一种铁氧化物基质、制备及其在脑脊液质谱分析中的应用
技术领域
本发明涉及质谱检测领域,尤其涉及一种铁氧化物基质及其在脑脊液质谱分析中的应用。
背景技术
基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS)是近年来发展起来的一种新型的软电离生物质谱,主要通过对样品离子的质荷比(m/z)的分析而实现对样品进行精准定性和定量。MALDI-MS采用软电离技术,引入的基质与样品能形成共结晶薄膜。在激光照射下,基质将激光能量传递给待测样品分子,能大大提升样品的离子化碎裂程度,不但可直接应用于混合物的分析,也可用来检测样品中是否含有杂质及杂质的分子量。其准确度高达0.1%~0.01%,远远高于目前常规应用的生化、高效凝胶色谱等技术。目前可测定生物大分子的分子量高达600KDa,由于其可检测的分子量范围大,扫描速度快,分辨率、灵敏度高,仪器结构简单等显著优点,在生命科学中的诸多前沿领域,如蛋白组学、药物分析等,均得到广泛的应用。
但是,基质辅助激光解析电离飞行时间质谱也有局限:用MALDI质谱进行小分子(m/z<1000)的分析通常会受到限制。这是因为传统的有机基质如a-氰基-4-羟基肉桂酸(CHCA)2,5-二羟基苯甲酸(DHB)等,在低质量范围内会出现大量的背景基质质谱信号,严重干扰测定小分子的测定。此外,对于简单的标准样品体系,MALDI-MS的检测限尚可达到10-15~10-18,但在如脑脊液等生物样品中,还含有大量蛋白质、盐类等干扰物,极大影响了待测样品离子化效率。
脑脊液由脑室中的脉络丛产生,与血浆和淋巴液的性质相似,为无色透明的液体,充满在各脑室、蛛网膜下腔和脊髓中央管内。正常脑脊液具有一定的化学成分和压力,对维持颅压的相对稳定有重要作用。患中枢神经系统疾病时,常常要作腰椎穿刺吸取脑脊液检查,以协助诊断。脑脊液的性状和压力受多种因素的影响,若中枢神经系统发生病变,神经细胞的代谢紊乱,将使脑脊液的性状和成分发生改变;若脑脊液的循环路径受阻,颅内压力将增高。目前,脑脊液的检测已成为重要的临床辅助诊断手段之一。正常成年人的脑脊液约100~150毫升。传统的脑脊液临床生化检测方法对脑脊液样本的消耗量较大,对本就分泌量小的脑脊液做到精确的疾病检测而言无疑是一个巨大的挑战。
开发在低质量范围内无干扰或低背景干扰的新型基质,用于生物样品以及活体样品中的代谢小分子分析已成为破解代谢组学奥秘、准确提供疾病病理依据的当务之急。目前,为了提高检测的准确性和灵敏性,人们做了大量的工作,例如,高耐盐性、低背景干扰的有机盐基质盐酸萘乙二胺可以与葡萄糖等小分子形成氯离子加合物,从而可以在MALDI质谱负离子模式下进行检测。结合活体微透析技术,利用该基质可实现不同生理模型下鼠脑透析液中的葡萄糖的活体监测。或以无机基质代替传统的有机基质,如碳粉、二氧化硅、贵金属纳米颗粒等,均取得了一定效果。
尽管新型基质的研究已渐成热点,但目前尚没有一种基质能够集制备过程简单、尺寸均一、分散性好、背景噪声小、增强效果好、可用于精准定量等优点于一身。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明提供了一种铁氧化物纳米颗粒基质,并将其应用于定性定量分析脑脊液的成分,尤其是小分子的代谢物。
本发明的技术方案如下:
一种铁氧化物基质,所述铁氧化物基质为纳米球形颗粒,所述纳米球形颗粒的尺寸小于1μm,颗粒粒度均一,所述纳米球形颗粒具有粗糙表面。粗糙的表面、稳定的结构、较大的表面积对于增强小分子解析离子化效果有非常重要的作用。
进一步地,所述纳米球形颗粒的尺寸范围为200nm~300nm。
进一步地,所述粗糙表面由50nm以下的纳米小球组成,优选地,其直径为5nm~8nm。
进一步地,铁氧化物为Fe2O3、Fe3O4或其混合物。
一种铁氧化物基质的制备方法,包括以下步骤:
第一步:以乙二醇为溶剂,制备氯化铁及柠檬酸三钠溶液;
第二步:将醋酸钠加入上述溶液,并在室温下超声至溶液呈均相分散;
第三步:将第二步中得到的混合溶液移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢水热反应釜,并保持200℃下反应10小时,以形成铁氧化物纳米颗粒;
第四步:用乙醇和去离子水反复洗涤第三步中得到的铁氧化物纳米颗粒,于60℃下干燥成粉末状;
第五步:将所述铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中,作为基质使用。
所述铁氧化物基质在脑脊液质谱分析中的应用,包括以下步骤:
第一步:仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;采用脉冲电场延时提取及反射的工作方式,正离子模式进行检测;
第二步:根据权利要求5所述的方法制备铁氧化物纳米颗粒基质;
第三步:制备脑脊液样品;
第四步:将所述铁氧化物纳米颗粒基质与所述脑脊液样品复合质谱分析;
第五步:利用内标物质进行定量分析。
进一步地,须使用洁净的靶板,所述靶板依次用甲酸、无水乙醇、去离子水超声清洗共1.5小时。
进一步地,第四步中,将所述铁氧化物纳米颗粒基质在去离子水中超声震荡溶解,当所述脑脊液样品干燥后,在所述脑脊液样品表面滴加基质的水溶液,所述脑脊液样品与所述铁氧化物纳米颗粒基质形成二次重结晶。
进一步地,所述激光解析电离质谱仪为AB SCIEX TOF/TOFTM5800质谱仪,采用Nd:YAG激光器,波长为355nm。
进一步地,采用DataExplorer进行数据的分析处理。
利用上述铁氧化物纳米颗粒可精准定量脑脊液中分子含量。根据人脑脊液中小分子质谱峰和内标物小分子同位素质谱峰强度比,已知小分子同位素浓度,二者为线性关系,故可求得人脑脊液中小分子浓度。
上述铁氧化物纳米颗粒作为基质能够对脑脊液中代谢小分子解析离子化效果选择性地增强。可用于分子量为100Da~10000Da的分子检测,包括小肽段、核苷酸单体、氨基酸、糖类、脂类或药物小分子等。
本发明的优点在于:
灵敏度提高:有效排除有机基质的背景噪声干扰,实现对小分子物质的精准识别。
耐盐性、耐蛋白性良好:有效去除复杂的人脑脊液体系中含量较高的盐类、蛋白大分子等的影响。
样本消耗量少:仅消耗纳升数量级的脑脊液样本即可得到其分子指纹图谱,传统的生化检测方法需2.5微升~40微升,而本发明能将脑脊液样品量降至纳升级别。
操作简便:实验中无需对样品进行任何预处理,操作便捷,提供了高效、简便的检测方法。
定量精准:量化结果与传统的生化检测方法(临床金标)差别很小。
以下将结合附图对本发明作进一步说明,以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1是本发明较优实施例中制备得到的铁氧化物纳米颗粒的表征图片,图1a为TEM表征图片,图1b为SEM表征图片;
图2是以本发明较优实施例中制备得到的铁氧化物纳米颗粒为基质检测甘露醇标准品得到的质谱图;
图3是以本发明较优实施例中制备得到的铁氧化物纳米颗粒为基质检测脑脊液成分的质谱图,图3a为不使用任何基质的质谱图,图3b为使用传统基质CHCA的质谱图,图3c为使用铁氧化物纳米颗粒为基质的质谱图;
图4是以本发明较优实施例中制备得到的铁氧化物纳米颗粒为基质检测脑脊液中葡萄糖水平与使用生化定量法的比较结果。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。
铁氧化物基质的制备方法,包括以下步骤:
第一步:以乙二醇为溶剂,制备氯化铁及柠檬酸三钠溶液;
第二步:将醋酸钠加入上述溶液,并在室温下超声至溶液呈均相分散;
第三步:将第二步中得到的混合溶液移至聚四氟乙烯衬里的不锈钢水热反应釜,并保持200℃下反应10小时,以形成铁氧化物纳米颗粒;
第四步:用乙醇和去离子水反复洗涤第三步中得到的铁氧化物纳米颗粒,于60℃下干燥成粉末状。
表征所用的仪器:
产物的尺寸和形貌表征在JEOL JEM-2100F透射电镜(TEM),JEOL JEM-2100F高分辨透射电镜(HRTEM)以及Hitachi S-4800扫描电镜(SEM)上完成。
表征结果为:
典型铁氧化物纳米颗粒的粒度均一,平均直径约为250nm。高分辨扫描电镜结果显示颗粒表面粗糙不光滑。透射电镜结果表明表面的粗糙由直径约为5-8nm的纳米小球组成。
实施例1 检测葡萄糖标准品
利用铁氧化物纳米颗粒基质对人脑脊液进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱检测的步骤如下:
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。采用AB SCIEX TOF/TOFTM5800质谱仪,Nd:YAG激光器,波长为355nm。采用脉冲电场延时提取及反射的工作方式,正离子模式进行检测。采用DataExplorer观察、处理、分析数据,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析。
(2)铁氧化物纳米颗粒的制备。
(3)铁氧化物纳米颗粒与甘露醇分子复合质谱分析复合质谱分析。
(4)依次用甲酸、无水乙醇、去离子水超声清洗MALDI靶板共1.5小时。
(5)在干燥的MALDI靶板上点样品。
(6)铁氧化物纳米颗粒在去离子水中超声震荡分散,当样品干燥后,在样品表面滴加基质混悬液,样品与基质形成二次重结晶。
(7)干燥后,用于激光解析离子化质谱分析。
实施例2 检测甘露醇标准品
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;
(2)铁氧化物纳米颗粒的制备;
(3)铁氧化物纳米颗粒与甘露醇分子复合质谱分析。
具体步骤与实施例1类似,此处不再赘述。
实施例3 检测纤维二糖标准品
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;
(2)铁氧化物纳米颗粒的制备;
(3)铁氧化物纳米颗粒与纤维二糖分子复合质谱分析。
具体步骤与实施例1类似,此处不再赘述。
实施例4 检测谷氨酸标准品
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;
(2)铁氧化物纳米颗粒的制备;
(3)铁氧化物纳米颗粒与谷氨酸分子复合质谱分析。
具体步骤与实施例1类似,此处不再赘述。
实施例5 检测苯丙氨酸标准品
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;
(2)铁氧化物纳米颗粒的制备;
(3)铁氧化物纳米颗粒与苯丙氨酸分子复合质谱分析。
具体步骤与实施例1类似,此处不再赘述。
实施例6 检测脑脊液样品
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;
(2)铁氧化物纳米颗粒的制备;
(3)脑脊液样品的制备;
(4)铁氧化物纳米颗粒与脑脊液样品复合质谱分析。
具体步骤与实施例1类似,此处不再赘述。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。