CN111320668A - 一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明的目的是提供一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，包括将所述脂肪组织用镊子夹取放入到1.5ml离心管中，然后在1.5ml离心管中加入100mg蛋白提取粉和50ul所述第一缓冲液的步骤；充分研磨和混合的步骤；离心处理步骤和在保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的步骤；本发明的目的是提供一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，采用离心管柱为表面具有孔径结构的离心管柱，操作简单，蛋白质获得率高。
Description
技术领域
本发明涉及细胞生命科学技术领域，尤其涉及一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法。
背景技术
脂肪组织主要由脂肪细胞组成。脂肪细胞质内充满脂肪滴，胞质位于细胞边缘成一薄层，核亦被挤到细胞的边缘，压成扁形。脂肪组织特别是白色脂肪组织除了具有能量储存功能外，还与内分泌和器官炎症有关。从脂肪组织中提取和分析蛋白质对于了解许多生理/病理状态越来越重要。但是由于白色脂肪组织(WAT)和棕色脂肪组织(BAT)中蛋白质含量很低，所以从脂肪组织中提取蛋白质具有很大的难度。
发明内容
本发明的目的是提供一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法。
本发明所提供的一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：S11将第一缓冲液、离心管柱和接收管套管放置于冰上进行预冷的步骤；S12取50mg至80mg脂肪组织放置在具有较强吸附能力的纸巾上，对所述脂肪组织进行按压从而将脂肪组织中部分油进行预去除；S13将所述脂肪组织用镊子夹取放入到1.5ml离心管中，然后在1.5ml离心管中加入100mg蛋白提取粉和50ul所述第一缓冲液；S14用研磨棒将1.5ml离心管中的脂肪组织、蛋白提取粉和第一缓冲液进行研磨和混合处理2分钟，形成糊状混合物；然后再次加入25050ul所述第一缓冲液，充分研磨和混合30秒钟；S15盖上1.5ml离心管盖子放入离心机，将离心机的相对离心力设置为350xg，离心处理1分钟；S16将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育18分钟；S17孵育后立刻在相对离心力设置为350xg的离心机中开盖离心处理100秒；S18去除离心管柱，完成蛋白质提取。
本发明所提供的另一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：S21使用低速离心方式收集脂肪细胞的步骤；S22将收集到的脂肪细胞置入1.5ml离心管中，然后加入1ml预冷的PBS2重悬细胞和100mg蛋白提取粉；S23将1.5ml离心管盖上盖子，放入相对离心力设置为500xg的离心机中离心处理3分钟；S24去除1.5ml离心管中的上清液；S25将1.5ml离心管中剩余组分用研磨棒进行研磨和混合处理2分钟，使其成为细胞均浆；S26在1.5ml离心管中加入250ul第一缓冲液，然后再次用研磨棒进行研磨和混合处理30秒；S27盖上1.5ml离心管盖子放入离心机，将离心机的相对离心力设置为350xg，离心处理1分钟；S28将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育18分钟；S29孵育后立刻在相对离心力设置为350xg的离心机中开盖离心处理100秒；S210去除离心管柱，完成蛋白质提取。
本发明所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，所述孵育时间预评估步骤包括：在1.5ml离心管中加入0.5ml水；将1.5ml离心管放入设定为零下20摄氏度的冰箱中进行开盖孵育并开始计时或将1.5ml离心管放入设定为零下70摄氏度至零下70摄氏度的冰箱中进行冷冻并开始计时；当水完全冷冻时结束计时；将计时结果作为所述将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间。
本发明所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，操作简单，蛋白质获得率高。
附图说明
图1为本发明实施例一所述的一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法流程示意图；
图2为本发明实施例一所述的另一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法流程示意图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
如图1所示，本实施例提供一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：
S11将第一缓冲液、离心管柱和接收管套管放置于冰上进行预冷的步骤；
S12取50mg至80mg脂肪组织放置在具有较强吸附能力的纸巾上，对所述脂肪组织进行按压从而将脂肪组织中部分油进行预去除；
S13将所述脂肪组织用镊子夹取放入到1.5ml离心管中，然后在1.5ml离心管中加入100mg蛋白提取粉和50ul所述第一缓冲液；
S14用研磨棒将1.5ml离心管中的脂肪组织、蛋白提取粉和第一缓冲液进行研磨和混合处理2分钟，形成糊状混合物；然后再次加入25050ul所述第一缓冲液，充分研磨和混合30秒钟；
S15盖上1.5ml离心管盖子放入离心机，将离心机的相对离心力设置为350xg，离心处理1分钟；
S16将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育18分钟；
S17孵育后立刻在相对离心力设置为350xg的离心机中开盖离心处理100秒；
S18去除离心管柱，完成蛋白质提取。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括将提取出的蛋白质中的非水溶性细胞组分进行稀释的步骤。本领域技术人员可以理解，稀释后的非水溶性细胞组分混合液可用于ELIS1A检测水溶性蛋白。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括：在提取出的蛋白溶液中加入1/10第二缓冲液，使之成为变性蛋白溶液；本领域技术人员可以理解，所述变形蛋白溶液，可用于S1DS1-PAGE或WeS1tern或其他下游应用中。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括：在提取出的蛋白溶液中加入1/10第三缓冲液，使之成为非变性蛋白溶液；本领域技术人员可以理解，所述非变性蛋白溶液，可用于IP或ELIS1A或其他下游应用中。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括：在提取出的蛋白溶液中加入1/10第四缓冲液，从而形成可用于2D分析的混合溶液。
所述第四缓冲液为2X的2D胶样品缓冲液。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括将透析蛋白溶液的步骤。本领域技术人员可以理解，所述第一缓冲液中含有影响质谱分析的组分，对蛋白溶液进行透析处理后，便于对进行蛋白溶液进行质谱分析。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括用TCA法沉淀蛋白的步骤。本领域技术人员可以理解，所述第一缓冲液中含有影响质谱分析的组分，对蛋白容易用TCA法沉淀蛋白后，便于对进行蛋白溶液进行质谱分析。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，所述每次使用研磨棒进行研磨和混合处理后，须用酒精对研磨棒进行擦拭清洁并在室温环境下空气干燥处理。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括孵育时间预评估步骤，包括：
在1.5ml离心管中加入0.5ml水；
将1.5ml离心管放入设定为零下20摄氏度的冰箱中进行开盖孵育并开始计时；
当水完全冷冻时结束计时；
将计时结果作为所述步骤S18将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间。本领域技术人员可以理解，这样可检测出水完全冷冻的最少时间，将该时间作为所述步骤S16将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间，这样可减少所述孵育时间，提取更加快速，效率更高。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括孵育时间预评估步骤，包括：
在1.5ml离心管中加入0.5ml水；
将1.5ml离心管放入设定为零下70摄氏度至零下70摄氏度的冰箱中进行冷冻并开始计时；
当水完全冷冻时结束计时；
将计时结果作为所述步骤S18将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间。本领域技术人员可以理解，这样可检测出水完全冷冻的最少时间，将该时间作为所述步骤S16将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间，这样可减少所述孵育时间，提取更加快速，效率更高。
本实施例所述的离心管柱为表面具有孔径结构的离心管柱。本领域技术人员可以理解，表面具有孔径结构的离心管柱，可使得所述脂肪组织匀浆通过离心管柱能将水相和油相迅速分开，组织中的总蛋白无丢失。蛋白质得率可达2-3mg/ml，远远高于其他方法。
本领域技术人员可以理解，缓冲溶液(buffer solution)是一种能在加入少量酸或碱和水时大大降低pH变动幅度的溶液。本实施例所述的第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液均采用可实现上述实验目的的现有技术中的无表面活性剂的缓冲液来实现，由于采用本领域惯常手段配置，其组分这里不再进行赘述。
实施例二
如图2所示，本实施例提供一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，包括如下步骤：
S21使用低速离心方式收集脂肪细胞的步骤；
S22将收集到的脂肪细胞置入1.5ml离心管中，然后加入1ml预冷的PBS2重悬细胞和100mg蛋白提取粉；
S23将1.5ml离心管盖上盖子，放入相对离心力设置为500xg的离心机中离心处理3分钟；
S24去除1.5ml离心管中的上清液；
S25将1.5ml离心管中剩余组分用研磨棒进行研磨和混合处理2分钟，使其成为细胞均浆；
S26在1.5ml离心管中加入250ul第一缓冲液，然后再次用研磨棒进行研磨和混合处理30秒；
S27盖上1.5ml离心管盖子放入离心机，将离心机的相对离心力设置为350xg，离心处理1分钟；
S28将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育18分钟；
S29孵育后立刻在相对离心力设置为350xg的离心机中开盖离心处理100秒；
S210去除离心管柱，完成蛋白质提取。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括将提取出的蛋白质中的非水溶性细胞组分进行稀释的步骤。本领域技术人员可以理解，稀释后的非水溶性细胞组分混合液可用于ELIS2A检测水溶性蛋白。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括：在提取出的蛋白溶液中加入1/10第二缓冲液，使之成为变性蛋白溶液；本领域技术人员可以理解，所述变形蛋白溶液，可用于S2DS2-PAGE或WeS2tern或其他下游应用中。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括：在提取出的蛋白溶液中加入1/10第三缓冲液，使之成为非变性蛋白溶液；本领域技术人员可以理解，所述非变性蛋白溶液，可用于IP或ELIS2A或其他下游应用中。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括：在提取出的蛋白溶液中加入1/10第四缓冲液，从而形成可用于2D分析的混合溶液。
所述第四缓冲液为2X的2D胶样品缓冲液。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括将透析蛋白溶液的步骤。本领域技术人员可以理解，所述第一缓冲液中含有影响质谱分析的组分，对蛋白溶液进行透析处理后，便于对进行蛋白溶液进行质谱分析。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括用TCA法沉淀蛋白的步骤。本领域技术人员可以理解，所述第一缓冲液中含有影响质谱分析的组分，对蛋白容易用TCA法沉淀蛋白后，便于对进行蛋白溶液进行质谱分析。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，所述每次使用研磨棒进行研磨和混合处理后，须用酒精对研磨棒进行擦拭清洁并在室温环境下空气干燥处理。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括孵育时间预评估步骤，包括：
在1.5ml离心管中加入0.5ml水；
将1.5ml离心管放入设定为零下20摄氏度的冰箱中进行开盖孵育并开始计时；
当水完全冷冻时结束计时；
将计时结果作为所述步骤S28将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间。本领域技术人员可以理解，这样可检测出水完全冷冻的最少时间，将该时间作为所述步骤S28将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间，这样可减少所述孵育时间，提取更加快速，效率更高。
本实施例所提供的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，还包括孵育时间预评估步骤，包括：
在1.5ml离心管中加入0.5ml水；
将1.5ml离心管放入设定为零下70摄氏度至零下70摄氏度的冰箱中进行冷冻并开始计时；
当水完全冷冻时结束计时；
将计时结果作为所述步骤S28将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间。本领域技术人员可以理解，这样可检测出水完全冷冻的最少时间，将该时间作为所述步骤S28将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间，这样可减少所述孵育时间，提取更加快速，效率更高。
本实施例所述的离心管柱为表面具有孔径结构的离心管柱。本领域技术人员可以理解，表面具有孔径结构的离心管柱，可使得所述脂肪组织匀浆通过离心管柱能将水相和油相迅速分开，组织中的总蛋白无丢失。蛋白质得率可达2-3mg/ml，远远高于其他方法。
本领域技术人员可以理解，缓冲溶液(buffer solution)是一种能在加入少量酸或碱和水时大大降低pH变动幅度的溶液。本实施例所述的第一缓冲液、第二缓冲液、第三缓冲液和第四缓冲液均采用可实现上述实验目的的现有技术中的无表面活性剂的缓冲液来实现，由于采用本领域惯常手段配置，其组分这里不再进行赘述。
最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
Claims (10)
1.一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S11将第一缓冲液、离心管柱和接收管套管放置于冰上进行预冷的步骤；
S12取50mg至80mg脂肪组织放置在具有较强吸附能力的纸巾上，对所述脂肪组织进行按压从而将脂肪组织中部分油进行预去除；
S13将所述脂肪组织用镊子夹取放入到1.5ml离心管中，然后在1.5ml离心管中加入100mg蛋白提取粉和50ul所述第一缓冲液；
S14用研磨棒将1.5ml离心管中的脂肪组织、蛋白提取粉和第一缓冲液进行研磨和混合处理2分钟，形成糊状混合物；然后再次加入25050ul所述第一缓冲液，充分研磨和混合30秒钟；
S15盖上1.5ml离心管盖子放入离心机，将离心机的相对离心力设置为350xg，离心处理1分钟；
S16将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育18分钟；
S17孵育后立刻在相对离心力设置为350xg的离心机中开盖离心处理100秒；
S18去除离心管柱，完成蛋白质提取。
2.一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S21使用低速离心方式收集脂肪细胞的步骤；
S22将收集到的脂肪细胞置入1.5ml离心管中，然后加入1ml预冷的PBS2重悬细胞和100mg蛋白提取粉；
S23将1.5ml离心管盖上盖子，放入相对离心力设置为500xg的离心机中离心处理3分钟；
S24去除1.5ml离心管中的上清液；
S25将1.5ml离心管中剩余组分用研磨棒进行研磨和混合处理2分钟，使其成为细胞均浆；
S26在1.5ml离心管中加入250ul第一缓冲液，然后再次用研磨棒进行研磨和混合处理30秒；
S27盖上1.5ml离心管盖子放入离心机，将离心机的相对离心力设置为350xg，离心处理1分钟；
S28将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育18分钟；
S29孵育后立刻在相对离心力设置为350xg的离心机中开盖离心处理100秒；
S210去除离心管柱，完成蛋白质提取。
3.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：所述离心管柱为表面具有孔径结构的离心管柱。
4.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：还包括将提取出的蛋白质中的非水溶性细胞组分进行稀释的步骤。
5.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：还包括在提取出的蛋白溶液中加入1/10第二缓冲液，使之成为变性蛋白溶液。
6.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：还包括在提取出的蛋白溶液中加入1/10第三缓冲液，使之成为非变性蛋白溶液。
7.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：还包括在提取出的蛋白溶液中加入1/10第四缓冲液，从而形成可用于2D分析的混合溶液。
8.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：还包括透析蛋白溶液或用TCA法沉淀蛋白的步骤。
9.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：所述每次使用研磨棒进行研磨和混合处理后，须用酒精对研磨棒进行擦拭清洁并在室温环境下空气干燥处理。
10.如权利要求1或2所述的从脂肪组织中提取蛋白质的方法，其特征在于：还包括孵育时间预评估步骤，所述孵育时间预评估步骤包括：
在1.5ml离心管中加入0.5ml水；
将1.5ml离心管放入设定为零下20摄氏度的冰箱中进行开盖孵育并开始计时或将1.5ml离心管放入设定为零下70摄氏度至零下70摄氏度的冰箱中进行冷冻并开始计时；
当水完全冷冻时结束计时；
将计时结果作为所述将1.5ml离心管中的上清液转移到离心管柱套管中并将离心管柱套管置入保持零下20度的冰箱中进行开盖孵育的时间。
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| CN201911416323.8A CN111320668A (zh) | 2019-12-31 | 2019-12-31 | 一种从脂肪组织中提取蛋白质的方法 |
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|---|---|---|---|---|
| CN109251886A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-22 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒及其提取方法和应用 |
| CN110129260A (zh) * | 2019-04-08 | 2019-08-16 | 奥尔文（深圳）生物科技有限公司 | 一种脂肪组织中的血管基质成分的提取方法及应用 |
| CN110437301A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-12 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法 |
-
2019
- 2019-12-31 CN CN201911416323.8A patent/CN111320668A/zh active Pending
Patent Citations (3)
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|---|---|---|---|---|
| CN109251886A (zh) * | 2018-09-20 | 2019-01-22 | 中国人民解放军第四军医大学 | 一种提取脂肪组织来源外泌体的试剂盒及其提取方法和应用 |
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| CN110437301A (zh) * | 2019-08-27 | 2019-11-12 | 上海美吉生物医药科技有限公司 | 一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| INVENT BIOTECHNOLOGIES: "AT-022试剂盒", 《AT-022试剂盒》 * |
| INVENT BIOTECHNOLOGIES: "脂肪组织和细胞的总蛋白提取", 《WWW.ANTPEDIA.COM/NEWS/00/N-2322500.HTML》 * |
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