比较。
优选地，所述圣诞树网络结构的气体管道的上端面设置有气体入口3，其下端面与所述细胞培养室6连接。将氮气和空气分别从圣诞树网络结构的气体管道中气体入口3进入，最后进入细胞培养室6，对培养室内的细胞进行低氧浓度梯度处理。
优选地，所述细胞培养室6设有带螺丝孔的上层盖板1，且通过螺丝孔与所述细胞培养室6连接。
优选地，所述上层盖板1设有软硅胶垫，所述上层盖板1通过软硅胶垫与所述细胞培养室6连接，通过软硅胶垫密封培养室，使培养室与体系外的气体隔绝，进行低氧浓度梯度处理过程中只接受来自上游气体通道(来自从圣诞树网络结构的气体管道中气体入口进入的气体)的气体，多余的气体经与培养室相连的排气通道排出。
优选地，所述细胞培养室6设置有气体出口7，将细胞培养室6内多余的气体经与细胞培养室6相连的气体出口7排出。
优选地，所述圣诞树网络结构的气体管道的上端面设置有2个气体入口3，其下端面设置有5个浓度梯度气体流出口。
优选地，所述5个浓度梯度流出口通往所述细胞培养室6内，每个浓度梯度流出口对应一个细胞培养室6，每个细胞培养室6均是独立的，封闭的。
第二方面，本发明还涉及前述的细胞低氧实验装置的分析方法，所述方法包括如下步骤：
步骤1，将带有细胞的纸芯片放入所述细胞培养室6中，进行低氧浓度梯度处理；
步骤2，荧光成像法检测纸芯片上细胞内的相关信号变化；
步骤3，将带有细胞的纸芯片放入离心管中消化收集细胞，进行流式细胞仪分析；
步骤4，带有细胞的纸芯片放入离心管进行细胞裂解，收集蛋白进行western blot分析或提取细胞RNA进行逆转录PCR(reverse transcription PCR)或实时荧光定量PCR(Real-time fluorescent quantitative PCR)。
优选地，步骤1中，具体步骤为：将纸芯片的两面紫外照射过夜灭菌，将纸芯片上加入稀释40倍的基质胶(Matrigel)，4℃过夜，然后在37℃放置1小时让Matrigel凝固，将纸芯片放在24孔板中，加入细胞悬液，待细胞贴壁牢固后，将带有细胞的纸芯片放入提前加入培养基的培养室中，将上层板嵌入所述下层板内，两个气体入口以同样的压力分别输入空气和氮气，将细胞低氧实验装置放入细胞培养箱，细胞在低氧梯度装置中处理。
本实施例还涉及利用细胞低氧实验装置的分析方法，具体步骤如下：见附图1所示。
(1)细胞低氧实验装置的设计和制作
用设计软件设计细胞低氧实验装置，包括下层板和上层盖板，产生浓度梯度的“圣诞树”微流控网络嵌入到下层板中，每路管道的末端与一个细胞培养室连通，每个培养室有另一侧连有通往外部的出口作为气体流出口，培养室的上方有盖板，通过软硅胶垫用螺丝固定到下层板上，使每个培养室形成一个独立的空间，以透明树脂为材料用3D打印机打印出设计好的芯片。
(2)NC膜上纸芯片的制作
纸芯片的圆形微孔阵列用Freehand软件设计方形阵列，方形区域的边长10mm,用喷蜡打印机将蜡打印到NC上，打印好的NC膜于125℃烘烤5min，让蜡融化并渗透到整层膜中。用剪刀从剪下纸芯片，在紫外灯下照射过夜灭菌，然后，另一面再灭菌4小时，然后把他们放在无菌的容器中备用。
(3)纸芯片上细胞的种殖及低氧装置中细胞的培养
将纸芯片的两面紫外照射过夜灭菌，将纸芯片上加入稀释40倍的Matrigel，4℃过夜，然后在37℃放置1小时让基质胶(Matrigel)凝固，将纸芯片放在24孔板中，加入细胞悬液，待细胞贴壁牢固后，将带有细胞的纸芯片放入提前加入培养基的低氧装置培养室中，用螺丝将上层盖及软硅胶垫固定在下层板上，两个气体入口以同样的压力分别输入空气和氮气，将低氧装置放入细胞培养箱，细胞在低氧梯度装置中处理特定的时间。
(4)低氧处理后细胞的荧光成像观察
纸芯片上的细胞在低氧装置中处理一定的时间后，拆开装置，取出纸芯片，对纸芯片上的细胞进行荧光染色后进行荧光成像观察。
(5)低氧处理后细胞细胞周期分析、细胞内蛋白及基因分析
纸芯片上的细胞在低氧装置中处理一定的时间后，拆开装置，取出纸芯片将其放入离心管中，消化收集细胞进行细胞周期分析，或向离心管中加入裂解液提取细胞蛋白或总RNA。
图3中：(A)经本申请细胞低氧实验装置处理的各通道培养室内氧气荧光成像图及氧气浓度与理论氧气浓度的线性关系，装置中1-5通道培养室内的氧气浓度荧光成像图,氧气能淬灭氧气荧光探针的荧光，氧气浓度越低荧光越强，反之亦然；
(B)用氧气浓度荧光探针测得的5个通道培养室内的氧气浓度与理论氧气浓度的线性关系图，当一个入口通入氮气，另一个入口通入空气时，各通道(通道1-5，如图1所示)内的理论氧气浓度为[O2]＝21％/4×(n-1),n为通道顺序号。
当左侧入口通入氮气，右侧入口通入空气时，利用氧气荧光探针成像各培养室中的液体荧光强度，由于氧气能淬灭氧气荧光探针的荧光，培养室内的荧光强度从左到右(1-5)依次减弱，根据各通道培养室内荧光强度计算出来的氧气浓度值与理论氧气浓度值呈现较好的线性，线性相关系数R2＝0.984。
由图3的结果可以清楚地看出：经过本发明所涉及的细胞低氧实验装置处理，利用圣诞树网络结构因内层流和混流效应产生氧气浓度梯度，使得不同氧气浓度的气体进入独立、封闭的细胞培养室，使各培养室内的培养基含有不同的氧气浓度，培养室内的细胞即处于不同的氧气浓度中。本发明经过巧妙地设计，在装置中设置圣诞树网络结构的气体管道，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度；由于氧气梯度的存在，可以更加直接地将不同氧气浓度对其造成影响程度进行比较。从而实现了氧气浓度及检测方法的多元化,为探究低氧环境对细胞的影响的研究奠定了基础。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质。

Claims (9)

1.一种细胞低氧实验装置，其特征在于，包括：下层板(2)，所述下层板(2)内嵌圣诞树网络结构的气体管道，所述气体管道由蜿蜒通道(4)和水平通道(5)组成，利用通道内层流和混流效应产生浓度梯度；所述下层板(2)设置有细胞培养室(6)。
2.如权利要求1所述的细胞低氧实验装置，其特征在于，所述圣诞树网络结构的气体管道的上端面设置有气体入口(3)，其下端面与所述细胞培养室(6)连接。
3.如权利要求1所述的细胞低氧实验装置，其特征在于，所述细胞培养室(6)设有带螺丝孔的上层盖板(1)，且通过螺丝孔与所述细胞培养室(6)连接。
4.如权利要求3所述的细胞低氧实验装置，其特征在于，所述上层盖板(1)设有软硅胶垫，所述上层盖板(1)通过软硅胶垫与所述细胞培养室(6)连接。
5.如权利要求1所述的细胞低氧实验装置，其特征在于，所述细胞培养室(6)设置有气体出口(7)。
6.如权利要求2所述的细胞低氧实验装置，其特征在于，所述圣诞树网络结构的气体管道的上端面设置有2个气体入口(3)，其下端面设置有5个浓度梯度气体流出口。
7.如权利要求6所述的细胞低氧实验装置，其特征在于，所述5个浓度梯度流出口通往所述细胞培养室(6)内。
8.一种利用如权利要求1所述的细胞低氧实验装置的分析方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
步骤1，将带有细胞的纸芯片放入所述细胞培养室(6)中，进行低氧浓度梯度处理；
步骤2，荧光成像法检测纸芯片上细胞内的相关信号变化；
步骤3，将带有细胞的纸芯片放入离心管中消化收集细胞，进行流式细胞仪分析；
步骤4，将带有细胞的纸芯片放入离心管进行细胞裂解，收集蛋白进行western blot分析或提取细胞RNA进行逆转录PCR或实时荧光定量PCR。
9.如权利要求1所述的细胞低氧实验装置的分析方法，其特征在于，步骤1中，具体步骤为：将纸芯片的两面紫外照射过夜灭菌，将纸芯片上加入稀释40倍的Matrigel，4℃过夜，然后在37℃放置1小时让Matrigel凝固，将纸芯片放在24孔板中，加入细胞悬液，待细胞贴壁牢固后，将带有细胞的纸芯片放入提前加入培养基的细胞培养室(6)中，将上层盖板(1)及软硅胶垫嵌入所述下层板(2)内，两个气体入口(3)以同样的压力分别输入空气和氮气，将细胞低氧实验装置放入细胞培养箱，细胞在低氧梯度装置中处理。
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