CN106338543A - 一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法。该方法一方面能够在质谱分析中快速、高效的使用极少量的生物样品实现待测分子的定性与定量检测;同时可以去除传统基质所带来的强烈背景噪声干扰,有效的对目标体系中的分子进行离子化,从而达到更好的检测效果。以上方法可以实现特异性检测指定类别分子,排除其他分子干扰并具有一定的耐盐性,适用于生物体液体系的检测。本发明作为一种快速高效的检测手段,其所带来的极少的样品消耗,有利于生物样品库的微型化,值得推广和应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种基于基质辅助激光解析电离质谱的分子检测应用技术,具体涉及其在乳品检测中的应用。
背景技术
基质辅助激光解析电离质谱作为一种新型的软电离生物样品分析方式,能够对不同分子量级别的物质进行分析。它代表了一种简单,快速,精准的方式,能够同时对多种生物分子进行检测。这种方法的有效性不仅在理论上,也在实际应用中得到了应证。仪器核心部分主要包括基质辅助激光解析电离离子源(MALDI)和质量分析器。在MALDI中,当激光照射在基质和分析物形成的共结晶上时,基质将吸收绝大多数的激光能量,然后将能量传递给分析物。在此过程中将会有质子转移到分析物或者有质子从分析物中脱离出来以促使分析物形成带电离子,完成电离过程。在检测器中,实验通过测定带电离子的质荷比(m/z)确定待测物质的分子量,并据此用来鉴定不同的物质。MALDI MS所具有的独特优势使其广泛应用于细胞组学,蛋白组学,基因组学的研究当中。
1988年,Tanaka和Hillenkamp各自提出了MALDI技术,这种方法的成功之处是在质谱中引入了基质(Matrix)。在MALDI MS中,基质起着吸收、传递激光能量、使样品离子化的决定性作用,而且辅助基质的引入还解决了非挥发性和热不稳定性的生物大分子在质谱中的解吸离子化问题,使其能被成功检测。目前,市场上出售的常用基质为α—氰基—4—羟基肉桂酸(CHCA)、2,5—二羟基苯甲酸(DHB)、芥子酸(SA)、纳米硅膜、类金刚石材料及其衍生物等。基质的存在对于能量传递以及保持分子的完整性及其重要,但基质的引入不可避免地导致了低分子量区域内基质峰的存在,因此大大限制了该方法在小分子分析中的应用。因此,基质种类的选择,浓度的大小,样品和基质的比例大小等选择因素使样品制备更加复杂,很难实现对小分子化合物的快速分析。
如上所述,传统的基质容易在小分子量端(m/z<1000)产生背景噪声,对于小分子的检测带来极大的干扰。且在实际的生物体系当中,生物样品通常十分复杂。各种生物大分子的存在,以及不同的酸碱度,含盐量都会对小分子的检测带来阻碍。因此传统的基质难以满足对于小分子检测的需求,一种新型的可以用于生物体系检测,且具有一定的抗干扰和一定的耐盐性的基质材料亟待开发。
乳品例如母乳对于新生儿的生长十分重要,对于母乳成分的分析也被广泛开展。这些研究大多集中在生物大分子(如蛋白质)的分析上。与此同时,母乳中小分子的研究却一直受到阻碍。传统的分析方法如生化法和电喷雾电离质谱(ESI)因为其繁杂的样品预处理方法难以实现对于小分子快速高效的检测。同时,现在普遍使用的方法中单次检测通常需要毫升级别的样品量,这对于小分子的检测都带来了极大的障碍。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明提供了一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,可以克服传统基质的不足,直接分析乳品例如母乳体系中的分子,包括小分子,能够对乳品成分进行定性和定量的分析。同时,很大程度上削减了乳品样品的用量,对于生物样品库的建立以及微型化有着很大的促进作用。
本发明的技术方案如下:
一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,包括以下步骤:
步骤1:仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱,正离子检测,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;
步骤2:制备铁氧化物纳米颗粒基质;
步骤3:制备乳品样品,分别取不同比例稀释后的乳品溶液点样在靶板上,室温下干燥;
步骤4:在所述乳品样品上点所述铁氧化物纳米颗粒基质,室温下干燥;
步骤5:用同位素作为内标物,对所述乳品样品中的小分子进行定量分析;
步骤6:对质谱检测结果进行分析,得出结论。
进一步地,所述铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤:
步骤1:三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中;
步骤2:在上述的混合溶液中加入乙酸钠,并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系;
步骤3:反应在铁氟龙高压反应釜中进行,在200摄氏度下反应10小时以形成铁氧化物纳米颗粒;
步骤4:将步骤3中得到的铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗,最后在60摄氏度下干燥以备使用;
步骤5:将所述铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中,作为基质使用。
进一步地,所述铁氧化物纳米颗粒基质的直径小于1μm,颗粒粒度均一,所述铁氧化物纳米颗粒基质具有粗糙表面,对紫外激光有吸收作用。
进一步地,所述铁氧化物纳米颗粒基质为Fe2O3、Fe3O4或其混合物。
进一步地,所述铁氧化物纳米颗粒基质的尺寸范围为200nm~300nm。
进一步地,所述铁氧化物纳米颗粒基质的所述粗糙表面由50nm以下的纳米小球组成。
进一步地,所述铁氧化物纳米颗粒基质的所述粗糙表面由直径为5nm~8nm的纳米小球组成。
进一步地,对乳品的稀释倍数小于10000倍以得到所述乳品样品。
进一步地,所述乳品包括母乳、牛乳或羊乳及奶制品。
进一步地,检测分子量范围为小于等于10000Da,包括糖类分子、氨基酸等。
本发明的优点在于:
可以一定程度上排除其他生物分子的干扰,选择性的检测特定生物分子,且避免了基质带来的强背景噪声。
基质成本低,可以大批量制作:基质易于合成,可以大批量制作。
基质重现性好,高耐盐性:样品点与点之间的重复性良好,且基质在高盐的情况下依旧能高效的离子化目标分析物。
乳品检测预处理简单,易于操作:如母乳的检测中只需要通过一定比例的稀释,不需要其他的预处理过程,极大地简化了检测过程。
用量极少:选择合适的稀释比例情况下,只需要极少的样本用于检测,极大促进了生物样品库微型化的进展。
整个过程快速高效:整个检测过程,只需要几分钟就可以得到最后的检测结果。
以下将结合附图对本发明作进一步说明,以充分说明本发明的目的、技术特征和技术效果。
附图说明
图1为本发明较优实施例中制备得到的铁氧化物纳米颗粒的表征图片,图1a为SEM表征图片,图1b为TEM表征图片;
图2为葡萄糖标准品的质谱检测结果(葡萄糖峰值:m/z 203[M+Na]+和m/z219[M+K]+);
图3为母乳中部分分子的质谱检测结果(乳糖峰值:m/z 365[M+Na]+and m/z381[M+K]+)。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本发明进行进一步描述。
铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤:
步骤1:三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中;
步骤2:在上述的混合溶液中加入乙酸钠,并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系;
步骤3:反应将在铁氟龙高压反应釜中进行,在200摄氏度下反应10小时以形成铁氧化物纳米颗粒;
步骤4:将步骤3中得到的铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗,最后在60摄氏度下干燥以备使用;
步骤5:将铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中,作为基质使用。
基质的表征:
表征所用仪器有:透射电镜(TEM)成像在JEOL JEM-2100F仪器上进行;扫描电镜(SEM)在Hitachi S-4800仪器上进行;动态光散射(DLS)测量在MalvernZetasizer Nano ZS仪器上进行;接触角测试在EasyDrop设备上进行。
表征结果为:
通过SEM图像可以看出铁氧化物纳米颗粒基质粒径分布均一,平均粒径在250nm左右。DLS的测量结果为276nm,与之前的SEM结果相一致。根据DLS的测量,颗粒的多分散系数为0.121,证明颗粒具有较好的溶解性和稳定性。接触角测试结果为21.2°,证明该材料具有亲水性表面。最后通过TEM图像可以看出,含粒子由尺寸在5~8nm的极小的纳米颗粒组成,其稳定的结构和独特的表面特性都有利于在生物样品中的分子检测。
下面通过几个典型的应用实施实例来进一步阐明基质辅助激光解析电离质谱在乳品检测体系当中的应用。
实施例1:葡萄糖标准品的检测
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪;采用反射模式,正离子检测,去离子水仪器Millipore Milli-Q system。
(2)对样品进行比例稀释。
(3)在质谱靶板上进行样品制备,室温下干燥。
(4)利用内标法对葡萄糖分子进行定量分析。
实施例2:乳糖标准品的检测
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪;采用反射模式,正离子检测,去离子水仪器Millipore Milli-Q system。
(2)对样品进行比例稀释。
(3)在质谱靶板上进行样品制备,室温下干燥。
(4)利用内标法对乳糖分子进行定量分析。
实施例3:半乳糖标准品的检测
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪;采用反射模式,正离子检测,去离子水仪器Millipore Milli-Q system。
(2)对样品进行比例稀释。
(3)在质谱靶板上进行样品制备,室温下干燥。
(4)利用内标法对半乳糖分子进行定量分析。
实施例4:亮氨酸标准品的检测
(1)仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱仪;采用反射模式,正离子检测,去离子水仪器Millipore Milli-Q system。
(2)对样品进行比例稀释。
(3)在质谱靶板上进行样品制备,室温下干燥。
(4)利用内标法对亮氨酸分子进行定量分析。
实施例5:母乳中小分子的定性检测
(1)仪器与试剂的准备:AB 5800MALDI TOF质谱仪,氮激光器,波长355nm,采用反射模式,正离子检测;去离子水仪器Millipore Milli-Q system。数据分析软件Data Explore;图标绘制软件Origin Pro8。
(2)对母乳按比例进行稀释。
(3)分别取不同稀释比例后的母乳溶液0.5ul,点样在MALDI靶板上用于检测。
(4)用同位素作为内标物,对母乳体系中的小分子进行定量分析。
(5)在MALDI靶板上点上样品,室温下干燥。
(6)在样品上点铁氧化物纳米颗粒基质,室温下干燥。
(7)对质谱检测结果进行分析,得出结论。
以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解,本领域的普通技术无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此,凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案,皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。
Claims (10)
1.一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,包括以下步骤:
步骤1:仪器与试剂的准备:激光解析电离质谱,正离子检测,只有信噪比大于10的质谱信号用于分析;
步骤2:制备铁氧化物纳米颗粒基质;
步骤3:制备乳品样品,分别取不同比例稀释后的乳品溶液点样在靶板上,室温下干燥;
步骤4:在所述乳品样品上点所述铁氧化物纳米颗粒基质,室温下干燥;
步骤5:用同位素作为内标物,对所述乳品样品中的小分子进行定量分析;
步骤6:对质谱检测结果进行分析,得出结论。
2.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,所述铁氧化物纳米颗粒基质的制备包括以下步骤:
步骤1:三氯化铁和柠檬酸三钠溶解在乙二醇溶液中;
步骤2:在上述的混合溶液中加入乙酸钠,并在室温下超声半小时直到溶液变成均相体系;
步骤3:反应在铁氟龙高压反应釜中进行,在200摄氏度下反应10小时以形成铁氧化物纳米颗粒;
步骤4:将步骤3中得到的铁氧化物纳米颗粒用乙醇和去离子水反复冲洗,最后在60摄氏度下干燥以备使用;
步骤5:将所述铁氧化物纳米颗粒重悬在去离子水中,作为基质使用。
3.根据权利要求1或2所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,所述铁氧化物纳米颗粒基质的直径小于1μm,颗粒粒度均一,所述铁氧化物纳米颗粒基质具有粗糙表面。
4.根据权利要求1或2所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,所述铁氧化物纳米颗粒基质为Fe2O3、Fe3O4或其混合物。
5.根据权利要求1或2所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,所述铁氧化物纳米颗粒基质的尺寸范围为200nm~300nm。
6.根据权利要求3所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,所述铁氧化物纳米颗粒基质的所述粗糙表面由50nm以下的纳米小球组成。
7.根据权利要求3所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,所述铁氧化物纳米颗粒基质的所述粗糙表面由直径为5nm~8nm的纳米小球组成。
8.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,对乳品的稀释倍数小于10000倍以得到所述乳品样品。
9.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,所述乳品包括母乳、牛乳、羊乳及奶制品。
10.根据权利要求1所述的一种利用基质辅助激光解析电离质谱检测乳品的方法,其特征在于,检测分子量范围为小于等于10000Da。
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