CN117110415B - 利用碳化钴纳米材料基质进行飞行时间质谱检测的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生化小分子代谢物飞行时间质谱检测技术，具体公开了利用碳化钴纳米材料基质进行飞行时间质谱检测的方法，包括如下步骤：S1、在待测代谢物中加入预冷的乙醇，震荡以使待测代谢物中的蛋白在乙醇的作用下完全沉淀，然后离心处理，取上清液作为检测液；S2、量取所述检测液点在靶板上，自然风干后覆盖碳化钴纳米材料基质分散液，再经自然干燥后制得标志物样本；S3、将标志物样本送入质谱仪中，进行MALDI‑TOF MS分析。其优点是：显著提高了代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度，提高了复杂生物样本中的小分子代谢物的检测覆盖度，大大提高MALDI‑TOF MS检测的准确性。
Description
技术领域
本发明涉及一种代谢物定量分析技术，尤其是一种生化小分子（代谢物）飞行时间质谱检测技术，具体公开了利用碳化钴纳米材料基质进行飞行时间质谱检测的方法。
背景技术
飞行时间质谱系统是一种基于基质辅助激光解吸电离离子源（Matrix AssistedLaser Desorption Ionization Mass Spectrometry, MALDI）和飞行时间质量分析器（TOF）的质谱设备，能够实现对非挥发性、不稳定的分子进行高灵敏、高分辨和高准确的分析。
从该设备的工作原理可知，基质是其核心组成部分，基质的主要作用是吸收激光能量，随后转换为热量，引起样品的解吸，其次，基质的激发态在样品分析的电离时扮演着缓冲作用，可用于激光能量的存储，在分子内或分子间驰域时间内将能量进行释放。样品准备过程被认为是质谱分析中最为重要的步骤。标准的样品准备方法是将一定体积的样品和基质分散液混合，随后沉积在样品载体或靶板上并结晶。样品和基质分散液的组成直接影响着分析结果的质量，因此根据待测样本的不同，不同的物质电离所需要的能量有差异，需要不同的基质来辅助样品发生电离。
飞行时间质谱近些年与纳米技术相结合，在生物医学、临床化学领域已初步展现出巨大的应用能力。例如，公开号为CN113176329A的中国专利申请公开了一种四氧化三钴作为基质在MALDI-TOF MS检测小分子中的应用，该申请利用纳米四氧化三钴作为基质，可快速实现氨基酸、脂类化合物、多肽、寡糖、糖类、核苷、激素、药物等分子量小于1000Dalton化合物的分析，但仍然存在检测灵敏度低、检测过程中易受其他生物大分子影响、难以实现复杂生物样本代谢物（如血清样本）检测等缺陷。
因此，研发出一种灵敏度高、能够实现复杂生物样本代谢物检测且适用于生化小分子飞行时间质谱系统的基质是解决上述问题的关键。
发明内容
为提高代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度，提高复杂生物样本中的小分子代谢物的检测覆盖度，本发明提供了一种利用碳化钴纳米材料基质进行飞行时间质谱检测的方法。
本发明所采用的技术方案是：利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，包括如下步骤：
S1、在待测代谢物中加入预冷的乙醇，震荡以使待测代谢物中的蛋白在乙醇的作用下完全沉淀，然后离心处理，取上清液作为检测液；
S2、量取所述检测液点在靶板上，自然风干后覆盖碳化钴纳米材料基质分散液，再经自然干燥后制得标志物样本；
S3、将标志物样本送入质谱仪中，进行MALDI-TOF MS分析。
针对复杂生物样本中的小分子代谢物的检测覆盖度低的问题，我们开发了一种新的碳化钴纳米基质，可以在正/负离子模式下完成对小分子的检测。与常用的传统有机基质或纳米四氧化三钴基质相比，本发明的碳化钴纳米基质的背景更干净，结合MALDI-TOF MS平台可以在半分钟内完成检测，不仅可以分析氨基酸、小肽和脂质类标准品小分子，还可以分析复杂生物样本中的小分子代谢物，成功实现高通量多种类的小分子检测。
本发明步骤S2中的碳化钴纳米材料基质分散液具体可以按照如下步骤制备：
A、将钴盐溶液与表面活性剂按比例混合均匀，得到混合前驱体溶液；
B、将所述混合前驱体溶液在80～120℃下反应1～4h，得到反应产物；
C、向反应产物中加入强还原剂，在80～120℃下，再反应1～4h，得到还原产物；
D、向还原产物中加入极性溶剂使还原产物生成沉淀，然后用同样的所述极性溶剂对沉淀进行洗涤以去除杂质，得到洗涤浆料；
E、固液分离洗涤浆料，将得到的固相进行干燥，得到干燥颗粒；
F、所述干燥颗粒经碳化后配制成水溶液，即得碳化钴纳米材料基质分散液。
更佳的，步骤A中所述钴盐溶液为浓度0.1～0.5 mol/L的氯化钴溶液，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述氯化钴溶液与十二烷基硫酸钠以溶质计的摩尔比为1～5∶1。
更佳的，步骤C中所述强还原剂为摩尔浓度0.2～0.4 mol/L的乙醇溶液，所述乙醇溶液的用量为：根据步骤A中氯化钴溶液的量，所述氯化钴溶液与乙醇溶液以溶质计的摩尔比为6～20∶1。
更佳的，步骤D中所述极性溶剂为二甲基甲酰胺或丙酮。
更佳的，步骤E中干燥温度为60～80℃。
更佳的，步骤F的碳化温度为800～1000℃，碳化时间为1～2小时。
作为本发明的进一步改进，所述碳化钴纳米材料基质分散液的基质浓度为1～5mg/mL。
本发明的有益效果是：本发明的方法显著提高了代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度，提高了复杂生物样本中的小分子代谢物的检测覆盖度，大大提高MALDI-TOF MS检测的准确性。
附图说明
图1是实施例一的碳化钴纳米材料基质SEM图。
图2是实施例一的碳化钴纳米材料基质溶液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
图3是实施例二的碳化钴纳米材料基质溶液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
图4是对比例一的基质溶液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
图5是对比例二的基质溶液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明进一步说明。
实施例一：
按照如下方法制备碳化钴纳米材料基质分散液：
（1）将浓度0.3mol/L的氯化钴溶液与表面活性剂十二烷基硫酸钠按比例混合均匀，得到混合前驱体溶液；氯化钴溶液与十二烷基硫酸钠以溶质计的摩尔比为3∶1；
（2）将所述混合前驱体溶液在100℃下反应2.5h。
（3）向步骤（2）所得反应液中加入0.3mol/L的乙醇溶液，100℃下再反应2.5h，得到还原产物；氯化钴溶液与乙醇溶液以溶质计的摩尔比为15∶1；
（4）向还原产物中加入浓度2mol/L的丙酮溶剂使还原产物生成沉淀，然后用上述丙酮溶剂对沉淀进行洗涤以去除杂质，得到洗涤浆料；
（5）使用离心机将沉淀物与溶液分离，将得到的固相在70℃下进行干燥，以去除溶剂并使颗粒完全干燥，得到干燥颗粒；
（6）将所述干燥颗粒放置在高温炉中，设定碳化温度为950 ℃、碳化时间1.2小时，完成碳化后取出配制成基质浓度为5 mg/mL的水溶液，即得碳化钴纳米材料基质分散液。
图1是实施例一的碳化钴纳米材料基质分散液SEM图。
实施例二：
按照如下方法制备碳化钴纳米材料基质分散液：
（1）将浓度0.5mol/L的氯化钴溶液与表面活性剂十二烷基硫酸钠按比例混合均匀，得到混合前驱体溶液；氯化钴溶液与十二烷基硫酸钠以溶质计的摩尔比为4∶1；
（2）将所述混合前驱体溶液在120℃下反应2h。
（3）向步骤（2）所得反应液中加入0.25mol/L的乙醇溶液，120℃再反应2h，得到还原产物；氯化钴溶液与乙醇溶液以溶质计的摩尔比为10∶1；
（4）向还原产物中加入浓度2mol/L的二甲基甲酰胺使还原产物生成沉淀，然后用上述二甲基甲酰胺对沉淀进行洗涤以去除杂质，得到洗涤浆料；
（5）使用离心机将沉淀物与溶液分离，将得到的固相在80℃下进行干燥，以去除溶剂并使颗粒完全干燥，得到干燥颗粒；
（6）将所述干燥颗粒放置在高温炉中，设定碳化温度为800 ℃、碳化时间2小时，完成碳化后取出配制成基质浓度为3 mg/mL的水溶液，即得碳化钴纳米材料基质分散液。
图3是实施例二的碳化钴纳米材料基质分散液用于血清代谢物飞行时间质谱检测实验质谱图。
对比例一：
将纳米四氧化三钴配制成基质分散液，方法如下：
使用万分之一天平称量10mg左右的纳米四氧化三钴粉末，并记录精确的质量，根据所称取的精确质量，使用纯水配置成5mg/mL的四氧化三钴基质分散液，该浓度与实施例一的分散液基质浓度相同。
对比例二：
将纳米碳化钼配制成基质分散液，方法如下：
使用万分之一天平称量10mg左右的纳米碳化钼粉末，并记录精确的质量，根据所称取的精确质量，使用纯水配置成5mg/mL的碳化钼基质分散液，该浓度与实施例一的分散液基质浓度相同。
血清代谢物飞行时间质谱检测对比实验：
本对比实验将实施例一制得的碳化钴纳米材料基质分散液与对比例一的由四氧化三钴纳米材料、对比例二的由碳化钼配制成的相同基质浓度的基质分散液进行对比，比较三者用于血清代谢物飞行时间质谱检测的能力差异。实验方法如下：
（1）在原始血清样本中加入预冷的乙醇，使血清与乙醇的体积比是1:3。然后将混合物用震荡仪涡旋震荡1 min以确保将血清中的蛋白在乙醇的作用下完全沉淀。接着在4℃下，以15000 g离心10min。从每个混合物样本中取等量的上清液作为检测液；
（2）分别量取0.5 uL所述检测液点在靶板上，自然干燥后分别覆盖1 uL实施例一的碳化钴纳米材料基质分散液、对比例一的基质分散液、对比例二的基质分散液，在相同环境下自然干燥后制得三组标志物样本；
（3）对所述三组标志物样本分别在同一台质谱仪上分别进行MALDI-TOF MS质谱分析采集谱图。所有样本的MALDI-TOF MS数据使用flexAnalysis软件进行特征峰提取等预处理。按照信噪比S/N>3，0.05 Da峰宽进行质谱峰提取。导出原始数据至“.txt”文件用于计算总离子流强度（Total Ion Chromatogram，TIC），再次使用0.05 Da的窗口，对数据中的质谱峰进行对齐。然后在样本质谱数据中扣除背景强度较高的峰，扣除标准为当样本代谢谱图中质谱峰的强度没有超过Blank样本中对应质谱峰强度的10倍时，该质谱峰则被扣除。接着使用TIC归一化法将质谱峰强度归一化。质谱图分别如图2（实施例一）、图4（对比例一）、图5（对比例二）所示。
从图2、图4、图5可以看出，使用本发明的碳化钴纳米材料基质、纳米四氧化三钴基质和纳米碳化钼基质进行代谢物飞行时间质谱检测，分别能够检测出398个峰、307个峰和282个峰，可见采用本发明的碳化钴纳米材料基质相对于其他纳米材料能显著提高代谢物飞行时间质谱检测的灵敏度。
Claims (7)
1.利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，包括如下步骤：
S1、在待测代谢物中加入预冷的乙醇，震荡以使待测代谢物中的蛋白在乙醇的作用下完全沉淀，然后离心处理，取上清液作为检测液；
S2、量取所述检测液点在靶板上，自然风干后覆盖碳化钴纳米材料基质分散液，再经自然干燥后制得标志物样本；
S3、将标志物样本送入质谱仪中，进行MALDI-TOF MS分析；
所述碳化钴纳米材料基质分散液按照如下方法制备：
A、将钴盐溶液与表面活性剂按比例混合均匀，得到混合前驱体溶液；
B、将所述混合前驱体溶液在80～120℃下反应1～4h，得到反应产物；
C、向反应产物中加入强还原剂，在80～120℃下，再反应1～4h，得到还原产物；
D、向还原产物中加入极性溶剂使还原产物生成沉淀，然后用同样的所述极性溶剂对沉淀进行洗涤以去除杂质，得到洗涤浆料；
E、固液分离洗涤浆料，将得到的固相进行干燥，得到干燥颗粒；
F、所述干燥颗粒经碳化后配制成水溶液，即得碳化钴纳米材料基质分散液。
2.根据权利要求1所述的利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤A中所述钴盐溶液为浓度0.1～0.5 mol/L的氯化钴溶液，所述表面活性剂为十二烷基硫酸钠，所述氯化钴溶液与十二烷基硫酸钠以溶质计的摩尔比为1～5∶1。
3.根据权利要求1所述的利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤C中所述强还原剂为摩尔浓度0.2～0.4mol/L的乙醇溶液，所述乙醇溶液的用量为：根据步骤A中氯化钴溶液的量，所述氯化钴溶液与乙醇溶液以溶质计的摩尔比为6～20∶1。
4.根据权利要求1所述的利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤D中所述极性溶剂为二甲基甲酰胺或丙酮。
5.根据权利要求1所述的利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤E中干燥温度为60～80℃。
6.根据权利要求1所述的利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：步骤F的碳化温度为800～1000℃，碳化时间为1～2小时。
7.根据权利要求1～6中任一所述的利用碳化钴纳米材料基质进行代谢物飞行时间质谱检测的方法，其特征在于：所述碳化钴纳米材料基质分散液的基质浓度为1～5mg/mL。
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