CN110951669A - 提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法，涉及外泌体提取技术领域。本发明公开的提取外泌体的共沉淀剂含有如下组分：亲水聚合物、无机盐和葡萄糖。采用本发明提供的试剂组提取外泌体操作简单，不涉及昂贵的精密仪器，普适性更强，同时有效降低了检测的时间和经济成本，有利于市场应用推广，所提取的外泌体含量和纯度较高，所提取的外泌体用于提取核酸和蛋白时，可提取出高质量的核酸和蛋白。

Description

提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法
技术领域
本发明涉及外泌体提取技术领域，具体而言，涉及一种提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法。
背景技术
外泌体是50-150nm的小细胞外囊泡(sEV)，其含有蛋白质、脂质和核酸，并且在各种生理和病理途径中充当细胞-细胞通信的重要介质。目前的研究表明：外泌体在血液、唾液、尿液、腹水、羊水、母乳和脊液等体液中均具有较高的丰度，且其中含有蛋白质、RNA和脂肪成分。外泌体不仅可以保护细胞分泌的RNA稳定存在，还可以保护细胞合成过程中的中间产物，还能够作为有效的载体将RNA转运到特定的靶细胞中，发挥重要的调控作用。
多国学者经深入研究发现外泌体还可以运输核酸，参与细胞间通讯，参与细胞间的物质交换和信息交流，影响细胞的生理状态，并与多种疾病的发生与进程密切相关。直接从患者血清等体液标本分离外泌体，并对其内容物进行检测，临床应用前景广阔，因此外泌体及其内容物提取方面的研究和选择有重要的实用意义。
目前存在的分离外泌体的方法主要有以下几种：
1)利用不同的超速离心速度或者是密度梯度离心。目前该方法被认为是外泌体分离的金标准，用此法分离的外泌体的纯度高，但此法提取出的外泌体RNA含量非常低，且超速离心机价格昂贵无法普及，并且此法提取的外泌体结构域可能被破坏。因此并不适用于大量实际应用推广。
2)超滤法，此方法虽然操作简单，但得到的外泌体纯度不高。
3)商品化的试剂盒，此种方法，可以分为两类，一类是将抽提试剂加入到样品中，离心得到外泌体的沉淀；另一类是通过层析柱或磁珠等吸附富集。市售试剂盒通常操作简便，但是，对于一些复杂样本，例如尿液、乳汁、细胞上清等，从少量的上述样本中提取的外泌体量过低，无法达到一些大规模筛选或表达检测的实验要求。同时，提取试剂的昂贵使得其在实际中很难推广应用，很大程度限制了这种方法的应用；并且随着外泌体的研究不断深入，仅提取外泌体已无法完全满足研究的需求，为了后续深入研究，需要进一步提取其相关蛋白或核酸，这无疑进一步增加了研究成本。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提取外泌体的共沉淀剂、试剂组、试剂盒和提取方法。采用本发明提供的共沉淀剂提取外泌体操作简单，不涉及昂贵的精密仪器，普适性更强，同时有效降低了检测的时间和经济成本，有利于市场应用推广，所提取的外泌体含量和纯度较高，所提取的外泌体用于提取核酸和蛋白时，可提取出高质量的核酸和蛋白。
本发明是这样实现的：
第一方面，本发明实施例提供一种提取外泌体的共沉淀剂，所述共沉淀剂含有如下组分：亲水聚合物、无机盐和葡萄糖。
本发明的实施例研究发现，将亲水聚合物、无机盐和葡萄糖混合在同一体系中用于提取外泌体时，利用各组分的相互配合作用，该共沉淀剂可以改变外泌体在样品中的微环境，使其易于在提取环境中沉降，提高外泌体收率，提高外泌体的提取量和纯度；此外，该共沉淀剂的组分简单易获取，可适用于多种类型的体液样品提取或也适用于小体积液体样本中的外泌体提取和检测，提取方法简单，无需特殊设备，避免了超高速离心力对外泌体的伤害，分离得到的外泌体结构完整、其内含物保存完好，适宜对外泌体进一步分离或其内含物分析，例如用于后续的核酸或蛋白提取。
无机盐与亲水聚合物的配合作用在于，在适当的浓度或是在一个特定的温度下可形成双水相萃取体系；物质进入双水相体系后，由于表面性质、电荷作用和各种作用力(如憎水键、氢键和离子键等)的存在和环境因素的影响，使其在上、下相中的浓度不同，适宜提取水溶性的蛋白质、酶、外泌体等生物活性物质，且不易引起蛋白质的变性失活，也不存在有机溶剂残留问题。
葡萄糖的作用是增加溶液的粘度，维持渗透压，防止外泌体受机械剪切力作用而降解。
在可选的实施方式中，在所述共沉淀剂中，所述亲水聚合物的含量为25％-75％，优选为40％-60％(w/v)，更优选为50％(w/v)。
在可选的实施方式中，所述亲水聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮中的任意一种或几种的组合。
通过控制亲水聚合物的浓度范围或选用合适类型的亲水聚合物例如聚乙二醇、葡聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮，能最大程度地排除底层相中的非外泌体杂质，显著提高外泌体的纯度，可有效降低后续外泌体研究中的假阳性率。
在可选的实施方式中，所述亲水聚合物为聚乙二醇。
在可选的实施方式中，所述亲水聚合物为聚乙二醇和葡聚糖的组合。
在可选的实施方式中，聚乙二醇的分子量为7000-9000。聚乙二醇(PEG)作为环氧乙烷的聚合产物，是一种理想的用于提取外泌体的沉淀剂组分，经本发明实施例研究发现，使用低分子量(7000-9000)聚乙二醇，在提取时，生物样本无须进行孵育，便能得到高保真的外泌体，缩短了时间，同时有效提高了提取效率。
在可选的实施方式中，聚乙二醇的分子量为8000。
本发明的研究还发现，使用分子量为8000的聚乙二醇提取得到的外泌体分布较均匀，整体均一性更好，数量也更多。
在可选的实施方式中，所述无机盐选自钠盐、钾盐和镁盐中的至少一种。
所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、葡萄糖酸钠和醋酸钠中的至少一种。
在可选的实施方式中，所述无机盐选自NaCl。
在可选的实施方式中，在所述共沉淀剂中，NaCl的浓度为0.4-0.6mol/L。
在可选的实施方式中，在所述共沉淀剂中，葡萄糖的含量为2％-3％(w/v)。
在可选的实施方式中，所述共沉淀剂的溶剂选自PBS或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
在可选的实施方式中，所述共沉淀剂的pH为6.8-7.4。
第二方面，本发明实施例提供一种提取外泌体的试剂组，其包括前述实施方式任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂以及用于保存外泌体的保存液A。
在可选的实施方式中，所述保存液A含有如下组分：硫酸多粘菌素B、硫酸庆大霉素、Tris-HCl、EDTA和蔗糖。
硫酸多粘菌素BE和硫酸庆大菌素B配合使用，具有抑菌效果，有效延长外泌体的保存时限，避免其受污染。
在可选的实施方式中，在所述保存液A中，硫酸多粘菌素B的含量为0.02-0.04g/L。
在可选的实施方式中，在所述保存液A中，酸庆大霉素的含量为0.1-0.2g/L。
在可选的实施方式中，所述保存液A的溶剂选自PBS、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液。
在可选的实施方式中，所述保存液A的pH为7.0-7.2。
在可选的实施方式中，所述保存液A含有：0.02g/L硫酸多粘霉菌素B、0.2g/L硫酸庆大霉素、0.05mol/L Tris-HCl、20mol/L EDTA和28mol/L蔗糖，溶剂为PBS，pH为7.0-7.2。
第三方面，本发明实施例提供一种提取外泌体的试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂或前述实施方式任一项所述的提取外泌体的试剂组。
第四方面，本发明实施例提供一种外泌体及其核酸和蛋白共提取的试剂盒，其包括前述实施方式任一项所述的提取外泌体的试剂组，以及核酸提取试剂组和蛋白提取试剂组。
在可选的实施方式中，所述核酸提取试剂组包括如下试剂中的至少一种：裂解液、抽提液A、洗脱液A、洗脱液B和保存液B。
在可选的实施方式中，所述裂解液含有：盐酸胍、EDTA-2Na和Tris-HCl。
在可选的实施方式中，所述裂解液含有：3-5mol/L盐酸胍、10-15m mol/L EDTA-2Na和40-45mmol/L Tris-HCl。在可选的实施方式中，所述抽提液A含有：SDS和Triton-100。
在可选的实施方式中，所述抽提液A含有：0.01-0.02g/mL SDS和4-6μL/mLTriton-100。
在可选的实施方式中，所述洗脱液A含有乙醇、GuSCN和柠檬酸钠。
在可选的实施方式中，所述洗脱液A含有20％-40％(v/v)乙醇、1-3M GuSCN和5-7mM柠檬酸钠。
在可选的实施方式中，所述洗脱液B含有乙醇、NaCl和Tris-HCl。
在可选的实施方式中，所述洗脱液B含有75％-85％(v/v)乙醇、18-22mM NaCl和1-3mM Tris-HCl。
在可选的实施方式中，所述保存液B为含0.1％-0.2％(v/v)DEPC的水溶液。
在可选的实施方式中，所述核酸提取试剂组还包括用于吸附核酸的吸附柱。
在可选的实施方式中，所述吸附柱的基质为玻璃纤维滤膜。
在可选的实施方式中，所述吸附柱为硅胶柱。
在可选的实施方式中，所述核酸提取试剂组所提取的核酸为RNA。
使用上述核酸提取试剂组从外泌体中提取核酸时，其所用样品为采用上述提取外泌体的试剂组所提取的外泌体样品，基于吸附柱例如硅胶柱的纯化方式，外泌体在含高浓度异硫氰酸胍裂解液中匀浆裂解，核酸释放到裂解液中。吸附柱以高结合力的玻璃纤维滤膜为基质，滤膜在高浓度离子化试剂(如盐酸胍或异硫氰酸胍)条件下，可通过氢键和静电等物理化学作用吸附核酸，而蛋白质和其他杂质则不被吸附而去除。吸附了核酸的滤膜经洗涤去除残留的蛋白质和盐，用低盐缓冲液(如Buffer TE)或DEPC处理水，洗脱出滤膜上吸附的核酸，得到的核酸纯度高，可直接应用于各种下游实验。
在可选的实施方式中，所述蛋白提取试剂组包括如下试剂中的至少一种：抽提液B和保存液C。
在可选的实施方式中，所述抽提液B含有：吐温-20、NP-40、sodiumdeoxycholate、PMSF和Aprotinin，溶剂为PBS。
在可选的实施方式中，所述抽提液B含有：1-3ml/L吐温-20、1％-2％(w/v)NP-40、0.4％-0.6％(w/v)sodiumdeoxycholate、8-12μl/ml PMSF和25-35μl/ml Aprotinin。
NP-40(乙基苯基聚乙二醇)是温和的去垢剂，1％的浓度基本可以破坏胞膜，而对核膜破坏的作用弱，结合特定的缓冲液等试剂还可获得胞浆蛋白。与蛋白结合能力强，用于防止物质分子疏水间相互作用，确保蛋白的充分溶解和结构稳定。sodiumdeoxycholate、PMSF和Aprotinin用于裂解细胞，溶解蛋白，抑制蛋白酶，防止蛋白降解。
在可选的实施方式中，所述保存液C含有：叠氮钠、山梨酸钾和甘油，溶剂为PBS。
在可选的实施方式中，所述保存液C含有：0.1％-0.2％(w/v)叠氮钠、0.04％-0.06％(w/v)山梨酸钾和4％-6％(v/v)甘油。
使用上述蛋白提取试剂组提取蛋白时，其所用样品可以是经上述提取外泌体的试剂组或上述核酸提取试剂组提取后，所收集的包含蛋白质和其他盐类杂质的洗涤液的合并液，以该合并液作为样品，加入抽提液B回收蛋白质，加入保存液C溶解，可得到高纯度的，可直接应用于下游分子检测的蛋白质溶液。
本发明实施例提供的外泌体及其核酸和蛋白共提取的试剂盒，其不仅可以提取外泌体，还可以直接以所提取的外泌体作为基础，从中提取核酸和蛋白，使用者不必再额外购买提取核酸和蛋白的试剂，降低了提取成本，可以一站式解决外泌体及其核酸和蛋白的提取问题，大大地提高了提取工作的便捷性。
在可选的实施方式中，所述试剂盒的提取样本为体液或细胞培养液。
在可选的实施方式中，所述体液选自尿液、血浆、血清、脑脊髓液、腹水、羊水和母乳中的任意一种。
本发明实施例提供的试剂盒可以适用于多种样品的外泌体提取，突破现有试剂盒适用样品的单一性限制，为使用带来了极大的便利性，本发明实施例提供的试剂盒更具有普适性。
第四方面，本发明实施例提供一种提取外泌体或从外泌体中提取核酸或蛋白的方法，其包括：使用前述实施方式任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂或前述实施方式任一项所述的试剂盒进行提取。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实验例1中的不同体积的A组样本的荧光扩增曲线，曲线1(1000μl)、曲线2(500μl)、曲线3(250μl)。
图2为实验例1中的不同体积的B组样本的荧光扩增曲线，曲线1(1000μl)、曲线2(250μl)、曲线3(500μl)。
图3为实验例1中的不同体积的C组样本的荧光扩增曲线，曲线1(1000μl)、曲线2(500μl)、曲线3(250μl)。
图4为实验例3中的C1-C4样本的Western Blot检测结果。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供了一种提取外泌体的试剂组，其包括如下组分共沉淀剂和保存液A；
其中，共沉淀剂含有：50％(w/v)PEG8000(每100ml共沉淀剂含有50g PEG8000)、0.5mol/L NaCl和2.75％(w/v)葡萄糖(每100ml共沉淀剂含有2.75g葡萄糖)，溶剂为PBS，pH为7.2。
保存液A含有：0.02g/L硫酸多粘菌素B、0.2g/L硫酸庆大霉素、0.05mol/L Tris-HCl、20mol/L EDTA和28mol/L蔗糖，溶剂为PBS，pH为7.2。
共沉淀剂的配制方法如下：
配制氯化钠浓度为0.5mol/L的PBS缓冲液(pH7.2)，准确称取50g PEG8000固体和2.75g葡萄糖溶解于100ml PBS缓冲液中，制成共沉淀剂，121℃高压灭菌30分钟，待充分混匀后，0.22μm微孔滤膜过滤分装，4℃保存。
保存液A的配制方法如下：
取50毫升0.1mol/L Tris溶液与30毫升0.1mol/L HCl溶液于一个洁净的200mL烧杯中混匀后，加入去离子水稀释至100毫升，得到稀释后溶液，并添加EDTA、蔗糖、硫酸多粘菌素(B)和硫酸庆大霉素，分别达到浓度20mol/L、28mol/L、0.02g/L、0.2g/L，得到饱和溶液，然后将所述饱和溶液调节至pH为7.0-7.2，配制成保存液A。
实施例2
本实施例提供了一种外泌体及其核酸和蛋白共提取的试剂盒，其包括实施例1的提取外泌体的试剂组，以及核酸提取试剂组和蛋白提取试剂组；
各试剂组的组分及其配比见下表1所示。
表1
Figure BDA0002308379600000091
Figure BDA0002308379600000101
注：RNA提取试剂组的相关试剂配置所用试剂容器均作DEPC处理，或购买使用RNase Free相关耗材。
表1中各试剂的配制方法如下：
部分试剂的母液配置：
1M Tris溶液的配置
取Tris 242.2g，加ddH2O至1600mL，加热溶解。
1M Tris-HCl pH＝8.0溶液的配置：
取1M Tris溶液160ml用分析纯盐酸调至pH＝8.0(需浓盐酸约8.5ml)，加ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。
0.5M EDTA溶液的配置：
称取EDTA-Na2 37.2g先用140ml ddH2O溶解，加入14ml NaOH(10M)使EDTA-Na2溶解，再用NaOH(10M)溶液调至pH＝8.0，加入ddH2O定容至200ml，高压灭菌备用。
10％SDS溶液的配置：
在900ml双蒸水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调节溶液的pH值至7.2，加双蒸定容至1L，分装备用。
裂解液：分别量取1M Tris-HCl 4.3ml，0.5M EDTA-Na2溶液2.6ml，称取盐酸胍38.21g混匀，加入蒸馏水定容至100ml。
抽提液A：量取10mL的10％SDS溶液和500μL的100％Triton-100溶液于烧杯中混匀，加入蒸馏水定容至100ml。
洗脱液A：称取23.64g异硫酸氰胍和1.76g柠檬酸钠置于100ml烧杯中，加入约30ml的1M Tris-HCl，30ml无水乙醇，充分搅拌溶解，将溶液定容至100ml。
洗脱液B：量取0.2ml的1M Tris-HCl，称取1.17g NaCl于烧杯中，加入85ml 95％乙醇，混匀后，用蒸馏水定容至100ml。
保存液B：取1ml DEPC(焦碳酸二乙酯)溶于1L纯净水中。注意在溶解时，DEPC不会很快溶解，开始时以小球的形式存在于溶液中，因此要在搅拌器中搅动直到小球消失为止。
抽提液B：在1×PBS溶液中加入1％NP-40、1mol/L吐温-20和0.5％sodiumdeoxycholate(脱氧胆酸钠)，并在临用前加入PMSF异丙醇溶液(用量为10μl/ml)和Aprotinin(Sigma产品，用量为30μl/ml)。
保存液C：取100％甘油与PBS缓冲液1:1稀释，并在其中加入0.05％山梨酸钾和0.1％叠氮钠搅拌混匀，经0.45μm微孔滤膜过滤后分装。
实施例3
本实施例提供了采用实施例2的试剂盒提取外泌体及其RNA和蛋白的方法，具体如下：
步骤S1：外泌体的提取
1、收集体液样品并保存于冰上待用。处理冻藏样品时，25℃水浴解冻后保存于冰上待用。
2、2000×g离心去除细胞和细胞残片，根据样品的不同，离心温度和时间参照下表2进行。
表2
Figure BDA0002308379600000111
Figure BDA0002308379600000121
3、转移上清液至新的离心管中，4℃，10000×g离心20分钟去除细胞和细胞残片。
4、转移上清液至新的离心管中。
5、按下表3加入适量的共沉淀剂，涡旋混匀，静置沉淀外泌体。
表3
体液类型 共沉淀剂用量 沉淀时间
尿液 等倍体积 室温，1小时
血浆 0.5倍体积+0.5倍体积PBS 室温，10分钟
血清 0.5倍体积 2-8℃，30分钟
细胞培养液(<3ml) 0.5倍体积 2-8℃，过夜
脑脊髓液 等倍体积 2-8℃，1小时
腹水 0.5倍体积 室温，30分钟
羊水 0.5倍体积 室温，30分钟
母乳 0.5倍体积 室温，30分钟
6、按下表4条件，10000×g离心收集外泌体。
表4
体液类型 离心时间 离心温度
尿液 1小时 4℃
血浆 5分钟 室温
血清 10分钟 室温
细胞培养液 1小时 4℃
脑脊髓液 1小时 2-8℃
腹水 10分钟 室温
羊水 10分钟 室温
母乳 10分钟 室温
7、小心吸弃上清液，把外泌体直接固体保存或溶解于保存液A中保存于-20℃或-80℃，或直接用于后续步骤以提取核酸和蛋白。
步骤S2：外泌体总RNA提取(注：所用试剂容器均作DEPC处理，或购买使用RNaseFree相关耗材。)
1、涡旋松散外泌体沉淀。加入400μl裂解液至沉淀物中，涡旋打散沉淀或用移液枪反复吹打。
2、加入200μl NF水和20μl蛋白酶K至重悬液中，55℃振荡温育15分钟让沉淀物完全溶解。
3、4℃，12000×g离心15分钟。
4、小心转移上清液至新的离心管中，加入2倍体积无水乙醇。涡旋10秒混匀，以下离心均在4℃进行。
5、把柱子装在2ml收集管中，转移一半体积的混合液至硅胶柱中，12000×g离心30秒。
6、收集滤液，并将硅胶柱装回收集管中，转移剩余混合液至硅胶柱中，12000×g离心30秒。
7、收集滤液，并将柱子装回收集管中，加入500μl抽提液A(已用乙醇稀释，乙醇体积含量为30％)至硅胶柱中，12000×g离心30秒。
8、倒弃滤液把硅胶柱装回收集管中，加入500μl洗脱液B(已用乙醇稀释，乙醇体积含量为30％)至硅胶柱中，12000×g离心30秒。
9、重复步骤8一次。
10、倒弃滤液把硅胶柱装回收集管中，12000×g离心空柱3分钟甩干硅胶柱的基质。
11、将硅胶柱转移至1.5ml离心管中，加入30μl保存液B至柱子的膜中央。室温静置2分钟，12000×g离心1分钟。
12、丢弃柱子，并将RNA样品标记保存于-80℃。
步骤S3：外泌体总蛋白提取
该步骤适合于从步骤S1或步骤S2的滤液中进一步纯化得到总蛋白质，用于后续分子实验分析，
1、取步骤S1的最终外泌体保存液或步骤S2的第6-7步的合并滤液至合适的离心管中；
2、测量滤液的体积，加入4倍体积冰冷的抽提液B中，涡旋混匀30秒，冰上放置30分钟沉淀蛋白质。
3、12000×g离心10分钟离心沉淀收集蛋白。
4、小心倒弃上清液，加入1ml无水乙醇，涡旋混匀。
5、12000×g离心3分钟，小心倒弃上清液。
6、短暂离心，彻底吸弃残留的乙醇，空气干燥5-10分钟。
7、根据下游应用，加入30-100μl保存液C，用移液枪吸打或涡旋打散蛋白沉淀。
8、95℃水浴5分钟溶解蛋白质。
9、室温静置让样品恢复至室温。12000×g离心3分钟去除不溶解的物质。
10、转移上清液至新的1.5ml离心管中，放置4℃或-20℃，或用于SDS-PAGE电泳，或定量检测等。
需要说明的是，步骤S1、步骤S2和步骤S3本领域技术人员根据提取需要选择进行的，如只需提取外泌体，进行步骤S1即可，如还需要提取总RNA，则可以在步骤S1基础进行步骤S2。
实验例1
本发明的试剂盒与市售产品外泌体提取试剂盒的提取效果对比
1)样品准备：取冻存混合尿液样本，37℃水浴解冻；4℃，3000g离心10分钟，取上清液，分别分装于9个离心管中，各10mL，依次编号A1-A9。
2)A1-A3号管中样本采用实施例2试剂盒提取，提取流程参照步骤S1的提取方法，所得提取产物于-20℃保存并标记。
3)A4-A6号管中样本按照美国System Biosciences公司的Exo Quick提取试剂盒的标准流程进行操作，所得产物于-20℃保存并标记。
4)A7-A9号管中样本按照美国Invitrogen公司的TEI提取试剂盒的标准流程进行操作，所得产物于-20℃保存并标记。
5)按照BCA试剂盒(北京天根生化科技有限公司)说明，将标准品稀释成A-I 9个浓度，分别取25μl标准品加入到96孔板；9种样本稀释后，同样取25μl样品加入到96孔板，每个样品设置三个复孔；各孔加入工作液200μL，37℃放置30分钟后测定蛋白浓度。
6)用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度值，并记录，以吸光度值为横坐标，对应蛋白标准品的浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并根据线性方程计算出样品蛋白浓度。检测结果如下表5所示。
表5
Figure BDA0002308379600000151
通过对上表5检测结果分析可知，采用本发明提取的尿液样本的外泌体浓度与采用美国System Biosciences公司的Exo Quick提取试剂盒提取的外泌体浓度基本一致，且均能比采用美国Invitrogen公司的TEI提取试剂盒提取得到的外泌体浓度高，因而说明采用本发明实施例2的试剂盒和方法能有效提取样本中的外泌体。
实验例2
本发明实施例试剂盒与市售组合产品对外泌体RNA提取效果的对比
(1)样品准备：取冻存混合血清样本，37℃水浴解冻；4℃，3000g离心10分钟，取上清液，分别分装于27个离心管中，其中250μL、500μL、1000μL各平行分装9管并分成A、B、C三组，其中每组包括250μL、500μL、1000μL样本各三支。
(2)A组样本用实施例2的试剂盒进行提取，其中提取样本外泌体的方法参照步骤S1，样本外泌体中的RNA提取参照步骤S2，所得提取产物于-20℃保存并标记。
(3)B组中样本按照美国System Biosciences公司的Exo Quick提取试剂盒并配合其公司的SeraMir Exosome RNA Amplification Kit试剂盒的标准流程进行操作，利用非酚类裂解液和快速吸收柱提取外泌体中RNA，所得产物于-20℃保存并标记。
(4)C组样本按照美国Invitrogen公司的TEI提取试剂盒并配合其公司的TotalExosome RNA and Protein Isolation Kit试剂盒的标准流程进行操作，利用酚抽提与滤筒结合提取的exo-RNA样本，所得产物于-20℃保存并标记。
(5)将步骤(2)-(4)获得的编号为B1-B9号miRNA样本逆转录成为cDNA。
(6)在荧光实时定量PCR仪上将miRNA和参照基因进行扩增检测；采用北京天恩泽基因科技有限公司miRNA Realtime qRT-PCR试剂盒，反应体系(20μl)如下：
Figure BDA0002308379600000172
血清外泌体样本采用miR-16作为内参。按预变性95℃，10min；变性95℃，15s；退火及延伸60℃，1min，于荧光定量PCR仪扩增40个循环后进行曲线分析。Ct值检测结果如下表6和图1-图3所示：
表6
Figure BDA0002308379600000171
如图1、2和3所示，对采用三种方法分别提取得到的外泌体样本(以复孔2为例)进行检测，检测结果中可明显看出样本量的改变，对使用本发明试剂盒提取的样本检测结果(图1)无明显影响，且检测曲线均明显直观，采用两种对比试剂盒提取的样本的检测结果(图2和3)与样本量的变化有明显的相关性，且随着样本量的减少，检测Ct值变大，曲线后移，对检测结果的判读有明显干扰。利用本发明实施例的试剂盒提取外泌体中RNA检测时，少量血清可达到1mL血清相同或相近的检测结果，这对解决临床血清样本资源有限这一问题有实际意义。
实验例3
本发明实施例的试剂盒与市售产品对外泌体蛋白提取效果的对比
外泌体可通过传递信息影响靶细胞的功能，激活细胞信号通路，在免疫、凝血、肿瘤等生理病理过程中发挥作用。而其中蛋白质的差异表达是区分不同来源外泌体的重要特点，是研究外泌体起源的重要途径。蛋白质组学已经逐渐成为研究各种亚细胞组分蛋白质组的重要工具。本实验例将通过对同一批外泌体样本采用不同的蛋白检测前处理方法后，于同一条件下进行蛋白免疫印迹试验分析，以比较本发明实施例的试剂盒与现有蛋白提取方法对外泌体蛋白的提取效果。
方法：
(1)细胞培养液的收集准备：人舌癌细胞(Tca-8113)置于RPMI1640培养基(包含90％的RPMI1640培养液，10％的胎牛血清(FBS)，1％的双抗)中，将细胞置于37℃、5％CO2饱和湿度的培养箱中进行培养。待细胞融合度达80％时，PBS洗涤3次，更换为无血清培养基继续培养，48小时候收集上清，离心(4℃，300g×10分钟)去除细胞，0.22μm滤膜过滤后分装冻存于-80℃。
(2)样品准备：取冻存细胞培养液样本，37℃水浴解冻；4℃，3000g离心10分钟，取上清液，采用本发明实施例2的试剂盒，并参照步骤S1进行外泌体提取，并将最终提取得到的外泌体等量分装4管，每管20μl，标记离心管编号C1-C4。
(3)C1号管中样本外泌体蛋白提取参照步骤S3的提取方法，所得提取产物于-20℃保存并标记；
C2号管中样本不作处理；
C3号管中样本外泌体仅经PBS重悬后加入等体积的裂解液(M-PER MammalianProtein Extract Regent(Thermo Scientific，#78501))；
C4号管中样本外泌体经PBS重悬后加入等体积的裂解液(M-PER MammalianProtein Extract Regent(Thermo Scientific，#78501))及适量蛋白酶抑制剂(Proteinase Inhibitor Cocktail Tablets(04693132001))。
(4)按体积比4:1加入5×蛋白上样缓冲液，混匀，置干式恒温器，100℃加热5分钟变性蛋白，冰上静置5分钟备用或存放于-20℃冰箱保存准备上样。
(5)配制分离胶和5％的浓缩胶后灌胶。将蛋白样品加入点样孔中，按浓缩胶80V、分离胶120V进行恒压电泳，至溴酚蓝刚出胶。按照300mA恒流转膜。将转好的膜于室温下脱色摇床上用5％的脱脂牛奶，封闭1小时，而后分别与CD63、CD9、TSG101及内参GADPH的一抗(SBI公司，美国)共孵育，4℃过夜。次日将膜与HRP标记的二抗(SBI公司，美国)室温下孵育60分钟。等体积混匀A和B两种试剂，均匀滴加到膜的蛋白面侧，保持1-2分钟，去尽残液，保鲜膜塑封，放入X-光片夹中曝光。根据不同的光强度调整曝光条件，显影、定影。观察并分析检测结果。
结果见图4，通过Western Blot检测不同方法处理的外泌体样本特异性标志蛋白CD63、CD9、TSG101表达情况，实验结果显示：4组样本均正常显示内参蛋白条带，C2组整体蛋白量最多，C1组其特异性标志蛋白表达显示基本与C2组强度一致，且C1组整体杂带比C2组少，无明显拖尾杂带产生；C3、C4组的TSG101表达量极低基本无法肉眼确认，且C3组整体特异性蛋白表达量最低。由此可见，采用本发明实施例试剂盒提取外泌体蛋白的效果较好，质量纯度较高。
实验例4本发明试剂盒中共沉淀试剂组分不同分子量的聚乙二醇和其浓度对提取效果的影响
(1)按如下表7中分子量和浓度配置出共沉淀剂：
表7
Figure BDA0002308379600000201
(2)样品准备：取冻存混合血清/血浆样本，37℃水浴解冻；4℃，3000g离心10分钟，取上清液，分别分装于30个离心管中，各2mL，分为10组，即每组三个平行。分别采用如下表中提取试剂进行外泌体提取，提取流程均参照步骤S1的提取方法，所得提取产物于-20℃保存并标记。
(3)通过颗粒粒度分析仪检测外泌体数量和大小分布：利用装有450nm激光器的Nanosight NS300颗粒粒度分析仪(NTA)检测外泌体样品，激光光束闯过样本室外泌体颗粒，从而经装有摄像头的显微镜实现颗粒可视化，捕捉外泌体布朗运动的视频文件，利用爱因斯坦方程式根据运动计算浓度和流体力学直径。结果见表8。
表8
Figure BDA0002308379600000211
利用Nanosight纳米粒度分析仪对上述9组不同试剂提取到的外泌体进行浓度和粒子分布范围的分析和比较(表7)。通过分析上述实验结果可知，采用本发明试剂盒及方法提取所得外泌体多分布于50-200nm之间。对外泌体浓度进行比较，当共沉淀剂中聚乙二醇的使用浓度相同时，采用PEG8000的实验组提取得到的外泌体浓度普遍较使用PEG7000和PEG9000提取得到的浓度高，且当使用的PEG8000浓度为50％时，提取得到的外泌体浓度最高，平均浓度约为1.02×1012个/ml(实验组5)；同理通过比较粒子直径的中位数的分布情况，使用50％的PEG8000提取得到的外泌体分布较均匀，整体均一性较好。另外通过对比实验组5和实验组10的实验结果可看出，实验组5相比分离得到的外泌体数量更多，且大小分布更均匀，说明共沉淀体系中加入葡萄糖可有效提高外泌体的提取效率，优化外泌体提取质量。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种提取外泌体的共沉淀剂，其特征在于，其含有如下组分：亲水聚合物、无机盐和葡萄糖。
2.根据权利要求1所述的共沉淀剂，其特征在于，在所述共沉淀剂中，所述亲水聚合物的含量为25％-75％，优选为40％-60％(w/v)；更优选为50％(w/v)；
优选地，所述亲水聚合物选自聚乙二醇、葡聚糖和聚乙烯基吡咯烷酮中的任意一种或几种的组合；
优选地，所述亲水聚合物为聚乙二醇；
优选地，所述亲水聚合物为聚乙二醇和葡聚糖的组合；
优选地，聚乙二醇的分子量为7000-9000；更优选为8000。
3.根据权利要求2所述的共沉淀剂，其特征在于，所述无机盐选自钠盐、钾盐和镁盐中的至少一种；
优选地，所述无机盐选自氯化钠、氯化钾、氯化镁、葡萄糖酸钠和醋酸钠中的至少一种；
优选地，所述无机盐为氯化钠；
优选地，在所述共沉淀剂中，氯化钠的浓度为0.4-0.6mol/L；
优选地，在所述共沉淀剂中，葡萄糖的含量为2％-3％(w/v)；
优选地，所述共沉淀剂的溶剂选自PBS或磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液；
优选地，所述共沉淀剂的pH为6.8-7.4。
4.一种提取外泌体的试剂组，其特征在于，其含有权利要求1-3任一项所述的共沉淀剂和用于保存外泌体的保存液A；
优选地，所述保存液A含有如下组分：硫酸多粘菌素B、硫酸庆大霉素、Tris-HCl、EDTA和蔗糖；
优选地，在所述保存液A中，硫酸多粘菌素B的含量为0.02-0.04g/L；
优选地，在所述保存液A中，酸庆大霉素的含量为0.1-0.2g/L；
优选地，所述保存液A的溶剂选自PBS、Tris-HCl缓冲液或巴比妥钠-盐酸缓冲液；
优选地，所述保存液A的pH为7.0-7.2。
5.一种提取外泌体的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求1-3任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂或权利要求4所述的提取外泌体的试剂组。
6.一种外泌体及其核酸和蛋白共提取的试剂盒，其特征在于，其包括权利要求4所述的提取外泌体的试剂组，以及核酸提取试剂组和蛋白提取试剂组。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂组包括如下试剂中的至少一种：裂解液、抽提液A、洗脱液A、洗脱液B和保存液B；
优选地，所述裂解液含有：盐酸胍、EDTA-2Na和Tris-HCl；
优选地，所述裂解液含有：3-5mol/L盐酸胍、10-15mmol/L EDTA-2Na和40-45mmol/LTris-HCl；优选地，所述抽提液A含有：SDS和Triton-100；
优选地，所述抽提液A含有：0.01-0.02g/mL SDS和4-6μL/mL Triton-100；
优选地，所述洗脱液A含有乙醇、GuSCN和柠檬酸钠；
优选地，所述洗脱液A含有20％-40％乙醇、1-3M GuSCN和5-7mM柠檬酸钠；
优选地，所述洗脱液B含有乙醇、NaCl和Tris-HCl；
优选地，所述洗脱液B含有75％-85％乙醇、18-22mM NaCl和1-3mM Tris-HCl；
优选地，所述保存液B为含0.1％-0.2％DEPC的水溶液；
优选地，所述核酸提取试剂组还包括用于吸附核酸的吸附柱；
优选地，所述吸附柱的基质为玻璃纤维滤膜；
优选地，所述吸附柱为硅胶柱；
优选地，所述核酸提取试剂组所提取的核酸为RNA。
8.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述蛋白提取试剂组包括如下试剂中的至少一种：抽提液B和保存液C；
优选地，所述抽提液B含有：吐温-20、NP-40、sodiumdeoxycholate、PMSF和Aprotinin，溶剂为PBS；
优选地，所述抽提液B含有：1-3ml/L吐温-20、1％-2％NP-40、0.4％-0.6％sodiumdeoxycholate、8-12μl/ml PMSF和25-35μl/mlAprotinin；
优选地，所述保存液C含有：叠氮钠、山梨酸钾和甘油；
优选地，所述保存液C含有：0.1％-0.2％叠氮钠、0.04％-0.06％山梨酸钾和4％-6％甘油。
9.根据权利要求6-8任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的提取样本为体液或细胞培养液；
优选地，所述体液选自尿液、血浆、血清、脑脊髓液、腹水、羊水和母乳中的任意一种。
10.一种提取外泌体或从外泌体中提取核酸或蛋白的方法，其特征在于，其包括：使用权利要求1-3任一项所述的提取外泌体的共沉淀剂、权利要求4所述的试剂组或权利要求5-9任一项所述的试剂盒进行提取。
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