CN111426741A - 基于纳米材料辅助maldi-tof ms进行液体活检的方法 - Google Patents

基于纳米材料辅助maldi-tof ms进行液体活检的方法 Download PDF

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CN111426741A CN202010316901.7A CN202010316901A CN111426741A CN 111426741 A CN111426741 A CN 111426741A CN 202010316901 A CN202010316901 A CN 202010316901A CN 111426741 A CN111426741 A CN 111426741A
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Abstract

本发明提供了一种基于纳米材料辅助MALDI‑TOF MS进行液体活检的方法，该方法包括以下步骤：将含小分子代谢物的样品滴加到MALDI‑TOF MS的金属靶片上，风干；将纳米材料溶解到去离子水中形成纳米材料均相溶液；将纳米材料均相溶液滴加到风干后的样品上，继续风干后进行MALDI‑TOF MS检测，检测过程中使用smartbeam‑II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。本发明将质谱技术与特定的纳米材料相结合，利用特定的纳米材料提高信号的灵敏度和检出限，同时可以实现对现有基质所产生的质谱峰干扰的排除。

Description

基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法
技术领域
本发明属于质谱分析技术领域，具体涉及一种基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法。
背景技术
基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术是利用具有紫外光吸收的有机基质吸收激光能量以实现待测物的激光解吸电离的分析技术，具有免标记、高通量及自动化的特点，实现了对非挥发性样品的分析，同时与其他质谱相比，MALDI-TOF MS具有较高的耐盐、耐缓冲剂和其他非挥发性成分的优点。由于MALDI-TOF MS分析中大多数样品分子都是被解离成单电荷分子离子，所以得到的质谱图比较简单，有利于图谱解析。
目前使用较多的基质有三类，以α-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)为代表的肉桂酸衍生物、以2,4-二羟基苯丙酸(DHB)为代表的芳香羧酸衍生物及苯胺系列。其中，CHCA无选择性地电离肽段和蛋白质，产生强的离子信号，适合肽段及糖肽的分析。DHB是最常见的基质，产生的基质峰及基质缔合峰少，在各类大分子化合物的分析中都得到了广泛的应用。低聚核苷酸的测定，通常在负离子检测模式下使用3-羟基吡啶甲酸。
MALDI-TOF MS在大分子化合物的分析上有许多优点，但它还不能广泛地应用于小分子化合物的分析，其主要原因在于有机小分子基质会发生破裂及分子之间的缔合，从而产生严重的基质背景干扰现象。因此，研究一种基于能够吸收激光能量而不产生可以被检测到的簇离子的纳米材料辅助MALDI-TOF MS基质，使其能够检测分析低质量范围内的代谢组学是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种基于纳米材料辅助MALDI-TOFMS进行液体活检的方法，本发明将质谱技术与特定的纳米材料相结合，利用特定的纳米材料提高信号的灵敏度和检出限，同时可以实现对现有基质所产生的质谱峰干扰的排除。
为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，包括以下步骤：
含小分子代谢物的样品滴加到MALDI-TOF MS的金属靶片上，风干；
将纳米材料分散到去离子水中形成纳米材料均相溶液；所述纳米材料为SiO2核/Au壳纳米材料、多孔硅纳米线、氧化铁纳米材料、金纳米颗粒、金纳米簇中的至少一种；
将纳米材料均相溶液滴加到风干后的样品上，继续风干后进行MALDI-TOF MS检测，检测过程中使用smartbeam-II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。
进一步地，纳米材料均相溶液中纳米材料的浓度为0.8-1.5mg/ml，纳米材料均相溶液和含小分子代谢物的样品的体积比为1-4:1。
进一步地，纳米材料均相溶液中纳米材料的浓度为1mg/ml，纳米材料均相溶液和含小分子代谢物的样品的体积比为2:1。
进一步地，小分子代谢物为体液中分子量小于1000的物质。
进一步地，检测过程中每个样本随机测量20个不同的点，每个点激光随机打点25次。
进一步地，SiO2核/Au壳纳米材料通过以下方法制备得到：
(1)制备金纳米粒
边搅拌边将水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)加入THPC溶液中，然后置于4℃陈化12-16h，制得金纳米粒；
(2)制备功能化硅核
将二氧化硅纳米球与乙醇混合，超声分散均匀；
将超声分散液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合，在85-95℃热处理2-4h，然后冷却至室温，离心，洗涤，重悬，制得；
(3)金纳米粒对硅核进行改性
将金纳米粒、功能化硅核和水按体积比为1-2:1-2:2-5混合，室温下放置8-12min，再于4℃放置24-28h，最后清洗，重悬，制得；
(4)金纳米壳层的生长
将碳酸盐溶液和水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)混合，得无色溶液，接着置于4℃陈化24-28h，然后边搅拌边将陈化后的溶液加入步骤(3)所得物中，反应8-15min后再加入还原剂，继续搅拌至还原完全，制得SiO2核/Au壳纳米材料(即金纳米壳层)。
进一步地，步骤(1)中THPC溶液通过以下方法制备得到：将1M的氢氧化钠、THPC和水按照体积比为0.4-0.6:10-15：45-50混合，制得；其中，1M的氢氧化钠、THPC和水的体积比优选为0.5:12：47.5。
进一步地，步骤(2)中具体步骤为：将2.5wt％的二氧化硅纳米球与乙醇混合，超声分散均匀后加入3-氨丙基三乙氧基硅烷，在90℃热处理3h，冷却至室温后，离心，用乙醇洗涤，最后用乙醇重悬，制得；其中，2.5wt％的二氧化硅纳米球、乙醇和3-氨丙基三乙氧基硅烷的体积比为0.3-0.6:8-12:0.1-0.3，优选为0.5:10:0.15。
进一步地，步骤(3)中将金纳米粒、功能化硅核和水的体积比为1:1:3。
进一步地，步骤(4)中陈化后的溶液、步骤(3)所得物和还原剂的的体积比为6-10:18-25:45-55，优选为8:20:50。
进一步地，步骤(4)中碳酸盐为碳酸钾，还原剂为甲醛。
进一步地，多孔硅纳米线通过以下方法制备得到：
(1)预处理：除去硅片表面的氧化层；
(2)银沉积：将预处理后的硅片浸泡于含银液体中进行银沉积；
(3)刻蚀：用去离子水清洗沉积有银的硅片，然后在浸蚀液中浸泡50-70min，然后再除去硅片表面的银，制得硅纳米线。
进一步地，银沉积过程具体为：将预处理后的硅片浸泡于含4.5-5.0M氢氟酸和0.003-0.008M硝酸银的混合溶液中浸泡40-80s；优选为氢氟酸的浓度为4.8M，硝酸银的浓度为0.005M，浸泡时间为60s。
进一步地，刻蚀过程具体为：将银沉积后的硅片用去离子水冲洗，接着再浸泡于含4.5-5.5M氢氟酸和0.6-1.2M双氧水的混合溶液中，浸泡50-70min，然后再浸入浓硝酸中浸泡50-70min，制得硅纳米线；优选为将银沉积后的硅片用去离子水冲洗，接着再浸泡于含4.8M氢氟酸和0.8M双氧水的混合溶液中，浸泡60min，然后再浸入浓硝酸中浸泡1h。
进一步地，银纳米线通过以下方法制备得到：将银溶液和乙二醇分散均匀，然后加入PVP-40和CuCl2·2H2O，置于150-170℃加热反应2-4h，冷却至室温后，离心，清洗，制得。具体为：将0.170g AgNO3和10mL乙二醇在磁搅拌下溶解。然后逐滴加0.15M的PVP-40和0.111mM的CuCl2·2H2O(170.48)混合溶液(溶解在10mL乙二醇)之后，混合物转移到不锈钢高压釜(50毫升的容量)，在160℃加热3h。自然冷却到室温后，2500r/min离心5分钟，再用乙醇和去离子水清洗三次，将产物分散在乙醇中进行表征和应用。
当银纳米线作为基质用于MALDI-TOF MS检测时，可直接将其与乙醇混合，形成一定浓度后进行MALDI-TOF MS检测。
进一步地，银纳米球通过以下方法制备得到：将含银的盐溶液搅拌加热至沸腾，然后加入还原剂进行回流反应，制得纳米球材料，可直接作为基质用于MALDI-TOF MS检测中；也可以将回流反应所得物经离心，浓缩，制得所需浓度的银纳米球材料，并将其作为基质用于MALDI-TOF MS检测中。在该反应过程中含银的盐溶液可以是硝酸银溶液，还原剂可以是柠檬酸三钠溶液，具体过程可以为：将1mM的硝酸银水溶液搅拌加热至沸腾，然后加入柠檬酸三钠溶液(34mM)继续回流加热10min，最终制得银纳米球材料。
上述银纳米球材料还可以通过以下方法制得：
将还原剂加热至60℃，在黑暗中搅拌，确保溶液均匀；然后加入含银的盐溶液搅拌加热至90℃，之后使用0.1M的NaOH将溶液的pH值调整为10.5，继续进行90℃加热回流反应制得纳米球材料。在该反应过程中含银的盐溶液可以是硝酸银溶液，还原剂是柠檬酸三钠和硼氢化钠混合溶液。具体过程可以为：将新制备的含NaBH4和柠檬酸三钠(TSC)的水溶液混合并加热至60℃，在黑暗中搅拌30分钟，确保溶液均匀；30分钟后，滴入所需体积的AgNO3溶液，随后，温度提高到90℃；当温度达到90℃时，使用0.1M的NaOH将溶液的pH值调整为10.5，同时继续加热20分钟，直到出现明显的颜色变化；纳米颗粒悬浮液在室温下冷却，AgNP悬浮液离心(12000rpm,15分钟)去除未反应的还原剂，洗涤三次；在去离子水中再分散，最后在4℃保存留用。本发明提供的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，具有以下有益效果：
本发明将质谱技术与特定的纳米材料相结合，利用特定的纳米材料提高信号的灵敏度和检出限，提高了小分子样品的MALDI-TOF MS的检测灵敏度，同时可以实现对现有基质所产生的质谱峰干扰的排除以及对小分子样品质谱信号的增强处理。
所用的特定纳米材料为SiO2核/Au壳纳米材料、多孔硅纳米线、氧化铁纳米材料、金纳米颗粒、金纳米簇中、银纳米线和银纳米球的至少一种。
SiO2核/Au壳纳米材料是将金壳生长在硅核上，通过吸收硅珠上预先合成的金纳米粒子并原位生长成连续的纳米壳，进而形成核壳纳米球即金纳米壳层，该金纳米壳层具有粗糙的表面和强的表面等离子体效应，因而使其在紫外区也表现出很强的吸收，该独特的性能在很大程度上有利于吸收来自基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的紫外激光激发的能量，因此可以捕获和分析小于1000Da的小分子代谢物信号，能够吸收激光能量而不产生可以被检测到的簇离子，有效克服了现有基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷，其大大简化了小分子样品的检测难度，提高了小分子样品的MALDI-TOF MS的检测灵敏度。
多孔硅纳米线是通过高氧化蚀刻工艺在硅纳米晶核上生成了非晶态SiO2层，使其具有亲水性，且在银催化溶液刻蚀过程中随着H2O2浓度的增加，硅纳米线的多孔性和一维特性得以实现，增大了其表面积，进而有利于增加与小分子代谢物的相互作用，使得能够捕获和分析小于1000Da的小分子代谢物信号，能够吸收激光能量而不产生可以被检测到的簇离子。
氧化铁可吸收来自基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的紫外激光激发的能量，促进待测物解吸电离，且其本身不产生MS可以检测到质谱峰的簇离子，因此，可适用于对分子量小于1000的小分子进行质谱分析，且能有效克服现有基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷。
本发明制得的银纳米球表面具有等离子体效应，其表面等离子体共振波长为410nm，可用于紫外-可见吸收(UV-vis)光谱仪测定制备好的银纳米球粒子的吸光度，若测定的峰值在410nm左右，说明银纳米球制备完成。也正是因为银纳米球表面具有等离子体效应，其在很大程度上有利于吸收来自基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的紫外激光激发的能量，并将吸收的能量传递给分析物，使分析物迅速解析气化并电离形成分子离子状态，进而被质谱检测仪检测，且制得的银纳米球材料可以捕获和分析小于1000Da的小分子代谢物信号，能够吸收激光能量而不产生可以被检测到的簇离子，有效克服了现有基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷，其大大简化了小分子样品的检测难度，提高了小分子样品的MALDI-TOF MS的检测灵敏度。
银纳米线材料表面具有等离子体效应，其在很大程度上有利于吸收来自基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱的紫外激光激发的能量，并将吸收的能量传递给分析物，使分析物迅速解析气化并电离形成分子离子状态，进而被质谱检测仪检测，且制得的银纳米线材料可以捕获和分析小于1000Da的小分子代谢物信号，能够吸收激光能量而不产生可以被检测到的簇离子，有效克服了现有基质在低分子量区容易产生严重的基质背景干扰现象从而导致不能有效分析小分子样品的缺陷，其大大简化了小分子样品的检测难度，提高了小分子样品的MALDI-TOF MS的检测灵敏度。
附图说明
图1为基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法示意图。
图2为金纳米壳层(GNS)的表征结果图。
图3为多孔硅纳米线的表征结果图。
图4为氧化铁纳米材料的SEM图。
图5为SiO2核/Au壳纳米材料和多孔硅纳米线作为基质与血清样品混合后的典型LDI信号结果。
图6为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图7为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖和尿酸信号结果。
图8为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质，十种混合氨基酸浓度为200nM时的检测结果。
图9为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质，十种混合氨基酸浓度为1000nM时的检测结果。
图10为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质，四种混合氨基酸浓度为0.25μM时的检测结果。
图11为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质，四种混合氨基酸浓度为2.5μM时的检测结果。
图12为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质，四种混合氨基酸浓度为5μM时的检测结果。
图13为SiO2核/Au壳纳米材料作为基质，四种混合氨基酸浓度为25μM时的检测结果。
图14为多孔硅纳米线作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图15为多孔硅纳米线作为基质与血清样品混合后检测的肌酐信号结果。
图16为多孔硅纳米线作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图17为多孔硅纳米线作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图18为多孔硅纳米线作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图19为多孔硅纳米线作为基质，十种混合氨基酸浓度为200nM时的检测结果。
图20为多孔硅纳米线作为基质，十种混合氨基酸浓度为1000nM时的检测结果。
图21为多孔硅纳米线作为基质，四种混合氨基酸浓度为0.25μM时的检测结果。
图22为多孔硅纳米线作为基质，四种混合氨基酸浓度为0.25μM时的检测结果。
图23为多孔硅纳米线作为基质，四种混合氨基酸浓度为5μM时的检测结果。
图24为多孔硅纳米线作为基质，四种混合氨基酸浓度为25μM时的检测结果。
图25为氧化铁纳米材料作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图26为氧化铁纳米材料作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图27为氧化铁纳米材料作为基质与血清样品混合后检测的葡萄糖信号结果。
图28为氧化铁纳米材料作为基质，十种混合氨基酸浓度为200nM时的检测结果。
图29为氧化铁纳米材料作为基质，十种混合氨基酸浓度为1000nM时的检测结果。
图30为氧化铁纳米材料作为基质，四种混合氨基酸浓度为0.25μM时的检测结果。
图31为氧化铁纳米材料作为基质，四种混合氨基酸浓度为2.5μM时的检测结果。
图32为氧化铁纳米材料作为基质，四种混合氨基酸浓度为5μM时的检测结果。
图33为氧化铁纳米材料作为基质四种混合氨基酸浓度为25μM时的检测结果。
图34为银纳米线材料的扫描电镜(SEM)图。
图35为银纳米线材料的紫外-可见光吸收光谱图。
图36为银纳米线作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测的结果图。
图37为实施例8制得的银纳米球的紫外-可见光吸收光谱图。
图38为实施例9制得的银纳米球的扫描电镜(SEM)图。
图39为实施例9制得的银纳米球的紫外-可见光吸收光谱图。
图40为实施例8制得的银纳米球作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测结果图。
图41为实施例9制得的银纳米球的作为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测结果图。
具体实施方式
实施例1制备金纳米壳层
(1)制备金纳米粒
将0.5ml 1M的氢氧化钠、12ml THPC和47.5ml水混合，制得THPC溶液；
边搅拌边将2.06mL的1wt％水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)迅速加入THPC溶液中，1分钟内可观察到覆盖层变为棕色，表明金纳米胶体的形成，然后将其在4℃下储存和陈化至少12小时后使用；
(2)制备功能化硅核
将0.5ml 2.5wt％的二氧化硅纳米球(120nm，天津达尔科技有限公司)与10ml乙醇混合，超声分散2min，使其均匀分散；然后加入150ul 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)，在90℃热处理3h，冷却至室温后以5000r/min离心10min，在乙醇中洗涤3次，最后用2ml乙醇重悬，制得；
(3)金纳米粒对硅核进行改性
将2ml金纳米粒、2ml功能化硅核和6ml水混合，室温下放置10min后转移到4℃放置至少24h，获得金粒-硅纳米球，最后对金粒-硅纳米球清洗3次，用2ml水重悬，制得；
(4)金纳米壳层的生长
将25mg碳酸钾溶于100ml去离子水中，再加入2ml的1wt％HAuCl4·3H2O水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)，混合，得无色溶液，接着置于4℃陈化至少24h，然后取8ml陈化后的溶液边搅拌边加入20ul步骤(3)所得物中，反应10min后，再将50μL甲醛(37％)作为还原剂慢慢补充到溶液中，继续搅拌24h，此时还原完全，制得金纳米壳层(即SiO2核/Au壳纳米材料)。
对上述制得的金纳米壳层进行扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和紫外-可见光(UV-vis)检测，检测结果见图2。其中，图2a为金纳米壳层(GNS)的扫描电镜(SEM)图，图2b为金纳米壳层(GNS)的透射电镜(TEM)图，图2c为金纳米壳层(GNS)的紫外-可见光吸收光谱图。
由图2a可知，金纳米壳层粒径分布均匀，尺寸约为120nm，与裸硅纳米粒子的表面光滑相比，其表面相对粗糙，这是由不同的金纳米粒子种子引发的颗粒塌陷造成的。
由图2b可知，TEM图像和EDX分析了O(天蓝色)、Si(红色)和Au(黄色)的元素分布，明确证明了核-壳结构的形成，核中含有丰富的Si和O元素，壳中含有丰富的Au元素，且壳厚约10nm。
由图2c可知，金纳米壳层纳米粒子的等离子体峰约为680nm，紫外吸收光谱约为270nm，其在680nm左右的紫外-可见光吸收峰也揭示了在绝缘芯结构上形成了金壳。
实施例2制备多孔硅纳米线
(1)预处理
将电阻率0.008-0.02Ω·cm的N型Si(100)晶片在氧化物腐蚀缓冲剂(如BOE(BufferedOxide Etch)，由氢氟酸(49％)与水或氟化铵与水混合而成)中浸泡2分钟用以去除自然氧化层；
(2)银沉积
取出预处理后的硅片后并将其浸泡于由4.8M氢氟酸(HF)和0.005M硝酸银(AgNO3)的组成的银沉积溶液中，浸泡时间为1分钟；
(3)刻蚀
用去离子水清洗沉积有银的硅片，除去多余的银离子，然后立即浸泡在由4.8M的HF和0.8M H2O2组成的浸蚀液中，浸泡时间为60min，然后再除去硅片表面的银，刻蚀时间里，硅片通过水可以彻底洗去表面的Ag和HF残留物，之后将硅片浸入浓硝酸(HNO3)，浸泡1h以便去除残留在硅片上沉积的Ag残基，进而得到纯硅纳米线。
本发明通过高氧化蚀刻工艺在硅纳米晶核上生成了非晶态SiO2层，使其具有亲水性，且在银催化溶液刻蚀过程中随着H2O2浓度的增加，硅纳米线的多孔性和一维特性得以实现，增大了其表面积，进而有利于增加与小分子代谢物的相互作用。在使用过程中，采用厘米大小的硅片便可以生产出数千个样本所需的毫米级别的纳米线溶液，大大降低了材料成本，更利于临床应用。
下面对上述制得的多孔硅纳米线进行扫描电镜(SEM)、透射电镜(TEM)和紫外-可见光(UV-vis)检测，检测结果见图3。其中，图3a为多孔硅纳米线(SiNW)的扫描电镜(SEM)图，图3a中的插图为多孔硅纳米线的透射电镜(TEM)图，图3b为多孔硅纳米线的紫外-可见光吸收光谱图。
由图3a可知，通过刻蚀时间控制纳米线长度，使其形成高密度的纳米线森林。
由图3a中的插图可知，单个硅纳米线在10nm区域具有不规则孔隙的多孔性。
由图3b可知，多孔硅纳米线在紫外区的广泛吸收可能是由于其广泛分布的临界尺寸的量子限制。
实施例3GNS作为基质进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测
一、检测血清中的小分子物质
实验组：在抛光钢靶板MTP384上滴加0.5uL的血清样本，风干后分别滴加1uL的金纳米壳层(GNS)纳米材料(金纳米壳层(GNS)纳米材料的浓度为1mg/ml)、1uL的多孔硅纳米线(将多孔硅纳米线超声振荡到去离子水中，使其浓度为1mg/ml)，待彻底干燥后上机，在Autoflex Max质谱仪(德国Bremen的Bruker Daltonics公司)上进行质谱检测，检测过程中使用smartbeam-II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。每个样本随机测量20个不同的点，每个点激光随机打点25次，因此可得到了500个满意的打点。具体检测方法示意图见图1。
对照组：将金纳米壳层(GNS)纳米材料替换为α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质，其他过程与实验组组相同。
SiO2核/Au壳纳米材料(GNS)作为基质在MALDI-TOF MS检测中的原理图见图2；其中图2中的SiNW(硅纳米线)也是一种基质。
SiO2核/Au壳纳米材料和多孔硅纳米线作为基质与血清样品混合后的典型LDI信号结果见图5；其中图5中曲线由下到上分别代表CHCA×10、GNS和SiNW。
由图5可知，混有GNS或SiNW的血清样品经质谱仪后在100-900Da的m/z处产生显著信号。而混有GNS的血清样品经质谱仪后，部分具体结果如下：葡萄糖(GLU)：m/z＝181.07[GLU+H]+；葡萄糖(GLU)：m/z＝203.05[GLU+Na]+；葡萄糖(GLU)：m/z＝219.026[GLU+K]+；尿酸(UA)：m/z＝169.035[UA+H]+；尿酸(UA)：m/z＝191.017[UA+Na]+；尿酸(UA)：m/z＝206.99[UA+K]+；肌酐(CRE)：m/z＝114.06[CRE+H]+；肌酐(CRE)：m/z＝136.048[CRE+Na]+；肌酐(CRE)：m/z＝152.02[CRE+K]+；部分结果见图6和图7。
与之相对的，直接将传统α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质和血清样本混合的混合物几乎没有获得任何信号，即使是扩大10倍也一样，这可能是由于脂质的干扰。尽管随着血清样本稀释超过50倍后使用CHCA的脂质干扰会减少，但在低丰度代谢物上产生信号将是一个挑战，这使得在健康人群和癌变样本之间产生可区分的m/z特征很难。
二、检测十种氨基酸混合物中的信号
按照上述实验组中的检测方法进行检测，其区别就是将血清样品换成十种混合氨基酸，浓度为200nM，具体氨基酸为Ser、Pro、Thr、Leu、Met、Lys、His、Phe、Try和Val，检测结果见图8。将上述氨基酸浓度更换成1000nM，其检测结果见图9。
由图8和图9可知，当采用本申请提供的基质进行MALDI-TOF MS检测时，可检测到混合氨基酸中的各小分子氨基酸，由此可知，本申请提供的基质能有效检测分子量小于1000Da的小分子物质。
三、检测四种氨基酸混合物中的信号
按照上述实验组中的检测方法进行检测，其区别就是将血清样品换成四种混合氨基酸，浓度为0.25μM，具体氨基酸为Met，Phe，Try和Thr，检测结果见图10。
将上述氨基酸浓度更换成2.5μM，其检测结果见图11；将上述氨基酸浓度更换成5μM，其检测结果见图12；将上述氨基酸浓度更换成25μM，其检测结果见图13。
由图10-13可知，当采用本申请提供的基质进行MALDI-TOF MS检测时，可检测到混合氨基酸中的各小分子氨基酸，由此可知，本申请提供的基质能有效检测分子量小于1000Da的小分子物质。
实施例4多孔硅纳米线作为基质进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测
一、检测血清中的小分子物质
实验组：在抛光钢靶板MTP384上滴加0.5uL的血清样本，风干后再滴加1uL的多孔硅纳米线(将多孔硅纳米线超声振荡到去离子水中，使其浓度为1mg/ml)，待彻底干燥后上机，在Autoflex Max质谱仪(德国Bremen的Bruker Daltonics公司)上进行质谱检测，检测过程中使用smartbeam-II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。每个样本随机测量20个不同的点，每个点激光随机打点25次，因此可得到了500个满意的打点。
对照组：将多孔硅纳米线替换为α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质，其他过程与实验组组相同。
混有GNS或SiNW的血清样品经质谱仪后在100-900Da的m/z处产生显著信号。而混有GNS的血清样品经质谱仪后，部分具体结果如下：葡萄糖(GLU)：m/z＝181.07[GLU+H]+；葡萄糖(GLU)：m/z＝203.05[GLU+Na]+；葡萄糖(GLU)：m/z＝219.026[GLU+K]+；尿酸(UA)：m/z＝169.035[UA+H]+；尿酸(UA)：m/z＝191.017[UA+Na]+；尿酸(UA)：m/z＝206.99[UA+K]+；肌酐(CRE)：m/z＝114.06[CRE+H]+；肌酐(CRE)：m/z＝136.048[CRE+Na]+；肌酐(CRE)：m/z＝152.02[CRE+K]+；部分结果见图14至图18。
与之相对的，直接将传统α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质和血清样本混合的混合物几乎没有获得任何信号，即使是扩大10倍也一样，这可能是由于脂质的干扰。尽管随着血清样本稀释超过50倍后使用CHCA的脂质干扰会减少，但在低丰度代谢物上产生信号将是一个挑战，这使得在健康人群和癌变样本之间产生可区分的m/z特征很难。二、检测十种氨基酸混合物中的信号
按照上述实验组中的检测方法进行检测，其区别就是将血清样品换成十种混合氨基酸，浓度为200nM，具体氨基酸为Ser、Pro、Thr、Leu、Met、Lys、His、Phe、Try和Val，检测结果见图19。将上述氨基酸浓度更换成1000nM，其检测结果见图20。
由图19和图20可知，当采用本申请提供的基质进行MALDI-TOF MS检测时，可检测到混合氨基酸中的各小分子氨基酸，由此可知，本申请提供的基质能有效检测分子量小于1000Da的小分子物质。
三、检测四种氨基酸混合物中的信号
按照上述实验组中的检测方法进行检测，其区别就是将血清样品换成四种混合氨基酸，浓度为0.25μM，具体氨基酸为Met，Phe，Try和Thr，检测结果见图21。将上述氨基酸浓度更换成2.5μM，其检测结果见图22。将上述氨基酸浓度更换成5μM，其检测结果见图23。将上述氨基酸浓度更换成25μM，其检测结果见图24。
由图21-24可知，当采用本申请提供的基质进行MALDI-TOF MS检测时，可检测到混合氨基酸中的各小分子氨基酸，由此可知，本申请提供的基质能有效检测分子量小于1000Da的小分子物质。
实施例5氧化铁纳米材料作为基质进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测
一、检测血清中的小分子物质
将氧化铁纳米材料(SEM图见图4)作为基质，用于基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测，具体实验过程如下：
实验组：在抛光钢靶板MTP384上滴加0.5uL的血清样本，风干后再滴加1uL的氧化铁纳米材料，待彻底干燥后上机，在Autoflex Max质谱仪(德国Bremen的Bruker Daltonics公司)上进行质谱检测，检测过程中使用smartbeam-II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。每个样本随机测量20个不同的点，每个点激光随机打点25次，因此可得到了500个满意的打点。
对照组：将氧化铁纳米材料替换为α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质，其他过程与实验组组相同。
混有氧化铁纳米材料的血清样品经质谱仪后在100-900Da的m/z处产生显著信号，部分具体结果如下：葡萄糖(GLU)：m/z＝181.07[GLU+H]+；葡萄糖(GLU)：m/z＝203.05[GLU+Na]+；葡萄糖(GLU)：m/z＝219.026[GLU+K]+；尿酸(UA)：m/z＝169.035[UA+H]+；尿酸(UA)：m/z＝191.017[UA+Na]+；尿酸(UA)：m/z＝206.99[UA+K]+；肌酐(CRE)：m/z＝114.06[CRE+H]+；肌酐(CRE)：m/z＝136.048[CRE+Na]+；肌酐(CRE)：m/z＝152.02[CRE+K]+；部分结果见图25-27。
与之相对的，直接将传统α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质和血清样本混合的混合物几乎没有获得任何信号，即使是扩大10倍也一样，这可能是由于脂质的干扰。尽管随着血清样本稀释超过50倍后使用CHCA的脂质干扰会减少，但在低丰度代谢物上产生信号将是一个挑战，这使得在健康人群和癌变样本之间产生可区分的m/z特征很难。
二、检测十种氨基酸混合物中的信号
按照上述实验组中的检测方法进行检测，其区别就是将血清样品换成十种混合氨基酸，浓度为200nM，具体氨基酸为Ser、Pro、Thr、Leu、Met、Lys、His、Phe、Try和Val，检测结果见图28。
将上述氨基酸浓度更换成1000nM，其检测结果见图29。
由图28和图29可知，当采用本申请提供的基质进行MALDI-TOF MS检测时，可检测到混合氨基酸中的各小分子氨基酸，由此可知，本申请提供的基质能有效检测分子量小于1000Da的小分子物质。
三、检测四种氨基酸混合物中的信号
按照上述实验组中的检测方法进行检测，其区别就是将血清样品换成四种混合氨基酸，浓度为0.25μM，具体氨基酸为Met，Phe，Try和Thr，检测结果见图30。将上述氨基酸浓度更换成2.5μM，其检测结果见图31。将上述氨基酸浓度更换成5μM，其检测结果见图32。将上述氨基酸浓度更换成25μM，其检测结果见图33。
由图30-33可知，当采用本申请提供的基质进行MALDI-TOF MS检测时，可检测到混合氨基酸中的各小分子氨基酸，由此可知，本申请提供的基质能有效检测分子量小于1000Da的小分子物质。
实施例6制备银纳米线材料
将0.170g AgNO3和10mL乙二醇在磁搅拌下溶解。然后逐滴加0.15M的PVP-40和0.111mM的CuCl2·2H2O(170.48)混合溶液(溶解在10mL乙二醇)之后，混合物转移到不锈钢高压釜(50毫升的容量)，在160℃加热3h。自然冷却到室温后，2500r/min离心5分钟，再用乙醇和去离子水清洗三次，将产物分散在乙醇中进行表征和应用。
对上述制得的银纳米线材料进行扫描电镜(SEM)和紫外-可见光(UV-vis)检测，检测结果见图34-35。其中，图34为银纳米线材料的扫描电镜(SEM)图；图35为银纳米线材料的紫外-可见光吸收光谱图。
由图34可知，银纳米线的直径约100nm，长度为5μm。
由图35可知，银纳米线的紫外-可见光吸收峰值在350nm和406nm处。
实施例7基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测
一、检测血清中的小分子物质
实验组：在抛光钢靶板MTP384上滴加0.5uL的混合氨基酸样本(浓度为200nM)，风干后再滴加1uL的银纳米线材料，银纳米线材料的浓度为1mg/ml，待彻底干燥后上机，在Autoflex Max质谱仪(德国Bremen的Bruker Daltonics公司)上进行质谱检测，检测过程中使用smartbeam-II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。每个样本随机测量20个不同的点，每个点激光随机打点25次，因此可得到了500个满意的打点。
对照组：将银纳米线材料替换为α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质，其他过程与实验组组相同。
银纳米线材料作为基质与混合氨基酸样品混合后的典型LDI信号结果见图36。
由图36可知，当采用银纳米球材料作为基质与混合氨基酸样品混合经MALDI-TOFMS检测后，部分检测结果如下：[Pro+H]+m/z＝116.13，[Ser+Na]+m/z＝128.09，[Ag+Na]+m/z＝130.86，[Leu+H]+m/z＝132.17，[Thr+Na]+m/z＝142.12，[His+H]+m/z＝156.15，[Thr+K]+m/z＝158.12，[Phe+H]+m/z＝166.19，[His+Na]+m/z＝178.15，[Tyr+H]+m/z＝182.19，[Phe+Na]+or[Met+K]+m/z＝188.19.12，[His+K]+m/z＝194.15。
实施例8制备银纳米球
(1)将新制备的48ml含(2mM)NaBH4和(4.28mM)柠檬酸三钠(TSC)的水溶液混合并加热至60℃，在黑暗中搅拌30分钟，确保溶液均匀；
(2)向步骤(1)所得物中滴入2mL的AgNO3溶液(1mM)，随后将温度提高到90℃，温度达到90℃时，使用0.1M的NaOH溶液调节溶液pH值为10.5，继续加热20分钟，直至出现明显的亮黄色；
(3)将步骤(2)所得物在室温下冷却，然后12000r/min离心15分钟，去除未反应的还原剂，洗涤三次，再在去离子水中分散，最后在4℃保存备用。
对上述制得的银纳米球进行表征检测，该银纳米球的粒径为5nm，其紫外-可见光吸收光谱图见图37。
由图37可知，银纳米球的紫外-可见光吸收峰值在399nm处。
实施例9制备银纳米球
取250ml AgNO3(1.06mM)，向其中加入5ml柠檬酸三钠(34mM)，然后在100℃回流搅拌，以330转/分钟的速度搅拌45分钟，直到回流溶液的颜色变成泥黄色，继续搅拌，使溶液降温至室温，并用0.2μm膜过滤器过滤，再用超纯水清洗和离心净化，最后用去离子水重悬，并存储在4℃黑暗环境下，以便进一步使用。
对上述制得的银纳米球进行表征检测，银纳米球的扫描电镜(SEM)图见图38，银纳米球的紫外-可见光吸收光谱图见图39。
由图38可知，该银纳米球的粒径为50nm，由图39可知，银纳米球的紫外-可见光吸收峰值在414nm处。
实施例10基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱检测
一、检测血清中的小分子物质
实验组：在抛光钢靶板MTP384上滴加0.5uL的混合氨基酸样本(浓度为200nM)，风干后再滴加1uL实施例1制得的银纳米球材料，银纳米球材料的浓度为1mg/ml，待彻底干燥后上机，在Autoflex Max质谱仪(德国Bremen的Bruker Daltonics公司)上进行质谱检测，检测过程中使用smartbeam-II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。每个样本随机测量20个不同的点，每个点激光随机打点25次，因此可得到了500个满意的打点。
对照组：将银纳米球材料替换为α-氰基-4-羟基苯丙烯酸(CHCA)基质，其他过程与实验组组相同。
银纳米球材料作为基质与混合氨基酸样品混合后的典型LDI信号结果见图40(实施例8)和41(实施例9)。
由图40可知，当采用实施例8制得的银纳米球材料作为基质与混合氨基酸样品混合经MALDI-TOF MS检测后，部分检测结果如下：[Pro+H]+m/z＝116.12，[Val+H]+m/z＝118.13，[Thr+H]+m/z＝120.12，[Ser+Na]+m/z＝128.09，[Ag+Na]+m/z＝130.86，[Leu+H]+＝132.11，[Thr+Na]+m/z＝142.11，[Met+H]+m/z＝150.08，[His+H]+m/z＝156.14，[Phe+H]+m/z＝166.19，[His+Na]+m/z＝178.13，[Tyr+H]+m/z＝182.02，[Met+K]+m/z＝188.15，[His+K]+m/z＝194.12。
由图41可知，当采用实施例41制得的银纳米球材料作为基质与混合氨基酸样品混合经MALDI-TOF MS检测后，部分检测结果如下：[Pro+H]+m/z＝116.13，[Val+H]+m/z＝118.15，[Thr+H]+m/z＝120.12，[Ser+Na]+m/z＝128.09，[Ag+Na]+m/z＝130.86，[Thr+Na]+m/z＝142.12，[Ser+K]+m/z＝144.09，[His+H]+m/z＝156.15，[Phe+H]+m/z＝166.19，[His+Na]+m/z＝178.15，[Tyr+H]+m/z＝182.19，[His+K]+m/z＝194.15。由此可知，银纳米球材料作为基质，可检测小于1000Da的小分子代谢物信号，尤其是m/z小于100的小分子代谢物信号。

Claims (10)

1.一种基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将含小分子代谢物的样品滴加到MALDI-TOF MS的金属靶片上，风干；
将纳米材料分散到去离子水中形成纳米材料均相溶液；所述纳米材料为SiO2核/Au壳纳米材料、多孔硅纳米线、氧化铁纳米材料、金纳米颗粒、金纳米簇、银纳米线和银纳米球中的至少一种；
将纳米材料均相溶液滴加到风干后的样品上，继续风干后进行MALDI-TOF MS检测，检测过程中使用smartbeam-II激光器在355nm的反射正模式下获取光谱，激光频率为1000hz。
2.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，纳米材料均相溶液中纳米材料的浓度为0.8-1.5mg/ml，纳米材料均相溶液和含小分子代谢物的样品的体积比为1-4:1。
3.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，纳米材料均相溶液中纳米材料的浓度为1mg/ml，纳米材料均相溶液和含小分子代谢物的样品的体积比为2:1。
4.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，小分子代谢物为体液中分子量小于1000的物质。
5.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，检测过程中每个样本随机测量20个不同的点，每个点激光随机打点25次。
6.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，SiO2核/Au壳纳米材料通过以下方法制备得到：
(1)制备金纳米粒
边搅拌边将水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)加入THPC溶液中，然后置于4℃陈化12-16h，制得金纳米粒；
(2)制备功能化硅核
将二氧化硅纳米球与乙醇混合，超声分散均匀；
将超声分散液与3-氨丙基三乙氧基硅烷混合，在85-95℃热处理2-4h，然后冷却至室温，离心，洗涤，重悬，制得；
(3)金纳米粒对硅核进行改性
将金纳米粒、功能化硅核和水按体积比为1-2:1-2:2-5混合，室温下放置8-12min，再于4℃放置24-28h，最后清洗，重悬，制得；
(4)金纳米壳层的生长
将碳酸盐溶液和水合氯金酸(HAuCl4·3H2O)混合，得无色溶液，接着置于4℃陈化24-28h，然后边搅拌边将陈化后的溶液加入步骤(3)所得物中，反应8-15min后再加入还原剂，继续搅拌至还原完全，制得SiO2核/Au壳纳米材料。
7.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，多孔硅纳米线通过以下方法制备得到：
(1)预处理：除去硅片表面的氧化层；
(2)银沉积：将预处理后的硅片浸泡于含银液体中进行银沉积；
(3)刻蚀：用去离子水清洗沉积有银的硅片，然后在浸蚀液中浸泡50-70min，然后再除去硅片表面的银，制得硅纳米线。
8.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，银纳米线通过以下方法制备得到：将银溶液和乙二醇分散均匀，然后加入PVP-40和CuCl2·2H2O，置于150-170℃加热反应2-4h，冷却至室温后，离心，清洗，制得。
9.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，银纳米球通过以下方法制备得到：将含银的盐溶液搅拌加热至沸腾，然后加入还原剂进行回流反应，制得。
10.根据权利要求1所述的基于纳米材料辅助MALDI-TOF MS进行液体活检的方法，其特征在于，银纳米球通过以下方法制备得到：将含硼氢化钠的柠檬酸溶液滴加到含银的盐溶液中，在85-95℃下反应，反应过程中控制体系pH值为10-11，反应完全后，冷却，离心，清洗，制得。
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