CN113588810B - 一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，包括以下步骤：(1)基质样品前处理；(2)蛋白质提取和纯化；(3)蛋白水解和(4)肽段样品纯化，最终酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品，在蛋白质提取和纯化步骤中，同时沉淀水相和有机相中蛋白含量，减少亲水性蛋白损失，本发明有效的解决了现有技术中亲水性的蛋白的损失，提高了蛋白质组样品中蛋白质丰富度；同时解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，提高了蛋白质鉴定的重现性。

Description

一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法
技术领域
本发明涉及一种制备宏蛋白质组样品的方法，尤其涉及一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，属于蛋白组学领域。
背景技术
随着近年来高分辨率质谱技术的飞速发展，蛋白质组学得以进步和广泛应用。一方面，相比于蛋白质印迹法和酶联免疫吸附法，蛋白质组学方法能够高通量地获得样品中成百上千种蛋白质的信息，而且能够应用于检测未知的蛋白物质。另一方面，相比基于DNA测序技术的基因组学和转录组学，基于高分辨率质谱技术的蛋白质组学更能直接反映特定条件下微生物群落的物种组成和功能特征。蛋白质组学涉及的步骤包括样品中总蛋白的提取和纯化，纯化蛋白的处理和酶解，超高效液相色谱和高分辨率质谱联用检测，蛋白质的搜库鉴定及后续生物信息学分析。
专利公开号为CN107167353B的申请公开了一种用于土壤宏蛋白组学研究的样品制备处理方法。该样品处理方法涉及到多步提取和纯化步骤如震荡破碎、超声、离心、冷丙酮沉淀和酶解等过程。另外，公开专利号为CN109810168A的申请公开了一种多级蛋白提取的方法用于提取土壤中的总蛋白。该方案涉及到分别用柠檬酸，十二烷基磺酸钠，柠檬酸蛋白提取液对土壤进行三次提取，然后利用Tris-饱和酚进行液液萃取富集蛋白质。
现有方法涉及的步骤繁杂，且未考虑并解决环境基质中微生物蛋白质样品制备的重复性差的问题，经过有机相即饱和苯酚萃取后，提取蛋白时所用水相被直接舍弃，大部分亲水性的蛋白可能因此损失，造成最后蛋白鉴定结果的与实际蛋白量的偏差。
发明内容
发明目的：本发明通过提供一种制备环境基质中微生物宏蛋白质组样品的方法，有效的解决了现有技术中亲水性的蛋白的损失，提高蛋白质组样品中蛋白质丰富度；同时解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，提高蛋白质鉴定的重现性。
技术方案：本发明所述的蛋白质组样品的方法，包括以下步骤：
(1)基质样品前处理：将基质样品在液氮中猝灭后，在液氮环境中加入研磨助剂研磨，得到粉末状基质样品，向所述粉末状基质样品中加入裂解液和提取液，并经过离心后，得到下层为有机相、上层为水相的分层混合液；
(2)蛋白质提取和纯化：分别吸出所述步骤(1)中所述有机相和所述水相，并在所述有机相和所述水相中分别加入蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂用以将所述有机相和所述水相中的蛋白质沉淀，沉淀后的有机相和水相经过离心后，分离出沉淀A和沉淀B；混合沉淀A和沉淀B得到沉淀C；
(3)蛋白水解：向所述步骤(2)中的所述沉淀C中加入蛋白溶解液进行蛋白溶解，经离心后，弃去沉淀，保留上清液，所述上清液中加入蛋白酶解液，得到酶解后的肽段样品；
(4)肽段样品纯化：所述步骤(3)中酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品。
进一步地，在所述步骤(1)前还包括器材预钝化处理步骤，将制备蛋白质组样品所用的器材置于预钝化处理水溶液中，浸泡6-12小时。
进一步地，所述预钝化处理水溶液，化学成分以物质量浓度计包括：吐温-20：0.02-0.10mol/L，月桂基硫酸铵：0.10-0.50mol/L，十二烷基磺酸钠：0.05-0.20mol/L，脱氧胆酸：10-30m mol/L。
所述器材具体指与所述基质样品直接接触的器材，包括离心管、枪头、药匙等；利用所述预钝化处理水溶液中表面活性剂的作用，来减少器材对基质样品中蛋白的吸附。
进一步地，所述步骤(2)中的所述蛋白沉淀剂为醋酸铵甲醇溶液。
进一步地，所述步骤(1)中，其中所述研磨助剂的加入质量为所述基质样品质量的10％-30％，所述研磨助剂为聚乙烯基聚吡咯烷酮粉末。
进一步地，所述裂解液为pH＝6.5-8.5的50-200m mol/L Tris和0.05-0.20mol/LSDS溶液；所述提取液为pH＝7.0-9.0的Tris饱和苯酚。
进一步地，所述步骤(2)中，在向所述有机相和所述水相中分别加入所述蛋白沉淀剂前，还包括有机相纯化过程，向所述有机相中加入等体积质谱级超纯水，经过慢速涡旋振荡和离心后，得到纯化后的有机相。
进一步地，所述步骤(3)中，所述蛋白溶解液的各组分浓度为：三乙基碳酸氢铵为0.1-0.5mol/L，二硫苏糖醇为8-12mol/L和尿素为5-8mol/L。
进一步地，所述步骤(3)中，所述蛋白酶解液包括蛋白酶解辅助液和蛋白酶解作用液。
进一步地，所述蛋白酶解辅助液为蛋白酶水解促进剂DCA。
DCA在蛋白酶解中起到了补偿了因环境基质和提取试剂中存在的干扰物质和蛋白变性剂对蛋白酶活的抑制作用。
蛋白酶水解促进剂DCA对蛋白酶水解具有促进作用，主要是由于蛋白酶对干扰物质的无效吸附将导致蛋白酶失活，DCA可以有效降低这种失活，促进蛋白酶与蛋白质的特异性结合；DCA加强了蛋白酶构型的严密性，进而提高对蛋白质的选择性；此外，DCA对疏水蛋白质具有促进溶解性和反应活性的作用，这也提高了其对蛋白酶水解的具有促进作用。
进一步地，蛋白酶解作用液包括二硫苏糖醇、碘乙酰胺、碳酸氢铵和胰蛋白酶，向所述步骤(3)上清液中加入蛋白酶解作用液的次序是：二硫苏糖醇、碘乙酰胺、碳酸氢铵、胰蛋白酶，或者所述碳酸氢铵和所述胰蛋白酶也可以同时加入。
有益效果：本发明与现有技术相比，其显著技术效果是：
1、有效解决了现有技术蛋白质提取和纯化阶段中亲水性的蛋白的损失，进而提高了蛋白质组样品中蛋白质丰富度。
2、极大地减少了因非特异性吸附导致的蛋白样品随机性损失。经试验测定，相比未处理过的介质，预钝化的介质能够提升约50％的蛋白回收量，极大地减少了导致重复性变差的蛋白质非特异性吸附。
3、显著提高了蛋白酶水解效率，减少了因肽段水解不充分导致的随机偏差。相比参考方法，最终鉴定到的独特蛋白质的数量提升了2-3倍。
4、解决了目前宏蛋白质组学研究环境微生物样品重复性差导致的蛋白定性定量出现较大偏差的问题，蛋白质鉴定的重现性达到90％以上，且能获得高度一致的蛋白定量结果，线性回归R2值为0.95-0.99，p值远小于0.001。
附图说明
图1是实施例1的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE检测)条带图；
图2是实施例1的蛋白鉴定和定量结果图；
图3是实施例4中实验组与对比组的蛋白质鉴定可重复性和数量对比图；
图4是实施例5中实验组与对比组的蛋白质鉴定可重复性和数量对比图。
具体实施方式
下文将结合实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例所用活性污泥样品采自四座不同污水处理厂好氧池，每座污水处理厂分别取三组样品。
1、蛋白质组样品的制备
准备工作，器材预钝化处理：将制备蛋白质组样品所用的离心管、枪头和药匙等器材置于预钝化处理水溶液中，浸泡6小时，浸泡结束后用质谱级超纯水充分浸润并冲洗三次备用；预钝化处理水溶液的配方，化学成分以物质量浓度计包括：有吐温-20((TWEEN-20，T20))：0.04mol/L，月桂基硫酸铵(ammonium lauryl sulfate，ALS)：0.27mol/L，十二烷基磺酸钠(sodium dodecyl sulfate，SDS)：0.07mol/L，脱氧胆酸(deoxycholic acid，DCA)：12m mol/L。
(1)基质样品前处理：取活性污泥样品湿重1g，置于离心管中，将离心管固定在漏勺上并放置于随采样车运载的液氮罐中猝灭，样品保持在液氮的低温下直至返回实验室进行下一步骤，将活性污泥样品转移至玛瑙研钵内，加入0.1g聚乙烯基聚吡咯烷酮(polyvinylpolypyrrolidone，PVPP)，研磨样品至粉末状，研磨过程样品全程浸没在液氮内；研磨后的样品粉末快速转移至离心管中，加入裂解液和提取液，于涡旋振荡30s，后转移到细胞破碎仪中进行超声，细胞破碎仪中需置于冰水浴中，超声条件为：150W的能量3s间隔的周期对每个样品超声2分钟；超声结束后，样品溶液保持冰水浴，并在在摇床内以150rpm振摇1小时，重复上述涡旋振荡和超声步骤后离心20分钟，离心条件为“4℃，14000g”，离心结束后得到下层为苯酚相相、上层为水相的分层混合液。
(2)蛋白质提取和纯化：吸取步骤(1)下层苯酚相和上层水相，分别置于两个离心管中，加入等体积质谱级超纯水，慢速涡旋振荡5分钟后，离心20分钟，离心条件为“4℃，14000g”，得纯化的苯酚相并移入离心管，向离心管中加入4mL的0.1M醋酸铵甲醇溶液，放置于-20℃下静置过夜，离心20分钟离心条件为“4℃，14000g”分别得到沉淀A和沉淀B；沉淀A和沉淀B中分别加入1mL预冷的100％质谱级甲醇，并用移液枪吹打沉淀使其重新悬浮。合并A和B沉淀后离心20分钟，离心条件为“4℃，14000g”，得到沉淀C，弃去上清液；向沉淀C中加入预冷的100％质谱级丙酮，并用移液枪吹打沉淀离心20分钟，离心条件为“4℃，14000g”，弃去上清液；向所得沉淀中加入预冷的80％质谱级丙酮，并用移液枪吹打沉淀离心20分钟，离心条件为“4℃，14000g”，弃去上清液，待沉淀在室温下干燥。
(3)蛋白水解：向干燥后的沉淀中加入1mL蛋白溶解液；蛋白溶解液的配方为：含有0.2M的三乙基碳酸氢铵(triethylammonium bicarbonate，TEAB)，10mM的二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)和6M尿素的溶液，涡旋振荡30s，静置过夜；18000g离心3分钟得上清液并转移至离心管中，并加入2mL 0.1M TEAB溶液稀释。
测定此步骤中的上清液的蛋白含量，采用Bradford法进行定量。完整性和纯度则通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE检测)进行鉴定，结果见图1。
在所述上清液中加入30μl的1M DTT，放入50℃反应器反应1小时；加入120μL的1M碘乙酰胺(iodoacetamide，IAN)，室温避光反应1小时；加入3mg DCA，11.9mg的碳酸氢铵(ammonium bicarbonate，ABC)和10μL的浓度为750mg/L的胰蛋白酶(trypsin)溶液，于37℃反应过夜；最后加入10μL质谱级甲酸(formic acid)。得到酶解后的肽段样品。
(4)肽段样品纯化：用0.1％质谱级甲酸稀释肽段样品一倍。依次用10mL的甲醇和0.1％甲酸活化N-乙烯吡咯烷酮(NVP)-二乙烯苯(DVB)固相萃取小柱。加入肽段样品，控制流速为0.5-2mL/min，用10mL的0.1％质谱级甲酸清洗，然后在约13mm汞柱压力下抽真空以干燥柱子，放置离心管，用5mL的80％乙腈洗脱并收集，放入真空旋转冻干机使脱盐后的肽段样品完全干燥，得到纯化的固态蛋白质组样品。
2、蛋白质组样品的质谱测定：
(1)固态蛋白质组样品的使用方法：在复溶的肽段样品中加入200μL的pH＝10,20mM质谱级甲酸铵溶液，样品使用量为2μg肽段样品。
(2)质谱测定仪器选择：EASY-nLC 1200UHPLC液相色谱和Q-Exactive HF-X质谱联用仪检测；液相色谱所用预柱填料为ReproSil-Pur C18-AQ颗，粒径3μm，填充柱长2cm；分析柱填料为ReproSilPur C18-AQ颗粒，粒径1.9μm，填充柱长15cm；流动相A：0.1％甲酸水溶液，流动相B：0.1％甲酸的80％乙腈。
(3)质谱测定仪器操作条件设定：梯度设定为：5-10％B，2min；10-30％B，49min；30-50％B，2min；50-90％B，2min；90-100％B，5min；质谱设定参数：正离子模式，喷雾电压2.3kV，离子传输管温度320℃，全扫描的数据获取模式，扫描范围：350-1500m/z，分辨率为60000；选择前40个信号最大的母离子进入二级质谱，碎裂方式为高能碰撞解离(HCD)，碰撞能量为28％，总采集时间为1小时。
(4)定性定量测定：测定对象为肽段和蛋白质，采用开源软件MetaProteomeAnalyzer和Prophane；开源软件所使用的参数设定如下：母离子质量差设为10ppm，子离子的质量差设为0.02Da，数据库选择所采集的活性污泥DNA测序组装后预测的氨基酸序列集合，脲甲基化设为固定修饰，N末端的乙酰化设为可变修饰；蛋白质理论酶解漏切至多2个，蛋白质的鉴定需要至少一个独特的肽段在发现错误率(FDR)小于0.01的水平上被检测到，且其自身也需通过FDR小于0.01的阈值，蛋白定量信号强度积分使用非标记定量方法。测量结果见图2。
3、测定结果分析
图1为实施例1的聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE检测)条带图；图2为实施例1的蛋白鉴定和定量结果在不同生物学重复间的对比。
根据图1蛋白质电泳图可以得到以下分析结果：
(1)蛋白提取纯化效果好，从图1可以看出所有样品的蛋白条带大小分布均匀，条带清晰无弥散，蛋白质的分子量大小上没有选择偏差，说明测定结果准确，实施例1所用的制备方法对不同污水厂的活性污泥样品都有很好的提取和纯化效果；
(2)误差小且可重复性高，各生物学平行样的电泳条带大小高度一致，说明制备蛋白所用的方法可重复性高。此外，定性定量测定中，在四座污水处理厂活性污泥样品中分别检测到8271、7923、6990和7756个蛋白种类，这些蛋白在各自平行样中的检出率均超过90％。此外，如图2所示，用非标定量法进行定量后，不同污水厂活性污泥平行样间蛋白含量的相对丰度的线性回归R2值为0.95-0.99，p值远小于0.001，说明各平行样间测定结果误差小，即可重复性高。
实施例2
本实施例所用的样品与实施例1相同，主要在蛋白质样品制备中采用不同浓度或量的作用液。
1、蛋白质组样品的制备
蛋白质组样品的制备中主要差别如下：
器材预钝化处理步骤中，器材预钝化浸泡6小时，预钝化处理水溶液的配方为，化学成分以物质量浓度计包括：吐温-20：0.02mol/L，月桂基硫酸铵：0.10mol/L，十二烷基磺酸钠：0.05mol/L，脱氧胆酸：10m mol/L；
基质样品前处理中，研磨助剂的加入质量为所述基质样品质量的30％；裂解液选择pH＝6.5的50m mol/L Tris和0.05mol/L SDS溶液；所述提取液为pH＝7.0的Tris饱和苯酚；
蛋白质提取和纯化：蛋白溶解液的各组分浓度为：三乙基碳酸氢铵为0.1mol/L，二硫苏糖醇为8mol/L和尿素为5mol/L。
其他步骤和使用试剂、剂量等都与实施例1相同。
2、蛋白质组样品的质谱测定与结果
与实施例1相同的测定方法，结果显示，实施例2中的结果接近实施例1中结果。说明采用实施例2中的制备方法，取得的技术效果也较好。
实施例3
本实施例所用的样品与实施例1相同，主要在蛋白质样品制备中采用不同浓度或/和质量的试剂。
1、蛋白质组样品的制备
蛋白质组样品的制备中主要差别如下：
器材预钝化处理步骤中，器材预钝化浸泡12小时，预钝化处理水溶液的配方为，化学成分以物质量浓度计包括：吐温-20：0.10mol/L，月桂基硫酸铵：0.50mol/L，十二烷基磺酸钠：0.20mol/L，脱氧胆酸：30m mol/L；
基质样品前处理中，研磨助剂的加入质量为所述基质样品质量的10％；裂解液选择pH＝8.5的200m mol/L Tris和0.20mol/L SDS溶液；所述提取液为pH＝9.0的Tris饱和苯酚；
蛋白质提取和纯化：蛋白溶解液的各组分浓度为：三乙基碳酸氢铵为0.5mol/L，二硫苏糖醇为12mol/L和尿素为8mol/L。
其他步骤和使用试剂剂量等都与实施例1相同。
2、蛋白质组样品的质谱测定与结果
与实施例1相同的测定方法，结果显示，实施例3中的结果接近实施例1中结果。说明采用实施例3中的制备方法，取得的技术效果也较好。
实施例4
本实施例的基质样品为某大型污水处理厂二沉池壁上生长的生物膜中微生物，同时设置一组实验组和三组对比组。
1、蛋白质组样品的制备
实验组：蛋白样品制备方法和实施例1步骤相同；
对比组1：省略实施例1中器材预钝化处理步骤，只对器材做常规的灭菌处理，其他步骤、试剂和试剂用量等与实施例1一致；
对比组2：省略蛋白质提取和纯化步骤中对水相的蛋白质沉淀，即不采集沉淀B，其他步骤、试剂和试剂用量等与实施例1一致；
对比组3：在蛋白水解步骤中不加DCA，其他步骤、试剂和试剂用量等与实施例1一致。
2、蛋白质组样品的质谱测定
实验组和对比组的质谱测定方法相同。质谱测定方法为：开源软件MetaProteomeAnalyzer和Prophane中需采用该生物膜样品DNA测序组装后预测的氨基酸序列，其余的测定方法同实施例1。
3、测定结果分析
如图3所示，实验组与各对比组相比，在蛋白鉴定重复数和蛋白鉴定数目都有明显的优异性，具体来说：
(1)与对比组1相比，实验组中对器材进行预钝化处理，使得鉴定的蛋白质数目增加了3289个，说明对器材的预钝化处理减少了样品的随机损失，提升了蛋白丰富度，并使蛋白鉴定结果的可重复性提升了43.9％；
(2)与对比组2相比，实验组中采集水相中蛋白质，回收了大量亲水性蛋白，使得鉴定的蛋白质数目增加了816个，提升了蛋白丰富度，并使蛋白鉴定结果的可重复性提升了26.7％；
(3)与对比组3相比，实验组中蛋白水解步骤加入了DCA，显著提升了蛋白酶水解效率，使得鉴定的蛋白质数目增加了约2536个，提升了蛋白丰富度，并使蛋白鉴定结果的可重复性提升了约33.8％。
实施例5
本实施例是基质样品为某受重金属污染的土壤中微生物蛋白质样品，同时设置一组实验组和两组对比组，且每组均设置3个平行样，两组对比组分别采用背景技术中所述的已公开的土壤中蛋白提取方法。
1、蛋白质组样品的制备
实验组：蛋白样品制备方法和实施例1步骤相同。
对比组1：
(1)取液氮冷冻的土壤样品湿重1g，置于至玛瑙研钵内，并加入0.1g PVPP，研磨样品至粉末状后移入离心管。加入2mL裂解液，使用移液枪吹打，使其混匀，随后95℃水浴30min，涡旋5分钟。其中，裂解液的配方为：70mM溴化四乙铵(tetraethyl-ammoniumbromide)、0.5％二乙基二硫代氨基甲酸钠(SDC)、10mM三(2-羧乙基)膦(Tris(2-carboxyethyl)phosphine，TCEP)、30mM二氯乙酰胺(2-chloroacetamide)、0.5％SDS，1M尿素，pH值调至8.0。
(2)将6颗经过清洗和400℃烘烤后直径为3mm的钢珠加入步骤1中得到的悬混液中，低温下震荡破碎，震荡频率为90Hz，时间为60s。
(3)将用钢珠破碎后的样品在冰上进行超声，进一步破碎，促使蛋白质充分溶出，超声功率为100W，超声30s，关闭30s，超声破碎时间为5分钟。然后采用低温离心机控制温度4℃，控制转速14000g，离心20分钟，收集上清液。
(4)向得到的上清液中，加入3倍体积的冷丙酮，在-20℃下静置过夜，高速离心，温度4℃，控制转速14000g，离心20分钟，弃掉溶液，用-20℃丙酮洗2次，然后加入50μL裂解缓冲液重新溶解蛋白质。
(5)用Bradford法对所得蛋白溶液进行定量。
(6)加入胰蛋白酶，在37℃下放置过夜，得到蛋白质酶解多肽溶液。
(7)向多肽溶液中加入15μL二甲亚砜，涡旋5分钟，然后加入250μL乙酸乙酯、环己烷和甲酸体积比为5:1:0.01的溶液，涡旋混匀，控制温度为10℃，转速为1000rpm，离心5分钟，然后静置10分钟，在不扰动任何沉淀和中间相的情况下，将约90％的下层相(含肽段)转移到新的离心管中。再加入250μL乙酸乙酯和环己烷体积比为6：1的分离剂，涡旋混匀后，采用低温离心机控制温度10℃，控制转速1000rpm，离心5分钟，取下层，合并两次所得肽段溶液。
(8)后续固相萃取、上机检测和数据分析步骤保持与实施例组完全一致。
对比组2：
(1)将用液氮冷冻的土壤样品转移至玛瑙研钵内，加入0.1g PVPP，研磨样品至粉末状后转移入离心管。
(2)加入4mL的0.25M柠檬酸钠-蛋白提取液(pH＝8)，室温下漩涡振荡60s，置于液氮中3分钟，90℃水浴3分钟，室温下漩涡振荡30分钟，4℃下14000g离心20分钟，保留沉淀A，取上清过0.45μm滤膜，收集滤液A。
(3)沉淀A中加入4mL的含1.25％的SDS，0.1M的Tris-HCl，20mM的DDT的蛋白提取液(pH＝6.8)，室温下漩涡振荡30分钟，4℃下14000g离心20分钟，保留沉淀B，取上清过0.45μm滤膜，收集滤液B。
(4)沉淀B加入4mL柠檬酸-蛋白提取液和4mL的含1.25％的SDS，0.1M的Tris-HCl，20mM的DDT的蛋白提取液(pH＝6.8)，室温下漩涡振荡60分钟，4℃下14000g离心20分钟，取上清过0.45μm的滤膜，收集滤液C。
(5)合并滤液A、滤液B和滤液C，加入0.2倍体积的Tris饱和苯酚(pH＝8)，室温下漩涡振荡10分钟，其间每隔5分钟，冰上静置5分钟，4℃下14000g离心20分钟，取苯酚层溶液于新的离心管中，加入4倍体积的0.1M的乙酸铵甲醇溶液，置于-20℃沉淀过夜，4℃下14000g离心30分钟，用8mL预冷的甲醇溶液洗涤沉淀并一共重复三次；用8mL预冷的丙酮溶液洗涤沉淀并一共重复三次。经过样品酶解后获得蛋白组样品。
2、蛋白质组样品的质谱测定
实验组和对比组的质谱测定方法相同。质谱测定方法为：开源软件MetaProteomeAnalyzer和Prophane中需采用该土壤样品DNA测序组装后预测的氨基酸序列，其余的测定方法同实施例1。
3、测定结果分析
如图4所示，实验组与各对比组相比，在蛋白鉴定重复数和蛋白鉴定数目都有明显的优异性，具体来说：
(1)对比组1鉴定到的蛋白数目为4275个，平行样本中鉴定到蛋白的可重复性为58％；对比组2鉴定到的蛋白数目为2893个，平行样本中鉴定到蛋白的可重复性为47％；
(2)实验组鉴定到的蛋白数目是9082个，相比对比组1提高了2.1倍，比对比组2提高了3.1倍，且平行样本中鉴定到蛋白的可重复性高达92％。
(3)由此可见，与对比组相比，实施例4中使用本发明的技术方案，获得更高可重复性的蛋白鉴定结果，同时显著增加了蛋白质数目。

Claims (8)

1.一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）基质样品前处理：器材预钝化处理步骤，将制备蛋白质组样品所用的器材置于预钝化处理水溶液中，浸泡6 -12小时，所述预钝化处理水溶液，化学成分以物质量浓度计包括：吐温-20：0.02-0.10 mol/L，月桂基硫酸铵：0.10-0.50 mol/L，十二烷基磺酸钠：0.05-0.20mol/L，脱氧胆酸：10-30 m mol/L；将基质样品在液氮中猝灭后，在液氮环境中加入研磨助剂研磨，得到粉末状基质样品，向所述粉末状基质样品中加入裂解液和提取液，并经过离心后，得到下层为有机相、上层为水相的分层混合液；（2）蛋白质提取和纯化：分别吸出所述步骤（1）中所述有机相和所述水相，并在所述有机相和所述水相中分别加入蛋白沉淀剂，所述蛋白沉淀剂用以将所述有机相和所述水相中的蛋白质沉淀，沉淀后的有机相和水相经过离心后，分离出沉淀A和沉淀B；混合沉淀A和沉淀B得到沉淀C；在向所述有机相和所述水相中分别加入所述蛋白沉淀剂前，还包括有机相纯化过程，向所述有机相中加入等体积质谱级超纯水，经过慢速涡旋振荡和离心后，得到纯化后的有机相；（3）蛋白水解：向所述步骤（2）中的所述沉淀C中加入蛋白溶解液进行蛋白溶解，经离心后，弃去沉淀，保留上清液，所述上清液中加入蛋白酶解液，得到酶解后的肽段样品；（4）肽段样品纯化：所述步骤（3）中酶解后的肽段样品经过纯化和冻干后，得到蛋白样品。
2.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中的所述蛋白沉淀剂为醋酸铵甲醇溶液。
3.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，其中所述研磨助剂的加入质量为所述基质样品质量的10%-30%，所述研磨助剂为聚乙烯基聚吡咯烷酮粉末。
4.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，所述裂解液为pH=6.5-8.5的50-200 m mol/L Tris和0.05-0.20mol/L SDS溶液；所述提取液为pH=7.0-9.0的Tris饱和苯酚。
5.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述蛋白溶解液的各组分浓度为：三乙基碳酸氢铵为0.1-0.5 mol/L，二硫苏糖醇为8-12 mol/L和尿素为5-8 mol/L。
6.根据权利要求1所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）中，所述蛋白酶解液包括蛋白酶解辅助液和蛋白酶解作用液。
7.根据权利要求6所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，所述蛋白酶解辅助液为蛋白酶水解促进剂DCA。
8.根据权利要求6所述的一种环境基质中微生物宏蛋白质组样品的制备方法，其特征在于，蛋白酶解作用液包括二硫苏糖醇、碘乙酰胺、碳酸氢铵和胰蛋白酶，向所述步骤（3）上清液中加入蛋白酶解作用液的次序是：二硫苏糖醇、碘乙酰胺、碳酸氢铵、胰蛋白酶，或者所述碳酸氢铵和所述胰蛋白酶同时加入。
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