CN110437301A - 一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，属于蛋白提取领域。本发明通过优化蛋白提取的全流程，包括使用高通量组织研磨仪对样本进行湿磨、通过自行配制的提取液对样本进行蛋白提取、样品湿磨后置于冰上裂解等过程，建立了一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，可以成功提取绝大部分的环境类样本和粪便类样本，提取的蛋白质得率更高，纯度更好，条带更清晰丰富，对于后续质谱鉴定具有显著的优势。本发明解决了目前对自然环境中采集的样品由于含有许多干扰物质，蛋白质提取困难，且处理步骤会造成蛋白的进一步损失的问题。
Description
技术领域
本发明涉及蛋白提取领域，特别是涉及一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法。
背景技术
由于环境样品中欲测成分浓度低、组分复杂、干扰物质多、受环境影响作用明显，通常需要采用复杂的提取、纯化、浓缩等处理技术才能对欲测组分进行测定。环境样品按形态通常分为水样、土壤和沉积物、大气样品和生物样品。环境样品的研究意义体现在功能性生物指标的开发、追踪新的功能基因和复杂的代谢途径和从功能角度重新审视微生物生态学概念。随着人为活动的影响，引起全球变化对环境质量的影响。
蛋白质组学是高通量、系统化的研究某一类型微生物、细胞、组织等样品中所有蛋白质的学科，不仅能够提供蛋白质定量数据，还能提供定位和修饰的信息。2004年，根据宏基因组和蛋白质组概念，Rodriguez提出宏蛋白质组是环境混合微生物群落中所有蛋白质的总和。宏蛋白质组学则是在特定的时间对微生物群落的所有蛋白质组成进行大规模鉴定。宏蛋白质组学更加适用于复杂的生物系统研究中，由于蛋白质本身的复杂性，鉴定出的蛋白质不再被分为单个物种或生物体。运用宏蛋白质组学方法是能够表征环境质量的动态变化和可持续性的可识别的功能性生物指标。而宏蛋白提取作为宏蛋白质组学中至关重要的第一步，具有决定性作用，关乎最终结果的准确性和可靠性。
自然环境中采集的样品由于含有许多干扰物质，这些干扰物质会妨碍SDS-PAGE图像分析和质谱前处理步骤，因此如何去除这些干扰物是宏蛋白质组分析的前提。对于土壤样品来说，苯酚提取对去除干扰物质(如腐殖酸)和解决污染物共同提取的问题是最有效的，避免了蛋白质与腐殖质的共同提取，但萃取过程中，蛋白质主要位于水相，腐殖质主要位于酚相，而土壤中含有大量的蛋白质-腐殖质复合体，在移去水相的过程会导致这些蛋白质丢失。而通过使用苯酚/甲醇提取法无法得到足够的蛋白沉淀，过夜沉淀后的溶液仍然很澄清，离心后蛋白沉淀非常少。
有研究表明，蛋白质在萃取和苯酚纯化后可以在乙酸铵甲醇溶液中沉淀。当提取土壤蛋白质时，TCA沉淀期间大分子的蛋白质可能会丢失，沉淀效率约为15％，与酚提取相比，更多的是小分子蛋白质的沉淀。尽管TCA被认为是一种有效的沉淀剂，但TCA沉淀后蛋白难以再溶解，因此在用裂解液复溶沉淀蛋白时会有较大的损失，而甲醇与丙酮的清洗等步骤使蛋白更加纯净但会损失很多高分子量的蛋白。该方法对特定种类的蛋白有偏好性，对杂质较多的蛋白提取效果较差，冷丙酮沉淀时间过短会使蛋白沉淀不完全，时间过长会导致蛋白降解。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是目前对自然环境中采集的样品由于含有许多干扰物质，蛋白质提取困难，且处理步骤会造成蛋白的进一步损失，而提供一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：提供一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，该提取方法包括如下步骤：
(1)配制提取缓冲液；
(2)称取样品按质量比1：3比例加入步骤(1)所配制的提取缓冲液混合，进行三次研磨过程，得复研磨料；
(3)将复研磨料置于冰上，裂解，得裂解料；
(4)取步骤(3)所得裂解料用冷冻离心，收集上清；
(5)取上清加入酚，涡旋振荡，振荡期间间歇放于冰上保持，得处理液；
(6)取处理液冷冻离心，得酚相；
(7)取酚相与酚相等体积提取缓冲液混合，涡旋振荡，振荡期间间歇放于冰上保持；
(8)取经步骤(7)处理的酚相冷冻离心，获得二次处理酚相；
(9)取二次处理酚相按1：4的体积比加入沉淀剂，冷藏，得含有沉淀蛋白的混合液；
(10)取步骤(9)所得混合液冷冻离心，弃上清，收集离心物A；
(11)取离心物A按1：4的体积比加入清洗液，涡旋分散，得分散液；
(12)取分散液冷冻离心，弃上清，收集离心物B；
(13)连续重复步骤(11)、(12)两次，收集沉淀风干，得干燥物；
(14)取干燥物按1：5的比例加入蛋白裂解液，涡旋震荡溶解，得溶解物；
(15)取溶解物超声波处理，冰上裂解20min，得复裂解料；
(16)取复裂解料冷冻离心，取上清保存，即得该样本的宏蛋白。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(1)中的提取缓冲液的配制：所述步骤(1)中的提取缓冲液的配制：按质量份数计，取28～32份的乙二胺四乙酸(EDTA)、36～40份硼砂、15～20份VitaminC、295～300份蔗糖(Sucrose)、10～14份Tris碱(TrisBase)、0.5～2份聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、13～17份二硫苏糖醇(DTT)、1000～1200份水混合，调节pH至8.0，即得提取缓冲液。
在本发明上述技术方案中，作为优选，所述TritonX-100、DTT在使用前0～12h配制，并在所述提取缓冲液使用前加入蛋白酶抑制剂PIcocktail混合。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(2)中的所述研磨过程为：以6m/s研磨30s后，移至冰上保持5min。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(5)中的酚为与上清等体积、pH值为8.0的Tris-饱和酚。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(5)中的震荡间歇为涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(9)中的沉淀剂为经预冷的浓度为0.1M的乙酸铵甲醇溶液，相比于使用TCA沉淀蛋白更加充分，得率更高。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(11)中的清洗液为按质量份数计，取1～2份NaCl、1000～1100份丙酮溶液混合，预冷，即得清洗液。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(14)中的蛋白裂解液为质量分数为1％的十二烷基硫酸钠溶液或浓度8M的尿素溶液。
在本发明上述技术方案中，所述步骤(15)中的超声波处理的过程包括：超声功率为10％-20％，超声时间为5.5s，间隔时间9.9s；冰上裂解期间每5～10min涡旋混悬一次。
本发明的有益效果是：本发明通过优化蛋白提取的全流程，建立了一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，可以成功提取绝大部分的环境类样本和粪便类样本，提取的蛋白质得率更高，纯度更好，条带更清晰丰富，对于后续质谱鉴定具有显著的优势。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图，其中：
图1是以本发明实施例1所得宏蛋白经SDS-PAGE电泳分析所得图谱；
图2是以TCA-丙酮法提取所得宏蛋白经SDS-PAGE电泳分析所得图谱；
图3是以NoviPure土壤总蛋白提取试剂盒提取所得宏蛋白经SDS-PAGE电泳分析所得图谱。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，包括如下步骤：
(1)配制提取缓冲液；
(2)称取样品转移至组织研磨管中，按质量比1:3比例加入步骤(1)所配制的提取缓冲液混合，移至MP组织研磨仪，以6m/s的速度研磨30s后，移至冰上保持5min，以此为一个研磨过程，进行三次此研磨过程，得复研磨料，本发明使用高通量组织研磨仪对样本进行湿磨，相比于使用NoviPure提取试剂盒，节省了成本；
(3)将复研磨料置于冰上，裂解30min，得裂解料，本发明使用高通量组织研磨仪湿磨以后，于冰上放置30min，最终得出的条带更加清晰丰富；
(4)取步骤(3)所得裂解料用冷冻离心机于4～8℃，以12000g离心20min，收集上清；
(5)取上清加入与上清等体积的、pH值为8.0的Tris-饱和酚，涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min，得处理液；
(6)取处理液用冷冻离心机于4～8℃，以12000g离心20min，获得酚相；
(7)取酚相至新的离心管内，加入与酚相等体积提取缓冲液，用vortex涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min；
(8)取经步骤(7)处理的酚相用冷冻离心机于4～8℃，以12000g重力离心20min，获得二次处理酚相；
(9)取二次处理酚相至新的离心管中，并按1：4的体积比加入预冷的0.1M乙酸铵甲醇溶液，移至-20℃冰箱冷藏12～20h，得含有沉淀蛋白的混合液，该步骤相比于使用TCA作为沉淀剂，使用乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白更加充分；
(10)取步骤(9)所得混合液于冷冻离心机于4～8℃，以12000g重力离心20min，弃上清，收集离心物A；
(11)取离心物A按1：4的体积比加入清洗液，涡旋30s使沉淀完全分散，得分散液；
(12)取分散液用冷冻离心机于4～8℃，以12000g离心20min，弃上清，收集离心物B；
(13)连续重复步骤(11)、(12)两次，收集沉淀于通风橱风干，得干燥物；
(14)取干燥物按1：5的比例加入蛋白裂解液，涡旋震荡至沉淀溶解，得溶解物；
(15)取溶解物于超声波细胞破碎仪在冰上超声2min，冰上裂解20min，得复裂解料；
(16)取复裂解料用冷冻离心机于4～8℃，以12000g重力离心20min，取上清保存，即得该样本的宏蛋白。
所述步骤(1)中的提取缓冲液的配制：所述步骤(1)中的提取缓冲液的配制：按质量份数计，取28～32份的乙二胺四乙酸(EDTA)、36～40份硼砂、15～20份VitaminC、295～300份蔗糖(Sucrose)、10～14份Tris碱(TrisBase)、0.5～2份聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、13～17份二硫苏糖醇(DTT)、1000～1200份水混合，调节pH至8.0，即得提取缓冲液。
所述TritonX-100、DTT在使用前0～12h配制，并在所述提取缓冲液使用前加入蛋白酶抑制剂PIcocktail混合。
所述步骤(2)中的所述研磨过程为：以6m/s研磨30s后，移至冰上保持5min。
所述步骤(5)中的酚为与上清等体积、pH值为8.0的Tris-饱和酚。
所述步骤(5)中的震荡间歇为涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min。
所述步骤(9)中的沉淀剂为经预冷的浓度为0.1M的乙酸铵甲醇溶液，相比于使用TCA沉淀蛋白更加充分，得率更高。
所述步骤(11)中的清洗液为按质量份数计，取1～2份NaCl、1000～1100份体积分数为90％的丙酮溶液混合，预冷，即得清洗液。
所述步骤(14)中的蛋白裂解液为质量分数为1％的十二烷基硫酸钠溶液或浓度8M的尿素溶液。
所述步骤(15)中的超声波处理的过程包括：超声功率为10％-20％，超声时间为5.5s，间隔时间9.9s；冰上裂解期间每5～10min涡旋混悬一次。
实施例1
一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，包括如下步骤：
(1)配制提取缓冲液；
(2)称取样品转移至组织研磨管中，按质量比1:3比例加入步骤(1)所配制的提取缓冲液混合，移至MP组织研磨仪，以6m/s的速度研磨30s后，移至冰上保持5min，以此为一个研磨过程，进行三次此研磨过程，得复研磨料，本发明使用高通量组织研磨仪对样本进行湿磨，相比于使用NoviPure提取试剂盒，节省了成本；
(3)将复研磨料置于冰上，裂解30min，得裂解料，本发明使用高通量组织研磨仪湿磨以后，于冰上放置30min，最终得出的条带更加清晰丰富；
(4)取步骤(3)所得裂解料用冷冻离心机于5℃，以12000g离心20min，收集上清；
(5)取上清加入与上清等体积的、pH值为8.0的Tris-饱和酚，涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min，得处理液；
(6)取处理液用冷冻离心机于5℃，以12000g离心20min，获得酚相；
(7)取酚相至新的离心管内，加入与酚相等体积提取缓冲液，用vortex涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min；
(8)取经步骤(7)处理的酚相用冷冻离心机于4～8℃，以12000g重力离心20min，获得二次处理酚相；
(9)取二次处理酚相至新的离心管中，并按1：4的体积比加入预冷的0.1M乙酸铵甲醇溶液，移至-20℃冰箱冷藏14h，得含有沉淀蛋白的混合液，该方案相比于使用TCA作为沉淀剂，使用乙酸铵甲醇溶液沉淀蛋白更加充分；
(10)取步骤(9)所得混合液于冷冻离心机于5℃，以12000g重力离心20min，弃上清，收集离心物A；
(11)取离心物A按1：4的体积比加入清洗液，涡旋30s使沉淀完全分散，得分散液；
(12)取分散液用冷冻离心机于5℃，以12000g离心20min，弃上清，收集离心物B；
(13)连续重复步骤(11)、(12)两次，收集沉淀于通风橱风干，得干燥物；
(14)取干燥物按1：5的比例加入蛋白裂解液，涡旋震荡至沉淀溶解，得溶解物；
(15)取溶解物于超声波细胞破碎仪在冰上超声2min，冰上裂解20min，得复裂解料；
(16)取复裂解料用冷冻离心机于5℃，以12000g重力离心20min，取上清保存，即得该样本的宏蛋白。
所述步骤(1)中的提取缓冲液的配制：所述步骤(1)中的提取缓冲液的配制：按质量份数计，取30份的乙二胺四乙酸(EDTA)、38份硼砂、17份VitaminC、298份蔗糖(Sucrose)、12份Tris碱(TrisBase)、1份聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、15份二硫苏糖醇(DTT)、1100份水混合，调节pH至8.0，即得提取缓冲液。
所述TritonX-100、DTT在使用前5h配制，并在所述提取缓冲液使用前加入蛋白酶抑制剂PIcocktail混合。
所述步骤(2)中的所述研磨过程为：以6m/s研磨30s后，移至冰上保持5min。
所述步骤(5)中的酚为与上清等体积、pH值为8.0的Tris-饱和酚。
所述步骤(5)中的震荡间歇为涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min。
所述步骤(9)中的沉淀剂为经预冷的浓度为0.1M的乙酸铵甲醇溶液，相比于使用TCA沉淀蛋白更加充分，得率更高。
所述步骤(11)中的清洗液为按质量份数计，取1.2份NaCl、1000份体积分数为90％的丙酮溶液混合，预冷，即得清洗液。
所述步骤(14)中的蛋白裂解液为质量分数为1％的十二烷基硫酸钠溶液。
所述步骤(15)中的超声波处理的过程包括：超声功率为13％，超声时间为5.5s，间隔时间9.9s；冰上裂解期间每6min涡旋混悬一次。
对比例1：以TCA-丙酮法提取样品中的宏蛋白，具体包括如下步骤：
1.取1g样品放入1.5ml离心管中，加入1ml碱性SDSbuffer混匀；
2.漩涡震荡并超声破碎，沸水浴10min，使细胞充分裂解，并使蛋白酶失活；
3.将盖打开使蒸汽挥发，冷却5min；
4.漩涡震荡3min，2095g离心10min后转移上清到新的离心管；
5.于步骤4中加入1～4℃的质量分数100％的三氯乙酸(TCA)，使终浓度达到25％，轻轻翻转离心管，于4℃冰箱冷藏8～12h，出现沉淀蛋白；
6.以2080g重力离心20min收集蛋白沉淀,蛋白沉淀用预冷至-10℃的丙酮重悬清洗，以2080g重力离心10min收集蛋白沉淀，共洗涤3遍；
7.收集洗涤后的蛋白沉淀在空气中干燥，并使丙酮完全挥发，然后沉淀用含有50ul胍的质量分数为4％的SDS溶液溶解，于60℃震荡孵育60min；
8.将经步骤7所得蛋白经BCA测定浓度，并进行SDS-PAGE电泳分析。
对比例2、以NoviPure土壤总蛋白提取试剂盒提取样品中的宏蛋白，具体包括如下步骤：
1、取5g样本加入50mlNoviPureBeadTube，置于冰上，加预冷的SP1；
2、于步骤1所得溶液中加入DTT溶液，震荡混匀于冰上孵育10min；
3、冰上孵育后采用高速震荡混匀仪在4℃以最高速震荡10min；
4、于4℃快速离心3200g重力30s，使样品沉淀到管底，放置于冰上加入1.5ml预冷的SP2，震荡混匀，冰上孵育30min；
5、步骤4中的冰上孵育后采用MP高速震荡混匀仪在4℃最高速震荡10min；于4℃，3200g重力离心10min，用移液器将上清转到50ml离心管中，大约10ml；
6、溶解样品为液态后置于冰上，于4℃以3200g重力离心20min；
7、弃去上清，加入1ml预冷的丙酮，完全重悬蛋白沉淀，共洗涤3遍；
8、于4℃以20000g重力离心5min，吸弃丙酮后，置于通风橱中干燥沉淀，将干燥的沉淀冻存在-20℃；
9、用300μl浓度8M的尿素裂解液溶液震荡悬浮5min，离心取上清；
10、收集上清测定浓度后SDS-PAGE电泳，考染。
采用实施例1、对比例2、对比例3对某一环境类的样本-土壤污泥进行检测，所得检测结果如图1～3所示：
可知：本发明的技术方案提取的蛋白质得率更高，纯度更好，条带更清晰丰富，对于后续质谱鉴定具有显著的优势。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
Claims (10)
1.一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，该提取方法包括如下步骤：
(1)配制提取缓冲液；
(2)称取样品按质量比1：3比例加入步骤(1)所配制的提取缓冲液混合，进行三次研磨过程，得复研磨料；
(3)将复研磨料置于冰上，裂解，得裂解料；
(4)取步骤(3)所得裂解料冷冻离心，收集上清；
(5)取上清加入酚，涡旋振荡，振荡期间间歇放于冰上保持，得处理液；
(6)取处理液冷冻离心，得酚相；
(7)取酚相与酚相等体积提取缓冲液混合，涡旋振荡，振荡期间间歇放于冰上保持；
(8)取经步骤(7)处理的酚相冷冻离心，获得二次处理酚相；
(9)取二次处理酚相按1：4的体积比加入沉淀剂，冷藏，得含有沉淀蛋白的混合液；
(10)取步骤(9)所得混合液冷冻离心，弃上清，收集离心物A；
(11)取离心物A按1：4的体积比加入清洗液，涡旋分散，得分散液；
(12)取分散液冷冻离心，弃上清，收集离心物B；
(13)连续重复步骤(11)、(12)两次，收集沉淀风干，得干燥物；
(14)取干燥物按1：5的比例加入蛋白裂解液，涡旋震荡溶解，得溶解物；
(15)取溶解物超声波处理，冰上裂解，得复裂解料；
(16)取复裂解料冷冻离心，取上清保存，即得该样本的宏蛋白。
2.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(1)中的提取缓冲液的配制：按质量份数计，取28～32份的乙二胺四乙酸(EDTA)、36～40份硼砂、15～20份VitaminC、295～300份蔗糖(Sucrose)、10～14份Tris碱(TrisBase)、0.5～2份聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)、13～17份二硫苏糖醇(DTT)、1000～1200份水混合，调节pH，即得提取缓冲液。
3.根据权利要求2所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述TritonX-100、DTT在使用前0～12h配制，并在所述提取缓冲液使用时加入蛋白酶抑制剂PIcocktail混合。
4.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(2)中的所述研磨过程为：以6m/s研磨30s后，移至冰上保持5min。
5.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中的酚为与上清等体积、pH值为8.0的Tris-饱和酚。
6.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(5)中的震荡间歇为涡旋振荡10min，期间每振荡3min置于冰上放置2min。
7.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(9)中的沉淀剂为经预冷的乙酸铵甲醇溶液。
8.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(11)中的清洗液为按质量份数计，取1～2份NaCl、1000～1100份丙酮溶液混合，预冷，即得清洗液。
9.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(14)中的蛋白裂解液为质量分数为1％的十二烷基硫酸钠溶液或浓度8M的尿素溶液。
10.根据权利要求1所述的适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法，其特征在于，所述步骤(15)中的超声波处理的过程包括：超声功率为10％～20％，超声时间为5.5s，间隔时间9.9s；所述冰上裂解期间每5～10min涡旋混悬一次。
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