CN117092199B - 利用碳化钨纳米材料基质进行飞行时间质谱检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及代谢物定量分析技术领域，具体公开了利用碳化钨纳米材料基质进行飞行时间质谱检测的方法，包括：S1、将待测代谢物与无水乙醇混合均匀，离心处理后得到检测液；S2、吸取所述检测液点在靶板上，自然干燥后覆盖碳化钨纳米材料基质溶液，自然干燥后制得标志物样本；S3、对所述标志物样本进行MALDI‑TOF MS质谱分析。其优点是：显著提高了代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度、降低基质干扰，能够实现复杂生物样本代谢物检测且适用于生化小分子飞行时间质谱系统。
Description
技术领域
本发明涉及一种代谢物定量分析技术，尤其是一种生化小分子飞行时间质谱检测技术。
背景技术
代谢是一项重要的细胞过程，并且代谢障碍可能是很多疾病的主要诱因。代谢物（即，代谢所涉及的物质）可以是疾病表型的良好指示，并且可以用作代谢疾病生物标记。因此，代谢物的定量和分析可以在很多疾病的研究和早期诊断或检测中起到重要的作用。
目前，生化分析和基于气相/液相色谱-质谱联用技术（gas chromatography/liquid chromatography mass spectrometry，GC/LC MS）是代谢物检测的主要手段，这些方法在对样品进行除盐、除蛋白、衍生化、浓缩等预处理后，即可实现代谢物的检测。但是此种方法通常一次只能检测一种物质，且容易受背景信号的干扰，灵敏度和特异性低。如果想要实现多种代谢物的同时检测，需要对样品进行复杂的预处理，存在检测时间长、价格昂贵等问题，因此此种代谢物检测方式难以实现对代谢物样本低成本、高通量检测，难以在临床上得到广泛应用。
生化小分子飞行时间质谱系统（简称“MetaDx-MS”）是一种基于基质辅助激光解吸电离离子源（MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）的质谱设备，能够在临床上对来源于人体的血清、血浆等样本中的无机或者有机化合物进行定性或定量检测，具有样品无需经过复杂预处理过程、灵敏度高及检测效率高等特点。从该设备的工作原理可知，基质是其核心组成部分，但使用现有基质进行小分子代谢物检测时，存在检测灵敏度低、检测过程中易受其他生物大分子影响、难以实现复杂生物样本代谢物检测等缺陷。
因此，如何研发出一种灵敏度高、能够实现复杂生物样本代谢物检测且适用于生化小分子飞行时间质谱系统的基质是解决上述问题的关键。
发明内容
为提高代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度，本发明提供了一种利用碳化钨纳米材料基质进行飞行时间质谱检测的方法。
本发明所采用的技术方案是：利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，包括如下步骤：
S1、将待测代谢物与无水乙醇混合均匀，离心处理后得到检测液；
S2、吸取所述检测液点在靶板上，自然干燥后覆盖碳化钨纳米材料基质溶液，自然干燥后制得标志物样本；
S3、对所述标志物样本进行MALDI-TOF MS质谱分析。
作为本发明的进一步改进，所述碳化钨纳米材料基质溶液按照如下方法制备：
A、将氨钨酸溶液与聚乙二醇按比例混合均匀，形成混合前驱体；
B、向所述混合前驱体中加入强还原剂进行还原反应，得到还原混合物；
C、将所述还原混合物转移到超声波处理设备中进行超声波处理，得到小颗粒混合物；
D、对所述小颗粒混合物进行固液分离，得到固体沉淀和溶液；
E、使用异丙醇洗涤所述固体沉淀，得到洗涤后沉淀；
F、将所述洗涤后沉淀转移到孔径为0.2～0.45μm的滤膜上，利用滤膜将沉淀颗粒分散开来，得到分散颗粒；
G、所述分散颗粒经干燥后得到干燥颗粒；
H、所述干燥颗粒经碳化后配制成水溶液，即得碳化钨纳米材料基质溶液。
更佳的，步骤A中所述氨钨酸溶液的浓度为0.1～0.5 mol/L，所述聚乙二醇的分子量为200～1000 Da，浓度为0.1～0.3mol/L；所述氨钨酸溶液与聚乙二醇以溶质计的摩尔比为1～5 : 1。
更佳的，步骤B中所述强还原剂为乙醇，所述还原反应的温度为20～80 ℃，还原反应时间为1～24小时。
更佳的，步骤C中所述超声波处理的超声波功率为20～100 W，超声波处理时间为5～30分钟。
更佳的，步骤D中固液分离所使用的设备为离心机，离心速率为5000～10000 rpm，离心时间为5～10分钟。
更佳的，步骤G中干燥温度为60～80 ℃，干燥时间为2～4小时。
更佳的，步骤H中碳化温度为1200～1500 ℃，碳化时间为1～2小时。
作为本发明的进一步改进，所述碳化钨纳米材料基质溶液的基质浓度为3～7 mg/mL。
本发明的有益效果是：本发明的方法显著提高了代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度、降低基质干扰，能够实现复杂生物样本代谢物检测且适用于生化小分子飞行时间质谱系统。
附图说明
图1是实施例一的碳化钨纳米材料基质SEM图（a）和能谱图（b），其中能谱图包括C，W和O元素。
图2是实施例一的碳化钨纳米材料基质溶液用于标准小分子物质检测实验质谱图。（图中从左往右，标“*”的依次为尿素、肌酐、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、葡萄糖和色氨酸）。
图3是实施例二的碳化钨纳米材料基质溶液用于标准小分子物质检测实验质谱图。（图中从左往右，标“*”的依次为尿素、肌酐、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、葡萄糖和色氨酸）。
图4是实施例一的碳化钨纳米材料基质溶液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
图5是对比例一的基质溶液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
图6是对比例二的基质溶液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
图7是实施例一的碳化钨纳米材料基质溶液耐盐耐蛋白评估实验结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例一：
按照如下方法制备碳化钨纳米材料基质溶液：
（1）将浓度为0.3 mol/L的氨钨酸溶液与0.2mol/L的分子量为550Da的聚乙二醇按比例混合均匀，形成混合前驱体；所述氨钨酸溶液与聚乙二醇以溶质计的摩尔比为3 : 1；
（2）向所述混合前驱体中加入强还原剂乙醇进行还原反应，还原反应的温度为63℃，还原反应时间为12 h；得到还原混合物；
（3）将所述还原混合物转移到超声波处理设备中进行超声波处理，设置超声波功率为75 W，超声波处理时间为17分钟；得到小颗粒混合物；
（4）使用离心机对所述小颗粒混合物进行固液分离，离心速率为8500 rpm，离心时间为8分钟，得到固体沉淀和溶液；
（5）使用异丙醇洗涤所述固体沉淀，洗涤次数为5次，得到洗涤后沉淀；
（6）将所述洗涤后沉淀转移到孔径为0.35μm的滤膜上，利用滤膜将沉淀颗粒分散开来；
（7） 将分散在滤膜上的颗粒放置在67 ℃的干燥器中干燥3.2小时，得到干燥颗粒；
（8）将所述干燥颗粒放置在高温炉中，设定碳化温度为1350 ℃、碳化时间1.6小时，完成碳化后取出配制成基质浓度为5 mg/mL的水溶液，即得碳化钨纳米材料基质溶液。
图1是实施例一的碳化钨纳米材料基质溶液SEM图（a）和能谱图（b），其中能谱图包括C，W和O元素。
实施例二：
按照如下方法制备碳化钨纳米材料基质溶液：
（1）将浓度为0.5 mol/L的氨钨酸溶液与0.2mol/L的分子量为1000Da的聚乙二醇按比例混合均匀，形成混合前驱体；所述氨钨酸溶液与聚乙二醇以溶质计的摩尔比为5 :1；
（2）向所述混合前驱体中加入强还原剂乙醇进行还原反应，还原反应的温度为48℃，还原反应时间为16 h；得到还原混合物；
（3）将所述还原混合物转移到超声波处理设备中进行超声波处理，设置超声波功率为50 W，超声波处理时间为24分钟；得到小颗粒混合物；
（4）使用离心机对所述小颗粒混合物进行固液分离，离心速率为10000 rpm，离心时间为5分钟，得到固体沉淀和溶液；
（5）使用异丙醇洗涤所述固体沉淀，洗涤次数为5次，得到洗涤后沉淀；
（6）将所述洗涤后沉淀转移到孔径为0.25μm的滤膜上，利用滤膜将沉淀颗粒分散开来；
（7） 将分散在滤膜上的颗粒放置在80 ℃的干燥器中干燥2小时，得到干燥颗粒；
（8）将所述干燥颗粒放置在高温炉中，设定碳化温度为1450 ℃、碳化时间1.5小时，完成碳化后取出配制成基质浓度为7 mg/mL的水溶液，即得碳化钨纳米材料基质溶液。
对比例一：
将纳米三氧化钨配制成与实施例一基质浓度相同的基质溶液。
对比例二：
将纳米碳化钼配制成与实施例一基质浓度相同的基质溶液。
碳化钨纳米材料基质溶液耐盐耐蛋白评估实验：
（1）配置5mol/L的NaCl水溶液、50mg/mL的牛血清白蛋白水溶液和含50mg/mL牛血清白蛋白的5mol/L的NaCl溶液，相当于10×的母液；
（2）分别配置10mg/mL的赖氨酸、精氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、色氨酸、肌酐、尿素、葡萄糖混合溶液；
（3）取4只离心管，分别向四只离心管中加入步骤（2）所得的9种小分子溶液，各100μL；
（4）再向步骤（3）的4只离心管中分别加入纯水和步骤（1）所得3种母液各100μL，最终获得9种小分子终浓度均为1mg/mL的待测液，且待测小分子所处体系环境分别为纯水体系、高盐体系、高蛋白体系和高盐高蛋白体系；
（5）取0.5μL步骤（4）所获待测物点在靶板上，自然干燥后覆盖0.5μL实施例一制的的碳化纳米坞基质，自然干燥后送入质谱仪进行检测；
（6）按照信噪比S/N≥3提取质谱峰，标记出标准品的出峰位置，当9种小分子均出峰时则认为基质具有较好的耐盐耐蛋白性能。详见附图7。
由图7可见，四张质谱图中，9个小分子均有效被检测到，标“*”的依次为尿素、肌酐、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、葡萄糖和色氨酸。
碳化钨纳米材料基质溶液标准小分子物质检测实验：
（1）分别配置10mg/mL的赖氨酸、苯丙氨酸、精氨酸、蛋氨酸、亮氨酸、色氨酸、肌酐、尿素、葡萄糖混合溶液；
（2）将9种小分子混合配置成1mg/mL的混合标准溶液；
（3）分别取步骤（2）所述混合标准溶液10uL，然后分别与10uL实施例一、实施例二制得的碳化钨纳米材料基质溶液充分混合制得两组样品，每组样品分别取1uL点在不同靶板上，分别采集质谱图像；
（4）按照信噪比S/N大于3提取质谱峰，每种小分子标准品的出峰情况分别如图2、图3所示。
血清代谢物飞行时间质谱检测对比实验：
本对比实验将实施例一制得的碳化钨纳米材料基质溶液与对比例一的由三氧化钨纳米材料、对比例二的由碳化钼配制成的相同基质浓度的基质溶液进行对比，比较三者用于血清代谢物飞行时间质谱检测的能力差异。实验方法如下：
（1）将待测血清与无水乙醇以体积比1∶3混合均匀，1500g高速离心15 min后得到检测液；
（2）分别量取0.5 uL所述检测液分别点在不同靶板上，自然干燥后分别覆盖1 uL实施例一的碳化钨纳米材料基质溶液、对比例一的基质溶液、对比例二的基质溶液，在相同环境下自然干燥后制得三组标志物样本；
（3）对所述三组标志物样本分别在同一台质谱仪上分别进行MALDI-TOF MS质谱分析采集谱图，按照信噪比S/N大于3提取质谱峰，记录出峰情况，质谱图分别如图4（实施例一）、图5（对比例一）、图6（对比例二）所示。
从图4、图5、图6可以看到使用实施例一制得的碳化钨纳米材料基质溶液出峰个数在220个左右，而使用对比例一的基质溶液仅有60个左右，使用对比例二的基质溶液仅有45个左右，表明本发明利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测相对于其他纳米材料能够显著提高代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度。
Claims (8)
1.利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，包括如下步骤：
S1、将待测代谢物与无水乙醇混合均匀，离心处理后得到检测液；
S2、量取所述检测液点在靶板上，自然干燥后覆盖碳化钨纳米材料基质溶液，再经自然干燥后制得标志物样本；
S3、对所述标志物样本进行MALDI-TOF MS质谱分析；
所述碳化钨纳米材料基质溶液按照如下方法制备：
A、将氨钨酸溶液与聚乙二醇按比例混合均匀，形成混合前驱体；
B、向所述混合前驱体中加入强还原剂进行还原反应，得到还原混合物；
C、将所述还原混合物转移到超声波处理设备中进行超声波处理，得到小颗粒混合物；
D、对所述小颗粒混合物进行固液分离，得到固体沉淀和溶液；
E、使用异丙醇洗涤所述固体沉淀，得到洗涤后沉淀；
F、将所述洗涤后沉淀转移到孔径为0.2～0.45μm的滤膜上，利用滤膜将沉淀颗粒分散开来，得到分散颗粒；
G、所述分散颗粒经干燥后得到干燥颗粒；
H、所述干燥颗粒经碳化后配制成水溶液，即得碳化钨纳米材料基质溶液。
2.根据权利要求1所述的利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤A中所述氨钨酸溶液的浓度为0.1～0.5 mol/L，所述聚乙二醇的分子量为200～1000 Da，浓度为0.1～0.3mol/L；所述氨钨酸溶液与聚乙二醇以溶质计的摩尔比为1～5 : 1。
3.根据权利要求1所述的利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤B中所述强还原剂为乙醇，所述还原反应的温度为20～80 ℃，还原反应时间为1～24小时。
4.根据权利要求1所述的利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤C中所述超声波处理的超声波功率为20～100 W，超声波处理时间为5～30分钟。
5.根据权利要求1所述的利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤D中固液分离所使用的设备为离心机，离心速率为5000～10000 rpm，离心时间为5～10分钟。
6.根据权利要求1所述的利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤G中干燥温度为60～80 ℃，干燥时间为2～4小时。
7.根据权利要求1所述的利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤H中碳化温度为1200～1500 ℃，碳化时间为1～2小时。
8.根据权利要求1～7中任一所述的利用碳化钨纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：所述碳化钨纳米材料基质溶液的基质浓度为3～7 mg/mL。
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