CN114621456B

CN114621456B - 金属有机骨架纳米材料、方法、应用和检测利血平的方法

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Publication number: CN114621456B
Application number: CN202210253370.0A
Authority: CN
Inventors: 曾羲; 刘春生; 江继军; 王宇; 曾正; 钱振杰; 戚平
Original assignee: Guangzhou Food Inspection Center (guangzhou Liquor Testing Center)
Current assignee: Guangzhou Food Inspection Center (guangzhou Liquor Testing Center)
Priority date: 2022-03-15
Filing date: 2022-03-15
Publication date: 2023-03-24
Anticipated expiration: 2042-03-15
Also published as: CN114621456A

Abstract

本发明属于质谱分析检测技术领域，具体是涉及一种金属有机骨架纳米材料、方法、应用和检测利血平的方法，所述金属有机骨架纳米材料以铜为骨架，有机配体为2,2‑二甲基‑4,4‑联苯二羧酸，分子式为Cu₃(C₃₂H₂₈O₁₁)，比表面积为1000～1100m²/g，微孔孔容为0.4～0.5cm³/g，微孔直径为1.0～1.5nm，本发明实现对利血平的定量检测，检测准确度高。

Description

金属有机骨架纳米材料、方法、应用和检测利血平的方法

技术领域

本发明属于质谱分析检测技术领域，具体是涉及一种金属有机骨架纳米材料、方法、应用和检测利血平的方法。

背景技术

目前对保健食品中非法添加物的检测方法有薄层层析法(TLC)、液相色谱法(HPLC)和液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)，这些方法前处理复杂、检测时间长、基质效应明显、易出现假阳性等问题。基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)因其高灵敏度、高离子化效率、高通量、检测时间短等优点被广泛应用于多肽、蛋白质、聚合物、多糖、核酸、脂质等的分析检测。但目前常用的传统基质如芥子酸(SA)、α-氰基-4-羟基肉桂酸(HCCA)和2,5-二羟基苯甲酸(DHB)在小分子量区域(<700Da)因自身分子碎裂峰、聚合峰、加钠峰和加钾峰等而产生较多碎片，严重限制了MALDI-TOF MS在小分子化合物分析检测的应用。

针对MALDI-TOF MS传统基质在小分子分析检测的限制，近年来石墨烯纳米材料、石墨碳氮、金属有机骨架材料等均受到较高关注并用于MALDI的新基质，以增加小分子的信噪比。如Liu等合成石墨烯纳米材料作为基质用于分析测定黄酮类化合物(Liu C W,ChienM W,Su C Y,et al.Analysis of flavonoids by graphene-based surface-assistedlaser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry.Analyst,2012,137(24):5809-5816.)，Lin等合成石墨碳氮化合纳米片作为基质用于分析测定污水中1-硝基芘(Lin Z A,Zheng J N,Lin G,et al.Negative Ion Laser Desorption/IonizationTime-of-Flight Mass Spectrometric Analysis of Small Molecules Using GraphiticCarbon Nitride Nanosheet Matrix,Analytical Chemistry,2015,87:8005-8012.)，李等合成介孔沸石材料作为基质用于测定氟喹诺酮类兽药小分子(m/z<500Da)化合物(李鹏.基于介孔沸石材料新型MALDI基质研究及其在小分子化合物定量分析的应用[M].中国农业科学院,北京.)，Chen等(Chen L F,Ou J J,Wang H W,et al.Tailor-Made Stable Zr(IV)-Based Metal-Organic Frameworks for Laser Desorption/Ionization MassSpectrometry (LDI-MS)Analysis of Small Molecules and Simultaneous Enrichmentof Phosphopeptides,ACS Applied Materials&Interfaces,2016,8(31):20292-20300.)以金属有机骨架材料作为基质测定小肽、氨基酸、天然产物等小分子化合物。周焕英等(CN110694589 A)利用金属有机骨架-硅基复合材料对小分子污染物、药物和盐类进行分析筛查，但是此材料合成复杂，在合成了铝金属有机骨架纳米材料的基础上，进一步连接硅基，增加了合成的难度，且基质与待测液的用料比较大(体积比)约为1:1，且仅适用于液体样品。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种金属有机骨架纳米材料、方法、应用和检测利血平的方法，实现对利血平的定量检测，检测准确度高。

本发明的内容包括一种金属有机骨架纳米材料，所述金属有机骨架纳米材料以铜为骨架，有机配体为2,2-二甲基-4,4-联苯二羧酸，分子式为Cu₃(C₃₂H₂₈O₁₁)，比表面积为1000～1100m²/g，微孔孔容为0.4～0.5cm³/g，微孔直径为1.0～1.5nm。

本发明提供一种金属有机骨架纳米材料的制备方法，步骤为，

1)将有机配体、金属铜盐和反应溶剂混合均匀(混合均匀的方法优选为超声)后，加热(加热的温度优选为80-85℃，加热时间为48-72h)，得到粗品；

2)将粗品洗涤，干燥(干燥方式优选为55℃真空干燥)后，得到金属有机骨架纳米材料。

优选地，所述金属铜盐为硝酸铜，一般为Cu(NO₃)₂·2.5H₂O；或者，所述反应溶剂为N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、甲醇、水和乙二醇。

优选地，有机配体和金属铜盐的重量比为1:1～2；有机配体和反应溶剂的重量体积比为1g:0.577-0.738mL。

优选地，N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、甲醇、水和乙二醇的体积比为：(0.28～0.31)：(0.19～0.22)：(0.07～0.11)：(0.10～0.20)：(0.007～0.008)。

优选地，将粗品洗涤的洗涤剂为N,N-二甲基乙酰胺和甲醇，优选为先用N,N-二甲基乙酰胺洗涤，再用甲醇洗涤。

本发明提供一种所述金属有机骨架纳米材料作为基质在检测利血平中的应用，检测的样品可以为保健食品等。

优选地，检测的步骤为，将基质溶液和样品溶液不同时(即有先后顺序)滴加至靶板上，先滴加的溶液干燥后，再将另一个溶液滴加覆盖至靶板上，干燥；干燥后的样品进行MALDI-TOF MS检测分析；

所述基质溶液为溶解有金属有机骨架纳米材料的溶液，金属有机骨架纳米材料的浓度优选为1.0～10.0mg/mL，优选采用超声方式促使其溶解。

所述样品溶液为溶解有样品的溶液，样品和溶剂的重量体积比优选为0.2～1g：10～50mL。

优选地，所述基质溶液和样品溶液的溶剂为甲醇水溶液，甲醇和水的体积比优选为40～60：60～40。

优选地，步骤为，基质溶液先滴加至靶板上，干燥，然后样品溶液再滴加覆盖至靶板上，干燥，干燥后的样品进行MALDI-TOF MS检测分析。

另一种实施例可以为，部分基质溶液先滴加至靶板上，干燥，然后样品溶液再滴加覆盖至靶板上，最后剩余的基质溶液滴加至靶板上。

还有一种实施例为，样品溶液先滴加至靶板上，干燥，然后基质溶液再滴加覆盖至靶板上，干燥，干燥后的样品进行MALDI-TOF MS检测分析。

利血平标准溶液中利血平的浓度为10～100ng/mL。

优选地，MALDI-TOF MS检测分析方法为：电喷雾电离(ESI)源，波长为337nm，反射线性正离子模式，采集范围为160～3580Da，激光强度为60％，光谱响应强度叠加次数为5～20次。

具体步骤如图5所示，所述基质样品制备方法包括：

1)配制基质溶液

金属有机骨架纳米材料用甲醇-水(50:50)振荡、超声溶解备用。

2)配制利血平标准溶液

利血平标准物质用甲醇振荡溶解并定容于10mL容量瓶中，得到浓度为1mg/mL的标准储备液，于-18℃避光贮存。分别精密量取上述储备液0.1mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容，得到10μg/mL的中间标准溶液。临用时将上述混合标准溶液用甲醇-水(40～60：60～40)液稀释至100ng/mL，分别移取适量100ng/mL标准溶液配制成质量浓度为10、20、40、60、80和100ng/mL的标准曲线，利血平的标准曲线图如图1所示。

3)样品前处理

固体或半固体：准确称取0.2～1.0g样品，加入甲醇-水(40～60：60～40)溶液定容至10～50mL，超声提取10min，经8000r/min离心3min后取上清液上机测定。

液体：准确称取0.2～1.0g样品，加入甲醇-水(40～60：60～40)溶液定容至10～50mL，超声提取10min后上机测定。

优选地，采用甲醇-水比例为50:50，提取效果佳。

4)用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱仪对步骤3)所得测试液进行测定，以步骤2)所得标准溶液建立校正曲线，外标法定量。采用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱测定，根据叠加峰面积和浓度建立校正曲线。

其中，基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱检测条件如下：

电喷雾电离(ESI)源，波长为337nm，反射线性正离子模式，采集范围为160～3580Da，激光强度为30～80％，光谱响应强度叠加次数为5～20次。

基于金属有机骨架纳米材料基质分析利血平标准物质MALDI-TOF MS图如图2所示。

在称取0.2g样品，甲醇-水比例为50:50，定容体积为10ml，激光强度为60％，光谱响应叠加次数为20次的情况下，加标回收结果见表1。

表1 标准曲线、相关系数、相对偏差和检出限

本发明的有益效果是，本方法提供一种金属有机骨架纳米材料作为基质快速筛查保健食品中非法添加利血平的方法，对样品进行简单的前处理，以金属有机骨架纳米材料为基质，筛查时不需要使用标准物质，检测时间段，仅需0.3s，可消除样品基质效应对标准物质的影响和干扰，可有效抑制背景噪声，显著提高利血平的信噪比(S/N)，实现对保健食品中非法添加利血平的快速筛查。

本发明采用标准溶液外标法进行初步定量，利用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱灵敏度高的优势，可消除样品的基质效应对标准物质的影响和干扰。

本发明使用的靶板为384ground(或polished)steel，一次最多可筛查检测384个样品，能满足应急抽检、日常检验等大批量、多批次保健食品中利血平的筛查检测。

本发明在检测时，在靶板上先后沉淀基质和样品，而不是将基质和样品混合后再滴加至靶板上，或者先滴加样品，再滴加基质；操作更方便，检测结果更准确。

本发明采用金属有机骨架纳米材料作为基质材料，相对于传统基质材料，其可以定量测定利血平，背景噪声低，检测更灵敏。

附图说明

图1为利血平的标准曲线图；

图2为基于金属有机骨架纳米材料基质分析利血平标准物质MALDI-TOF MS图；

图3为金属有机骨架纳米材料晶体样品图；

图4为金属有机骨架材料结构示意图；

图5为基于金属有机骨架纳米材料的样品基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱分析方法示意图；

图6为金属有机骨架纳米材料基质与传统基质HCCA和SA的背景峰质谱对比图；

图7为金属有机铜骨架纳米材料(MOF4)基质与实施例1中基质对利血平的MALDI-TOFMS测定对比图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明的技术目的、技术方案和优点，现结合附图与具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1

一种金属有机骨架纳米材料的制备方法，步骤为，

将20mg有机配体2,2-二甲基-4,4-联苯二甲酸，23mg Cu(NO₃)₂·2.5H₂O加入20mL玻璃瓶中，再按顺序加入6mL N,N-二甲基乙酰胺，4mL乙醇，2mL甲醇，4mL水，0.15mL乙二醇，超声5分钟；将上述样品于85℃烘箱加热48h，降至室温，得到微孔金属有机骨架纳米材料的粗产品；

将所得粗产品用N,N-二甲基乙酰胺洗涤6～9次，再用甲醇洗涤6～9次，在55℃下进行真空干燥12h，得到蓝色细颗粒状的金属有机骨架纳米材料晶体，其晶体样品图如图3所示，结构示意图如图4所示，测量其比表面积为1085m²/g，微孔孔容为0.48cm³/g，微孔直径为1.36nm。

实施例2

基于金属有机纳米骨架材料的利血平质谱分析方法：

1.配制1.0mg/mL的金属有机纳米骨架材料的甲醇-水(50:50)混合溶剂，为基质溶液；

2.将上述基质溶液于常温超声5min，形成均匀的体系溶液；

3.配制10～100ng/mL的利血平标准溶液作为标准品；

4.称取保健酒0.2g，加入甲醇-水(40:60)定容至10ml，涡旋，取上清液，作为样品；

5.将0.5μL样品液滴加至靶板上，自然干燥，再将0.5μL基质溶液滴加覆盖至靶板上，自然干燥；

6.将干燥的样品点采用电喷雾电离(ESI)源，波长337nm，反射线性正离子模式，采集范围为160～3580Da，激光强度为30％，光谱响应强度叠加次数为5次进行MALDI-TOF MS检测分析。

分析方法示意图如图5所示。

分析结果，由图2可见，利血平标准物质可以被MALDI-TOF MS很好地检测到，其中利血平m/z为609.184([M+H]⁺)、631.164([M+Na]⁺)和647.155([M+K]⁺)等3种形式存在。相关系数为0.981，加标量为0.75μg/g时，加标回收率为65.7％，相对标准偏差为10.2％；加标量为2.0μg/g时，加标回收率为73.3％，相对标准偏差为9.5％；加标量为4.0μg/g时，加标回收率为89.2％，相对标准偏差为5.3％，以上结果说明该金属有机骨架纳米材料能很好地适用于利血平的MALDI-TOF MS分析方法。

实施例3

基于金属有机纳米骨架材料的利血平质谱分析方法：

1、配制4.0mg/mL的金属有机纳米骨架材料的甲醇-水(50:50)混合溶剂，为基质溶液；

2、将上述基质溶液于常温超声8min，形成均匀的体系溶液；

3、配制10～100ng/mL的利血平标准溶液作为标准品；

4、称取固体硬胶囊内容物0.5g，加入甲醇-水(50:50)定容至25ml，涡旋，离心，取上清液，作为样品；

5、将1.0μL基质溶液滴加至靶板上，自然干燥，再将1.0μL样品液滴加覆盖至靶板上，自然干燥；

6、将干燥的样品点采用电喷雾电离(ESI)源，波长337nm，反射线性正离子模式，采集范围为160～3580Da，激光强度为60％，光谱响应强度叠加次数为10次进行MALDI-TOFMS检测分析。

分析结果，由图2可见，利血平标准物质可以被MALDI-TOF MS很好地检测到，其中利血平m/z为609.184([M+H]⁺)、631.164([M+Na]⁺)和647.155([M+K]⁺)等3种形式存在。相关系数为0.993，加标量为0.75μg/g时，加标回收率为85.9％，相对标准偏差为9.7％；加标量为2.0μg/g时，加标回收率为90.1％，相对标准偏差为6.4％；加标量为4.0μg/g时，加标回收率为96.3％，相对标准偏差为4.9％，以上结果说明该金属有机骨架纳米材料能很好地适用于利血平的MALDI-TOF MS分析方法。

实施例4

基于金属有机纳米骨架材料的利血平质谱分析方法：

1、配制10.0mg/mL的金属有机纳米骨架材料的甲醇-水(50:50)混合溶剂，为基质溶液；

2、将上述基质溶液于常温超声10min，形成均匀的体系溶液；

3、配制10～100ng/mL的利血平标准溶液作为标准品；

4、称取半固体软胶囊内容物1.0g，加入甲醇-水(60:40)定容至50ml，涡旋，离心，取上清液，作为样品；

5、将0.75μL基质溶液滴加至靶板上，自然干燥，再将1.5μL样品液滴加覆盖至靶板上，自然干燥，最后将0.75μL基质溶液滴加覆盖至样品上；

6、将干燥的样品点采用电喷雾电离(ESI)源，波长337nm，反射线性正离子模式，采集范围为160～3580Da，激光强度为80％，光谱响应强度叠加次数为20次进行MALDI-TOFMS检测分析。

分析结果，由图2可见，利血平标准物质可以被MALDI-TOF MS很好地检测到，其中利血平m/z为609.184([M+H]⁺)、631.164([M+Na]⁺)和647.155([M+K]⁺)等3种形式存在。相关系数为0.990，加标量为0.75μg/g时，加标回收率为75.2％，相对标准偏差为10.4％；加标量为2.0μg/g时，加标回收率为88.4％，相对标准偏差为7.9％；加标量为4.0μg/g时，加标回收率为91.8％，相对标准偏差为6.3％，以上结果说明该金属有机骨架纳米材料能很好地适用于利血平的MALDI-TOF MS分析方法。

对比例1

和实施例4相比，对比例1的区别在于采用常规的传统基质HCCA替代金属有机骨架纳米材料基质，其他和实施例4相同。

对比例2

和实施例4相比，对比例2的区别在于采用常规的传统基质SA替代金属有机骨架纳米材料基质，其他和实施例4相同。

金属有机骨架纳米材料基质与传统基质HCCA和SA的背景峰质谱对比图如图6所示(MOF10为本申请的基质)。

在对传统基质HCCA和SA的空白基质响应值叠加20次，测得背景噪声达10⁶，而在同样条件下，金属有机骨架纳米材料基质的背景噪声仅为10⁴，比传统基质背景噪声低2个数量级，且在低分子量区域(<700Da)处干扰峰明显少于传统基质。

对比例3

和实施例4相比，对比例3的区别在于采用合成的另一种金属有机铜骨架纳米材料(MOF4)基质替代实施例1中金属有机骨架纳米材料基质，其他和实施例4相同。

金属有机铜骨架纳米材料(MOF4)基质的制备方法和实施例1相比，区别在于以3-吡啶-4-基-苯甲酸为有机配体，其他和实施例1相同。

此种金属有机铜骨架纳米材料(MOF4)基质与实施例1中基质对利血平的MALDI-TOF MS测定图谱对比图如图7所示。图7中从上到下顺序依次为MOF4测定利血平质谱图、MOF4空白基质图、MOF10空白基质图、MOF10测定利血平质谱图。

MOF4和MOF10的空白基质在600～660Da处的背景噪声均较低，且MOF4在该分子区域的背景噪声为MOF10的1/2，但对利血平进行分析测定时，MOF10金属有机骨架纳米材料可以检测到609.184([M+H]⁺)、631.164([M+Na]⁺)和647.155([M+K]⁺)等3种形式的目标峰，而MOF4金属有机铜骨架纳米材料基质却无法检测到利血平的目标峰。说明本专利申请的MOF10基质作为MALDI-TOF MS的基质时，不仅背景噪声低，并且能实现对利血平的定量定性分析测定。

对比例4

和实施例3相比，区别在于：步骤5为，将2.0μL基质溶液和2.0μL样品液混合后，移取2.0μL滴加至靶板上，自然干燥。其他和实施例3相同。

其相关系数为0.935；加标量为0.75μg/g时，加标回收率为59.7％，相对标准偏差为11.7％；加标量为2.0μg/g时，加标回收率为72.9％，相对标准偏差为13.1％；加标量为4.0μg/g时，加标回收率为81.5％，相对标准偏差为7.9％。

本发明可有效消除基质效应的影响，能快速筛查保健食品中非法添加的利血平检测，本方法的相关系数达0.99以上，确保了筛查结果的准确性，具有极大的推广意义。

本发明样品前处理操作简便、快速，无需使用标准物质定量。本发明采用金属有机纳米骨架材料作为检测基质，利用MALDI-TOF MS反射线性正离子模式检测利血平的质荷比(m/z)，再以[M+H]⁺作为定量离子，计算测定结果。本发明填补了现有的基质和检测方法无法同时测定保健食品中小分子非法添加利血平的空白。

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本申请的保护范围限于这些例子；在本申请的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本申请中一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本申请中一个或多个实施例旨在涵盖落入本申请的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本申请中一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种金属有机骨架纳米材料作为基质在检测利血平中的应用，其特征是，所述金属有机骨架纳米材料以铜为骨架，有机配体为2, 2-二甲基-4,4-联苯二羧酸，分子式为Cu₃(C₃₂H₂₈O₁₁)，比表面积为1000~1100 m²/g，微孔孔容为0.4~0.5 cm³/g，微孔直径为1.0~1.5nm；

金属有机骨架纳米材料的制备方法的步骤为，

1）将有机配体、金属铜盐和反应溶剂混合均匀后，加热，得到粗品；

2）将粗品洗涤，干燥后，得到金属有机骨架纳米材料；

所述金属铜盐为硝酸铜；有机配体和金属铜盐的重量比为1:1~2。

2.如权利要求1所述的应用，其特征是，所述反应溶剂为N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、甲醇、水和乙二醇。

3.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，有机配体和反应溶剂的重量体积比为1mg:0.577-0.738mL。

4.如权利要求3所述的应用，其特征是，N,N-二甲基乙酰胺、乙醇、甲醇、水和乙二醇的体积比为：（0.28~0.31）：（0.19~0.22）：（0.07~0.11）：（0.10~0.20）：（0.007~0.008）。

5.如权利要求1或2所述的应用，其特征是，将粗品洗涤的洗涤剂为N,N-二甲基乙酰胺和甲醇。

6.一种检测利血平的方法，其特征是，步骤为，将基质溶液和样品溶液不同时滴加至靶板上，先滴加的溶液干燥后，再将另一个溶液滴加覆盖至靶板上，干燥；干燥后的样品进行MALDI-TOF MS 检测分析；

所述基质溶液为溶解有如权利要求1所述应用中的金属有机骨架纳米材料的溶液，所述样品溶液为溶解有样品的溶液。

7.如权利要求6所述的方法，其特征是，基质溶液先滴加至靶板上，干燥，然后样品溶液再滴加覆盖至靶板上。

8.如权利要求7所述的方法，其特征是，部分基质溶液先滴加至靶板上，干燥，然后样品溶液再滴加覆盖至靶板上，最后剩余的基质溶液滴加至靶板上。