CN106282169A - 一种快速批量提取鱼组织总rna的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种快速批量提取鱼组织总RNA的方法,属于鱼类RNA提取技术领域。其通过处理前准备、鱼的前处理、研磨、离心、二次离心、干燥和溶解得到鱼组织总RNA。本发明将样品、研磨珠和Trizol加入冷冻管中,经液氮冷冻以后装入高通量研磨仪中处理,一方面保证样品研磨过程中始终处于Trizol保护和低温状态,双重保护RNA防止降解;另一方面,相比于液体状态下(手动或者电动匀浆器匀浆)匀浆,低温干磨能缩短匀浆时间、匀浆更彻底。同时,研磨过程中样品始终在封闭的冻存管中,基本无样品损耗,因此本发明对初始样品量要求低,适于微量组织样品的总RNA提取。最后,本发明可同时研磨1‑50个样品,实现样品的批量处理,大大缩短了试验时间。
Description
技术领域
本发明涉及一种快速批量提取鱼组织总RNA的方法,尤其是一种适合快速批量提取鱼组织总RNA的方法,属于鱼类RNA提取技术领域。
背景技术
总RNA提取技术是分子生物学的基础实验技术之一。纯度高、完整性好的总RNA是进行基因克隆、基因表达、基因功能分析等研究的必要前提。目前试验室常用的总RNA提取技术是低温匀浆后Trizol法提取。低温匀浆一般采用液氮研磨法、手动或电动匀浆器研磨法。液氮研磨法处理样品时,由于液氮极易挥发,研磨过程中需要持续地向研钵中添加液氮,耗费时间长,操作不方便,存在安全隐患。手动或者电动匀浆器研磨法要求在冰上完成,防止样品过热引起RNA降解。但是实践中极易引起样品局部温度升高。并且,两者的共同不足之处在于(1)每次只能处理一个样品,无法批量操作;(2)损耗部分样品,这对于初始样品量少的试验影响大;(3)处理过程中样品位于开放容器中,容易引起样品污染。
发明内容
本发明的目的在于克服上述不足之处,提供一种适合快速批量提取鱼组织总RNA的方法,既实现样品批量操作,又能降低样品损耗和污染。
按照本发明提供的技术方案,一种快速批量提取鱼组织总RNA的方法,步骤如下:
(1)处理前准备:取研磨珠,用乙醇溶液浸泡15-30分钟后晾干;取若干2mL冻存管,每个冻存管中均添加研磨珠,并加入1mL Trizol;
(2)鱼的前处理:解剖鱼,取得鱼组织20-100mg,经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后,剪碎组织块,迅速投入步骤(1)处理过的冻存管中,旋上管盖,投入液氮冷冻;
(3)研磨:取步骤(2)处理后的样品1-50个,装入高通量组织研磨仪,以100-120次/分的速度研磨5-10分钟;
(4)离心:取步骤(3)处理后的若干样品室温放置4-6分钟,分别转移至1.5mL的离心管中,每支离心管加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15-30秒,室温放置2-4分钟;2-8℃、10000×g离心14-16分钟;
(5)二次离心:取步骤(4)所得上清液转移到新管中,加入等量异丙醇,室温放置10分钟;2-8℃、10000×g离心10分钟,移去上清,得到RNA沉淀;
(6)干燥:用1mL乙醇溶液洗涤步骤(5)所得RNA沉淀,2-8℃、7500×g离心5分钟,弃去上清,得到RNA沉淀;
(7)溶解:室温放置干燥或真空抽干步骤(6)所得RNA沉淀,加入20-200μL无RNase的水,-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为70%-75%。
步骤(1)所述研磨珠为2mm的氧化锆珠,每个2mL冻存管中加入研磨珠2-4颗。
本发明的有益效果:本发明将样品、研磨珠和Trizol加入冷冻管中,经液氮冷冻以后装入高通量研磨仪中处理,一方面保证样品研磨过程中始终处于Trizol保护和低温状态,双重保护RNA防止降解;另一方面,相比于液体状态下(手动或者电动匀浆器匀浆)匀浆,低温干磨能缩短匀浆时间、匀浆更彻底。同时,研磨过程中样品始终在封闭的冻存管中,基本无样品损耗,因此本发明对初始样品量要求低,适于微量组织样品的总RNA提取。最后,本发明可同时研磨1-50个样品,实现样品的批量处理,大大缩短了试验时间。
附图说明
图1是实施例1对提取罗非鱼肝总RNA后进行琼脂糖电泳后的结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。
以下实施例中液氮和Trizol均为市场上采购的常规产品。
实施例1 采用从罗非鱼分离的肝作为样品,具体包括以下工艺步骤:
(1)处理前准备:取研磨珠,用乙醇溶液浸泡15分钟后晾干;取若干2mL冻存管,每个冻存管中均添加研磨珠,并加入1mL Trizol;
(2)鱼的前处理:解剖鱼,取得鱼组织30mg,经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后,剪碎组织块,迅速投入步骤(1)处理过的冻存管中,旋上管盖,投入液氮冷冻;
(3)研磨:取步骤(2)处理后的样品6个,装入高通量组织研磨仪,以100次/分的速度研磨7分钟;
(4)离心:取步骤(3)处理后的样品室温放置6分钟,随后转移至1.5mL的离心管中,每支离心管加入0.2mL氯仿,剧烈振荡30秒,室温放置4分钟;4℃、10000×g离心16分钟;
(5)二次离心:取步骤(4)所得上清液转移到新管中,加入等量异丙醇,室温放置10分钟;随后在4℃、10000×g离心10分钟,移去上清,得到RNA沉淀;
(6)干燥:用1mL乙醇溶液洗涤步骤(5)所得RNA沉淀,4℃、7500×g离心5分钟,弃去上清,得到RNA沉淀;
(7)保存:室温放置干燥或真空抽干步骤(6)所得RNA沉淀,加入30μL无RNase的水,-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为70%。
步骤(1)所述研磨珠为2mm的氧化锆珠,每个2mL冻存管中加入研磨珠2颗。
实施例2采用从罗非鱼分离的头肾组织作为样品,具体包括以下工艺步骤:
(1)处理前准备:取研磨珠,用乙醇溶液浸泡30分钟后晾干;取若干2mL冻存管,每个冻存管中均添加研磨珠,并加入1mL Trizol;
(2)鱼的前处理:解剖鱼,取得鱼组织70 mg,经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后,剪碎组织块,迅速投入步骤(1)处理过的冻存管中,旋上管盖,投入液氮冷冻;
(3)研磨:取步骤(2)处理后的样品40个,装入高通量组织研磨仪,以120次/分的速度研磨6分钟;
(4)离心:取步骤(3)处理后的样品室温放置4分钟,转移至1.5mL的离心管中,每支离心管加入0.2mL氯仿,剧烈振荡20秒,室温放置2分钟;4℃、10000×g离心15分钟;
(5)二次离心:取步骤(4)所得上清液转移到新管中,加入等量异丙醇,室温放置10分钟; 4℃、10000×g离心10分钟,移去上清,得到RNA沉淀;
(6)干燥:用1mL乙醇溶液洗涤步骤(5)所得RNA沉淀,4℃、7500×g离心5分钟,弃去上清,得到RNA沉淀;
(7)溶解:室温放置干燥或真空抽干步骤(6)所得RNA沉淀,加入50μL无RNase的水,-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为75%。
步骤(1)所述研磨珠为2mm的氧化锆珠,每个2mL冻存管中加入研磨珠3颗。
实施例3采用从罗非鱼分离的肌肉组织作为样品,具体包括以下工艺步骤:
(1)处理前准备:取研磨珠,用乙醇溶液浸泡30分钟后晾干;取若干2mL冻存管,每个冻存管中均添加研磨珠,并加入1mL Trizol;
(2)鱼的前处理:解剖鱼,取得鱼组织90mg,经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后,剪碎组织块,迅速投入步骤(1)处理过的冻存管中,旋上管盖,投入液氮冷冻;
(3)研磨:取步骤(2)处理后的样品50个,装入高通量组织研磨仪,以120次/分的速度研磨10分钟;
(4)离心:取步骤(3)处理后的样品室温放置4分钟,转移至1.5mL的离心管中,每支离心管加入0.2mL氯仿,剧烈振荡30秒,室温放置2分钟;4℃、10000×g离心15分钟;
(5)二次离心:取步骤(4)所得上清液转移到新管中,加入等量异丙醇,室温放置10分钟; 4℃、10000×g离心10分钟,移去上清,得到RNA沉淀;
(6)干燥:用1mL乙醇溶液洗涤步骤(5)所得RNA沉淀,4℃、7500×g离心5分钟,弃去上清,得到RNA沉淀;
(7)溶解:室温放置干燥或真空抽干步骤(6)所得RNA沉淀,加入60μL无RNase的水,-70℃保存。
所述乙醇溶液的质量浓度为75%。
步骤(1)所述研磨珠为2mm的氧化锆珠,每个2mL冻存管中加入研磨珠4颗。
Claims (3)
1.一种快速批量提取鱼组织总RNA的方法,其特征是步骤如下:
(1)处理前准备:取研磨珠,用乙醇溶液浸泡15-30分钟后晾干;取若干2mL冻存管,每个冻存管中均添加研磨珠,并加入1mL Trizol;
(2)鱼的前处理:解剖鱼,取得鱼组织20-100mg,经焦碳酸二乙酯DEPC处理过的水漂洗后,剪碎组织块,迅速投入步骤(1)处理过的冻存管中,旋上管盖,投入液氮冷冻;
(3)研磨:取步骤(2)处理后的样品1-50个,装入高通量组织研磨仪,以100-120次/分的速度研磨5-10分钟;
(4)离心:取步骤(3)处理后的若干样品室温放置4-6分钟,分别转移至1.5mL的离心管中,每支离心管加入0.2mL氯仿,剧烈振荡15-30秒,室温放置2-4分钟;2-8℃、10000×g离心14-16分钟;
(5)二次离心:取步骤(4)所得清液转移到新管中,加入等量异丙醇,室温放置10分钟;2-8℃、10000×g离心10分钟,移去上清,得到RNA沉淀;
(6)干燥:用1mL乙醇溶液洗涤步骤(5)所得RNA沉淀,2-8℃、7500×g离心5分钟,弃去上清,得到RNA沉淀;
(7)溶解:室温放置干燥或真空抽干步骤(6)所得RNA沉淀,加入20-200μL无RNase的水,-70℃保存。
2.如权利要求1所述快速批量提取鱼组织总RNA的方法,其特征是:所述乙醇溶液的质量浓度为70%-75%。
3.如权利要求1所述快速批量提取鱼组织总RNA的方法,其特征是:步骤(1)所述研磨珠为2mm的氧化锆珠,每个2mL冻存管中加入研磨珠2-4颗。
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