CN104387442A - 一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒及方法。本发明的快速提取土壤微生物蛋白质的方法是先利用氢氧化铝来去除土壤中的腐殖质，然后用玻璃珠和SDS来破碎土壤微生物细胞，使土壤微生物蛋白质游离出来，接着用苯酚将蛋白质从溶液中抽提出来，利用甲醇-醋酸铵溶液沉淀土壤微生物蛋白质，采用丙酮溶液洗掉杂质，获得土壤微生物蛋白质。本发明方法所用时间短，步骤少，减少了土壤微生物蛋白质的流失，且更加地方便、快捷。

Description

一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒及方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒及方法。

背景技术

土壤微生物是生活在土壤中的细菌、真菌、放线菌、藻类的总称。其种类和数量随成土环境及其土层深度的不同而变化。土壤是人类社会赖以生存和发展的重要物质基础。土壤是一个复杂的动态系统，土壤中时刻发生着物理化学生物组分的相互作用。微生物在土壤物质的降解转运以及元素循环(碳元素氮元素磷元素等)中发挥重要的作用。然而，传统的研究主要是以核酸基础上微生物群落结构多样性分析，直至最近几年才掀起对土壤微生物群落结构和生态功能耦合关系的研究热潮。蛋白质是生理功能的执行者和生命活动的直接体现者，对微生物群落结构和功能的研究归根到底就是要对微生物的蛋白质进行研究。

每克土壤中大约有100亿个细菌，因此土壤蛋白质的种类远多于微生物数量。土壤宏蛋白质组学是鉴定与微生物生理生化活动相关的蛋白质，通过对差异蛋白质进行鉴定，可以甄选出与微生物生理活动密切相关的基因，进而阐明微生物的基因组功能。

然而，土壤蛋白质组学发展的主要瓶颈是土壤蛋白质的有效提取方法，土壤蛋白质的成功提取是蛋白序列分析的基础和关键，土壤蛋白质易与腐殖质及其他化合物结合在一起，如何将蛋白质与这些腐殖质分离成为蛋白质提取方法的主要障碍。

现有技术人员主要是通过柠檬酸钠提取液洗去杂质，然而该方法所需要的时间非常长，而且长时间、多步骤操作容易造成土壤微生物的流失。因此，研制一种快速提取土壤微生物蛋白质的方法对于利用蛋白质组学阐明微生物群落结构和土壤生态功能之间的关系具有重大的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是：提供一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒及方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：提供一种快速提取土壤微生物蛋白质的方法，包括如下步骤：

土壤样品的前处理：取0.1-1g的土壤于2ml的离心管中，加入50-200μl BufferA，300-900μl无菌水，300-600μl Buffer B，涡旋震荡30-60s，加入50-200μl BufferC，100-300μl Buffer D，涡旋震荡30-60s，8000-10000g离心1-5min，去上清得沉淀A；

所述Buffer A为pH为5-6的0.1-2M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al3⁺离子的溶液；

所述BufferC为包含2-6M的OH^-离子的溶液；

所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-1M的Tris-Cl缓冲液；

土壤微生物细胞破碎和蛋白提取：所述沉淀A加入300-900μl Buffer E，0.5-1g 0.1-1mm玻璃珠，涡旋震荡1-6min，4℃温度条件下10000-12000g离心1-5min，吸取上清液至新离心管，加入上清液1-2.5倍体积的Buffer F，-20℃温度条件下沉淀12-24h，10000-12000g离心20-50min，去上清后加入1ml BufferG洗涤，10000-13000g离心10-20min，去上清后加入1-2ml Buffer G洗涤，吸干上清，加入30-50uL Buffer H溶液，得蛋白质样品；

所述Buffer E为pH为7-8的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1-1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含10-15mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含4-8M尿素、1-3M硫脲、50-100mM二硫苏糖醇、重量百分数为2-6％的CHAPS和10-50mM三羟甲基氨基甲烷的溶液。

本发明的另一技术方案为提供一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、BufferF、Buffer G和Buffer H；

所述Buffer A为pH为5-6的0.1-2M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al3⁺离子的溶液；

所述Buffer C为包含2-6M的OH^-离子的溶液；

所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer E为pH为7-8的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1-1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含10-15mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含4-8M尿素、1-3M硫脲、50-100mM二硫苏糖醇和10-50mM三羟甲基氨基甲烷的溶液，所述Buffer H中CHAPS的重量百分数为2-6％。

本发明的有益效果在于：本发明的快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒及方法是先利用氢氧化铝来去除土壤中的腐殖质，然后用玻璃珠和SDS来破碎土壤微生物细胞，使土壤微生物蛋白质游离出来，接着用苯酚将蛋白质从溶液中抽提出来，利用甲醇-醋酸铵溶液沉淀土壤微生物蛋白质，采用丙酮溶液洗掉杂质，获得土壤微生物蛋白质。本方法与常规提取方法需要24h以上的提取时间相比，本方法可以在13小时左右即可快速获得土壤微生物蛋白质，所用时间短，步骤少，减少了土壤微生物蛋白质的流失，且更加地方便、快捷。

附图说明

图1为本发明具体实施方式中的土壤微生物蛋白质提取结果图；

其中泳道1为花生土壤微生物蛋白质；泳道2为水稻土壤微生物蛋白质；泳道3为玉米土壤微生物蛋白质。

具体实施方式

为详细说明本发明的技术内容、所实现目的及效果，以下结合实施方式并配合附图予以说明。

本发明最关键的构思在于：本发明是利用氢氧化铝来去除土壤中的腐殖质，极大地减少了提取土壤微生物蛋白质的操作时间，减少土壤微生物的流失，更加地方便、快捷的提取土壤微生物蛋白质。

实施例1

一种快速提取土壤微生物蛋白质的方法，具体步骤如下：

(1)原料：新鲜花生根际土壤，新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤。

(2)土壤样品的前处理：用天平分别称取不同的土壤样品0.5g于2ml的离心管中，每个样品5个重复。每根管中加入50-200μl Buffer A，300-900μl无菌水，300-600μl Buffer B，涡旋震荡30-60s，加入50-200μl Buffer C，100-300μl BufferD，涡旋震荡30-60s，8000-10000g离心1-5min，去上清。前处理主要是去除腐殖质等土壤杂质，防治杂质对下游实验的影响。前处理主要是去除腐殖质等土壤杂质，防治杂质对下游实验的影响。

(3)土壤微生物基因组DNA的提取和纯化(土壤微生物细胞破碎和蛋白提取：)：加入300-900μl Buffer E，0.5-1g 0.1-1mm玻璃珠，涡旋震荡1-6min，4℃10000-12000g离心1-5min。吸取上清至新离心管，加入1-2.5倍体积的Buffer F，-20℃沉淀12-24h，10000-12000g离心20-50min，去上清后加入1ml Buffer G洗涤，10000-13000g离心10-20min，去上清后加入1-2ml Buffer G洗涤，吸干上清，加入30-50uL Buffer H溶液，于SDS-PAGE胶检测成功。

由于土壤中本身就有土壤颗粒，加入0.5g 0.5mm玻璃珠，大小适合，可以更好地对土壤微生物的细胞进行破碎。

Buffer A溶液的配置：0.1-2M Tris-Cl(pH＝5-6)；

所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al3+离子的溶液；

所述BufferC为包含2-6M的OH^-离子的溶液；所述Buffer B可为Al₂(SO₄)₃与所述BufferC可为NaOH，他们反应生成氢氧化铝吸附杂质；直接加入氢氧化铝的话，因为氢氧化铝是固状胶体，其与土壤反映不充分。先加入Al₂(SO₄)₃溶液，并将其与土壤溶液混匀，再加入氢氧化钠溶液后与其反映，能更加充分地吸附土壤中的杂质；

Buffer D溶液的配置：0.1-1M Tris-Cl(pH＝7-9)；

Buffer E溶液的配置：Tris-HCl饱和酚(pH＝7-8)，其将土壤微生物蛋白质从溶液中抽提出来；

Buffer F溶液的配置：0.1-1M醋酸铵(配制溶液为甲醇)，0.1M醋酸铵即200mL甲醇中加入1.54g醋酸铵，其作用是沉淀蛋白质；

Buffer G溶液的配置：丙酮(内含10-15mM二硫苏糖醇)，其作用为洗去其他杂质；

Buffer H溶液的配置：4-8M尿素(Urea)、1-3M硫脲(thiourea)、50-100mM二硫苏糖醇(DTT)、2-6％CHAPS、10-50mM三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)，其作用为溶解蛋白质的溶液。

一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、Buffer G和BufferH。

实施例2

一种快速提取土壤微生物蛋白质的方法，具体步骤如下：

(1)原料：新鲜花生根际土壤，新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤。

(2)土壤样品的前处理：用天平分别称取不同的土壤样品0.5g于2ml的离心管中，每个样品5个重复。每根管中加入50μl Buffer A，300μl无菌水，300μlBuffer B，涡旋震荡30s，加入50μl Buffer C，100μl Buffer D，涡旋震荡30，8000g离心1min，去上清。

(3)土壤微生物基因组DNA的提取和纯化(土壤微生物细胞破碎和蛋白提取)：加入300μl Buffer E，0.5g 0.1mm玻璃珠，涡旋震荡1min，4℃10000-12000g离心1min。吸取上清至新离心管，加入1倍体积的Buffer F，-20℃沉淀12h，10000g离心20min，去上清后加入1ml Buffer G洗涤，10000g离心10min，去上清后加入1ml Buffer G洗涤，吸干上清，加入30uL Buffer H溶液，于SDS-PAGE胶检测成功。

由于土壤中本身就有土壤颗粒，加入0.5g的0.5mm玻璃珠，大小适合，可以更好地对土壤微生物的细胞进行破碎。

Buffer A溶液的配置：0.1M Tris-Cl(pH＝5)；

Buffer B溶液的配置：0.1M Al₂(SO₄)₃；

Buffer C溶液的配置：2M NaOH；所述Al₂(SO₄)₃与NaOH反应生成氢氧化铝吸附杂质；

Buffer D溶液的配置：0.1M Tris-Cl(pH＝7)；

Buffer E溶液的配置：Tris-HCl饱和酚(pH＝7)，其将土壤微生物蛋白质从溶液中抽提出来；

Buffer F溶液的配置：0.1M醋酸铵(配制溶液为甲醇)，0.1M醋酸铵即200mL甲醇中加入1.54g醋酸铵，其作用是沉淀蛋白质；

Buffer G溶液的配置：丙酮(内含10mM二硫苏糖醇)，其作用为洗去其他杂质。

Buffer H溶液的配置：4M尿素(Urea)、1M硫脲(thiourea)、50mM二硫苏糖醇(DTT)、2％CHAPS、10mM三羟甲基氨基甲烷(Trisbase)，其作用为溶解蛋白质的溶液。

一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括上述试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、Buffer G和BufferH。

实施例3

一种快速提取土壤微生物蛋白质的方法，具体步骤如下：

原料：新鲜花生根际土壤，新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤。

土壤样品的前处理：取0.5g的土壤于2ml的离心管中，加入100μl Buffer A，720μl无菌水，180μl Buffer B，涡旋震荡30s，加入100μl Buffer C，300μl BufferD，涡旋震荡30s，8000g离心2min，去上清得沉淀A；

所述Buffer A为pH为5.5的1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.2M的Al₂(SO₄)₃溶液；

所述Buffer C为4M的NaOH溶液；

所述Buffer D为pH＝8的0.1M的Tris-Cl缓冲液；

土壤微生物细胞破碎和蛋白提取：所述沉淀A加入600μl Buffer E，0.5g0.5mm玻璃珠，涡旋震荡5min，4℃温度条件下11000g离心2min，吸取上清液至新离心管，加入上清液2.5倍体积的Buffer F，-20℃温度条件下沉淀12h，12000g离心30min，去上清后加入1ml Buffer G洗涤，12000g离心10min，去上清后加入1-2ml Buffer G洗涤，吸干上清，加入30uL Buffer H溶液，得蛋白质样品。

所述Buffer E为pH为7.5的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含13mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含6M尿素、2M硫脲、65mM二硫苏糖醇、重量百分数为4％的CHAPS和40mM三羟甲基氨基甲烷的溶液。

一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒，所述试剂盒包括如下试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、Buffer G和BufferH；

所述Buffer A为pH为5.5的1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.2M的Al₂(SO₄)₃溶液；

所述Buffer C为4M的NaOH溶液；

所述Buffer D为pH＝8的0.1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer E为pH为7.5的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含13mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含6M尿素、2M硫脲、65mM二硫苏糖醇、重量百分数为4％的CHAPS和40mM三羟甲基氨基甲烷的溶液。

利用实施例3所述方法对新鲜花生根际土壤，新鲜水稻根际土壤，新鲜玉米根际土壤进行蛋白质提取后进行SDS-PAGE检测，检测结果见图1，其中泳道1，2，3分别表示花生根际土壤微生物蛋白质、水稻根际土壤微生物蛋白质、玉米根际土壤微生物蛋白质，本方法与常规提取方法需要24h以上的提取时间相比，本方法可以在13小时左右即可快速获得土壤微生物蛋白质，其中包含12小时的沉淀时间与40分钟左右的离心时间，操作流程更加简便。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等同变换，或直接或间接运用在相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (4)

1.一种快速提取土壤微生物蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

土壤样品的前处理：取0.1-1g的土壤于2ml的离心管中，加入50-200μl BufferA，300-900μl无菌水，300-600μl Buffer B，涡旋震荡30-60s，加入50-200μl BufferC，100-300μl Buffer D，涡旋震荡30-60s，8000-10000g离心1-5min，去上清得沉淀A；

所述Buffer A为pH为5-6的0.1-2M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al3+离子的溶液；

所述Buffer C为包含2-6M的OH-离子的溶液；

所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-1M的Tris-Cl缓冲液；

土壤微生物细胞破碎和蛋白提取：所述沉淀A加入300-900μl Buffer E，0.5-1g 0.1-1mm玻璃珠，涡旋震荡1-6min，4℃温度条件下10000-12000g离心1-5min，吸取上清液至新离心管，加入上清液1-2.5倍体积的Buffer F，-20℃温度条件下沉淀12-24h，10000-12000g离心20-50min，去上清后加入1ml BufferG洗涤，10000-13000g离心10-20min，去上清后加入1-2ml Buffer G洗涤，吸干上清，加入30-50uL Buffer H溶液，得蛋白质样品；

所述Buffer E为pH为7-8的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1-1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含10-15mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含4-8M尿素、1-3M硫脲、50-100mM二硫苏糖醇、重量百分数为2-6％的CHAPS和10-50mM三羟甲基氨基甲烷的溶液。

2.根据权利要求1所述的快速提取土壤微生物蛋白质的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

土壤样品的前处理：取0.5g的土壤于2ml的离心管中，加入100μl Buffer A，720μl无菌水，180μl Buffer B，涡旋震荡30s，加入100μl Buffer C，300μl BufferD，涡旋震荡30s，8000g离心2min，去上清得沉淀A；

所述Buffer A为pH为5.5的1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.2M的Al₂(SO₄)₃溶液；

所述BufferC为4M的NaOH溶液；

所述Buffer D为pH＝8的0.1M的Tris-Cl缓冲液；

土壤微生物细胞破碎和蛋白提取：所述沉淀A加入600μl Buffer E，0.5g0.5mm玻璃珠，涡旋震荡5min，4℃温度条件下11000g离心2min，吸取上清液至新离心管，加入上清液2.5倍体积的Buffer F，-20℃温度条件下沉淀12h，12000g离心30min，去上清后加入1ml Buffer G洗涤，12000g离心10min，去上清后加入1-2ml Buffer G洗涤，吸干上清，加入30uL Buffer H溶液，得蛋白质样品；

所述Buffer E为pH为7.5的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含13mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含6M尿素、2M硫脲、65mM二硫苏糖醇、重量百分数为4％的CHAPS和40mM三羟甲基氨基甲烷的溶液。

3.一种快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、Buffer E、Buffer F、BufferG和Buffer H；

所述Buffer A为pH为5-6的0.1-2M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.1-2M为包含0.1-2M的Al³⁺离子的溶液；

所述Buffer C为包含2-6M的OH-离子的溶液；

所述Buffer D为pH＝7-9的0.1-1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer E为pH为7-8的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1-1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含10-15mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含4-8M尿素、1-3M硫脲、50-100mM二硫苏糖醇和10-50mM三羟甲基氨基甲烷的溶液，所述Buffer H中CHAPS的重量百分数为2-6％。

4.根据权利要求3所述的快速提取土壤微生物蛋白质的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如下试剂：Buffer A、Buffer B、Buffer C、Buffer D、BufferE、Buffer F、Buffer G和Buffer H；

所述Buffer A为pH为5.5的1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer B为0.2M的Al₂(SO₄)₃溶液；

所述Buffer C为4M的NaOH溶液；

所述Buffer D为pH＝8的0.1M的Tris-Cl缓冲液；

所述Buffer E为pH为7.5的Tris-HCl饱和酚溶液；

所述Buffer F为0.1M的醋酸铵溶液，所述醋酸铵的配制溶液为甲醇；

所述Buffer G为包含13mM二硫苏糖醇的丙酮；

所述Buffer H为包含6M尿素、2M硫脲、65mM二硫苏糖醇、重量百分数为4％的CHAPS和40mM三羟甲基氨基甲烷的溶液。