CN103966204A - 一种提取高质量鱼翅制品dna的方法 - Google Patents

Abstract

一种提取高质量鱼翅制品DNA的方法，属于分子生物学相关研究领域，步骤如下(1)对鱼翅制品样品进行预处理，包括在弱碱溶液中软化鱼翅和破碎鱼翅；(2)用CTAB裂解液裂解预处理后的鱼翅制品样品；(3)用平衡酚和氯仿-异戊醇分步抽提DNA(4)在含有DNA的水相中加入两倍体积的异丙醇高盐溶液，得到DNA沉淀；用体积分数为75％的乙醇溶液洗涤DNA沉淀，充分干燥，再将DNA沉淀溶解，并保存。利用本发明所提供的提取鱼翅制品DNA的方法，能够方便快捷地获得高质量的鱼翅组织DNA，避免了多糖、胶原蛋白和其他杂质的污染。

Description

一种提取高质量鱼翅制品DNA的方法

技术领域

本发明属于分子生物学相关研究领域，具体地涉及一种提取高质量鱼翅制品DNA的方法，

背景技术

鱼翅属于中国传统高价值水产制品，含有丰富的蛋白质、活性多糖以及矿物质元素。鱼翅是由鲨鱼鱼鳍经过多道加工程序加工而成的，在市场上的销售往往通过鱼翅的大小、产地以及加工方式的不同进行区分，如通常将加工程度较低的鱼翅称为青翅，而将青翅去除软骨后的鱼翅称为明翅，明翅为现有水产品市场上主要的鱼翅商品形态，菊花翅、翅绒等制品均由明翅进一步加工而成。

近来，鱼翅产业在全球范围内得到了广泛关注。鱼翅贸易被认为是造成鲨鱼物种资源的短缺现状的主要原因，基于物种水平的鲨鱼保护工作对濒危鲨类物种的保护具有重要价值。此外，目前国内鱼翅市场比较混乱，利用明胶或鳐鱼鱼鳍进行鱼翅仿制与假冒的现象屡禁不止，严重侵害了消费者权益。因此建立鱼翅物种鉴定的方法十分重要。

基于分子生物学的食品鉴定技术尤其是DNA条形码鉴别技术具有特异性好、灵敏度高、操作简便等特点，目前被广泛用于食品原材料的鉴别。利用鲨鱼线粒体COI基因、16S rRNA基因以及细胞色素b基因(CYTB)等保守序列在分子水平上对鱼翅进行鉴别，可以在种属水平上对鱼翅的来源物种进行区分。

由于鱼翅属于半加工食品，其加工过程经过去肉去皮、高温烫软、漂白以及晒干等步骤，DNA降解十分严重；残留的加工助剂容易对DNA提取效率及最终纯度产生影响，极易导致后续PCR等基于分子生物学的鉴定实验失败。此外，鱼翅属于致密结缔组织，自身含有丰富的硫酸多糖，多糖的去除一直是DNA提取过程中面临的主要难题，已有研究表明鱼翅所含多糖能够与鱼翅DNA相互结合，并包裹DNA，采用现有的方法如经典CTAB法进行鱼翅制品DNA提取时，所获得的DNA沉淀中含有较多的黄色油状物质。通过DNA纯度分析，该方法所获取的DNA的A260/A230比值较低，仅为0.5左右(高纯度的DNA的A260/A230比值通常在2.0左右)，不能满足PCR实验的要求。

发明内容

本发明旨在提供一种提取高质量鱼翅制品DNA方法，该方法简便、快捷且成本低，并能够将鱼翅本身含有的以及加工过程中带入的杂质如多糖、尿素等物质除去，得到高纯度的DNA，能够满足后续PCR分析及其他操作的需要。

一种提取高质量鱼翅制品DNA的方法，包括以下步骤：

(1)预处理对鱼翅制品样品进行预处理，包括在弱碱溶液中软化鱼翅和破碎鱼翅；

(2)裂解消化用CTAB裂解液和蛋白酶K对经过步骤(1)处理后的样品进行裂解消化，得到鱼翅制品样品裂解液，所述CTAB裂解液的成分及其终浓度为：体积比2％CTAB、pH8.0浓度为100mM的Tris-HCl、pH8.0浓度为2.0mM的EDTA、pH8.0浓度为1.4M NaCl；

(3)用平衡酚和氯仿-异戊醇分步抽提DNA

先用平衡酚对所述步骤(2)中得到的所述鱼翅制品样品裂解液抽提一次，接着使用氯仿-异戊醇混合溶液进行两次抽提，得到含有DNA的水相，所述氯仿-异戊醇混合溶液中氯仿：异戊醇的体积比为24:1；

(4)沉淀溶解DNA

在步骤(3)得到的含有DNA的水相中加入两倍体积预冷的异丙醇高盐溶液，低温静置后离心，弃去上清，得到DNA沉淀，用体积分数为75％的乙醇水溶液洗涤DNA沉淀，充分干燥，再将DNA沉淀溶解，并保存，所述异丙醇高盐溶液由异丙醇纯溶液、5M NaCl按体积比3:1混合而成；

优选地，所述步骤(1)中，所述在弱碱溶液中软化鱼翅的过程是，用无菌水冲洗鱼翅表面以去除灰尘及污物，在无菌条件下用95％的乙醇溶液进一步清理鱼翅表面，待乙醇充分挥发之后，将鱼翅从基部向末端沿纹路剪下，用弱碱溶液浸泡鱼翅，然后离心，收集处理后的鱼翅制品样品；所述弱碱溶液优选是0.06M NaOH。

优选地，所述浸泡鱼翅的过程是，将剪下的鱼翅置于弱碱溶液，在60℃震荡2小时，然后将浸泡液在4000rpm的条件下离心10分钟，倒掉上层液体，取出鱼翅组织备用。

所述步骤(1)中破碎鱼翅的过程优选是，将软化后的鱼翅制品样品剪碎，然后对剪碎后的鱼翅进行冷冻干燥，冷冻干燥完成后，将鱼翅制品样品进行研碎。

所述冷冻干燥优选在真空下进行，所用冻干温度为-54℃，冻干时间为8小时。

在所述步骤(2)中，所述裂解消化为预处理后的鱼翅制品样品放入所述CTAB裂解液之后，加入蛋白酶K，在60℃震荡至鱼翅制品样品被彻底裂解消化。

在所述步骤(3)中，用平衡酚抽提的过程优选是，向所述鱼翅制品样品裂解液中加入等体积的平衡酚，充分混匀后离心，然后吸取上层水相至另一无菌容器中；用氯仿-异戊醇混合液抽提的过程优选是，向平衡酚抽提后得到的所述上层水相中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分混匀后离心，然后吸取水相至另一无菌容器中，重复抽提两次，得到含有DNA的水相。

优选地，在所述步骤(4)，在56℃条件下干燥所述DNA沉淀，然后用TE溶液溶解干燥后的DNA沉淀，并置于-30℃以下的温度保存，所述TE溶液的配方为10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0。

本发明与现有技术相比的有益效果：

本发明所提供的提取高质量鱼翅制品DNA的方法，使用弱碱溶液浸泡鱼翅，从而能够将鱼翅干品充分软化，便于进行后续操作。此外，在鱼翅的加工过程中，对鱼翅进行剔骨、漂白等处理时会引入如双氧水、明矾等加工助剂，鱼翅的晾干、晒干等操作也会引入环境污染因素以及鱼翅制品样品之间的交叉污染，使用弱碱溶液浸泡能够去除鱼翅表面的污染物与残留的加工助剂，防止对后续试验带来影响。

坚硬的鱼翅组织或回软后的鱼翅组织均难以使用常规的液氮研磨法破碎。本发明通过对软化处理后的鱼翅进行冷冻干燥，从而可以很好地破碎鱼翅组织。鱼翅组织回软后具有较大粘度，真空冷冻干燥过程中可形成大量气泡，气泡的产生能够使鱼翅组织形成疏松孔状的结构，从而变得轻薄易碎，稍加研磨即可得到粉末。本鱼翅破碎方法相对于传统的液氮研磨而言，所获得的鱼翅粉末细化程度更高，该粉末复水性好，经充分消化即可获得澄清的提取液，组织碎片残留少，为得到高纯度的DNA提供了基础。此外，本方法省时省力，极大提高实验效率，并减少了液氮的使用，降低实验成本。

鱼翅组织的水解液常呈现黄色或深褐色，经分析，可能为尿素或其他杂质所造成的。鲨鱼组织中的尿素与三甲胺含量较为丰富，且鱼翅组织(致密结缔组织)中含有较多的杂糖类等杂质。本发明用平衡酚与氯仿-异戊醇混合液分步抽提代替普通的平衡酚：氯仿：异戊醇同步抽提，能够初步去除鱼翅中较多的杂多糖及其他污染物。这是由于尿素等杂质不溶于氯仿，普通的平衡酚：氯仿：异戊醇同步抽提方法不能除去尿素。在常规方法后续的DNA沉淀过程中，杂质物质难溶于低温的异丙醇或乙醇，而与DNA共同沉淀下来，这将影响后续PCR等实验的进行,即通过扩增无法获取目标条带；使用平衡酚与氯仿-异戊醇混合液分步抽提可以较好地解决这个问题，经过平衡酚抽提得到的上清液为无色透明液体，与经平衡酚：氯仿：异戊醇(25:24:1)抽提获得黄色或黄褐色上清液在颜色上明显不同。采用平衡酚与氯仿-异戊醇混合液分步抽提获得的上清液在DNA沉淀步骤中也未出现黄色及黄褐色杂质。

鱼翅的主要成分为胶原蛋白和硫酸软骨素，抽提得到的含DNA的上清液中，多糖含量较高，采用常规的乙醇沉淀或者异丙醇沉淀法会造成多糖与DNA共同沉淀下来，影响后续PCR试验的进行。根据本发明的相关内容，通过异丙醇高盐溶液进行DNA沉淀。高浓度的氯化钠与异丙醇的复合沉淀剂能够沉淀DNA，而多糖类物质(离子多糖)残留于溶液中，从而消除多糖对DNA的污染。

利用本发明所提供的提取鱼翅制品DNA的方法，能够从市场上的鱼翅制品中方便快捷地获得高质量的鲨鱼DNA，其DNA纯度高，避免了多糖、胶原蛋白和杂质的污染，满足后续PCR等分子实验的要求。

附图说明

图1是以本发明实施例1提取的三例青翅DNA为模板进行PCR扩增后，产物的琼脂糖电泳图，其中M为DNA分子量标准(DL2000，宝生物工程(大连)有限公司产品，货号：3427A)，1～3是16S rRNA基因片段的扩增结果，4～6是COI基因片段的扩增结果，7～9是CYTB基因片段的扩增结果，10是以纯水作为模板的阴性对照。

图2是以本发明实施例2提取的三例五羊翅DNA为模板进行PCR扩增后，产物的琼脂糖电泳图，其中M为DNA分子量标准(DL2000)，1～3是扩增16s rRNA基因片段的扩增结果，4～6是COI基因片段的扩增结果，7～9是CYTB基因片段的扩增结果，10是以纯水作为模板的阴性对照。

具体实施方式

下面通过实施例结合附图来对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的保护范围不受实施例。

实施例1

(1)对鱼翅制品样品进行预处理，包括在弱碱溶液中软化鱼翅和破碎鱼翅；

所用材料为商品名为青翅的鱼翅制品样品。

用灭菌剪刀沿鱼翅纹路从基部向末端剪下200mg左右的鱼翅制品样品，置于50mL的离心管中。向离心管中加入约50mL灭菌0.06M NaOH溶液。将离心管置于震荡水浴锅中，60℃震荡2小时，至鱼翅充分软化。

在4000rpm的条件下离心10分钟，小心弃去上清液。然后，将鱼翅剪碎后置于培养皿中，并放入真空冷冻干燥机中冻干，冻干温度为-54℃，冻干时间为8小时。将冻干后的鱼翅制品样品研碎。

(2)裂解消化

取100mg冻干研碎后的样品置于2mL的EP管中，加入1mL CTAB裂解液和75μL的蛋白酶K(20mg/mL)，60℃震荡水浴约8小时，得到鱼翅制品样品的裂解消化液。CTAB裂解液的配方如下：2％CTAB，100mM Tris-HCl(pH8.0)，20mM EDTA(pH8.0)，1.4M NaCl，pH8.0。

(3)用平衡酚和氯仿-异戊醇分步抽提DNA

向步骤(2)中所得到的样品裂解消化液中加入等体积的平衡酚，充分混匀后，12000rpm的条件下离心10分钟，小心吸取上清液至另一EP管中。

向上述EP管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，(氯仿、异戊醇体积比为24:1)，充分混匀，12000rpm的条件下离心10分钟，然后小心吸取上清液至另一EP管中，重复一次，得到含有DNA的提取液。

(4)沉淀DNA

向步骤(3)得到的含有DNA的提取液中加入两倍体积的预冷异丙醇高盐溶液，混匀，在-20℃放置2小时，然后在4℃、12000rpm的条件下离心10分钟，弃上清，得到DNA沉淀。上述异丙醇高盐溶液由异丙醇纯溶液和5M NaCl按体积比3:1混合而成，即异丙醇纯溶液：5M NaCl水溶液的体积比为3:1。

(5)洗涤DNA沉淀

向DNA沉淀中迅速加入50～100μL的75％乙醇(-20℃预冷)，12000rpm离心15～30秒后，小心吸出上清液。重复一次。将得到的DNA沉淀置于56℃烘箱中，放置15～20分钟，使乙醇充分挥发。

(6)溶解DNA

向得到的DNA沉淀中，加入50μL的TE溶液，TE溶液可以经56℃预热。然后充分震荡溶解DNA，并置于-18℃以下的温度保存。

用微量核酸蛋白仪检测所提取的DNA的质量，经测量所得到的DNA浓度为50～200ng/μL，A260/A280平均值为1.82，A260/A230平均值为1.89，说明提取得到的DNA满足纯度及浓度要求。

以上述提取的DNA为模板，使用通用16S rRNA、COI、CYTB引物进行PCR扩增，引物序列及退火温度如表1所示。其中，16S rRNA引物、COI引物扩增的片段长度约为650bp，CYTB引物扩增的片段长度为385bp。

表1 PCR反应的引物序列

PCR反应体系总体积为25μL，包括：

PCR反应条件为：95℃预变性，5min；循环反应35次，循环条件为94℃变性1min，退火1min(退火温度见表1)，72℃延伸1min；72℃末轮延伸5min。

琼脂糖凝胶电泳显示，扩增产物的带型清晰，说明提取的DNA质量能够满足鱼翅鉴定所需(见图1)。

实施例2

(1)预处理

对鱼翅制品样品进行预处理，包括在弱碱溶液中软化鱼翅和破碎鱼翅；

所用材料是商品名为五羊翅的鱼翅制品样品。

用灭菌剪刀沿鱼翅纹路从基部向末端剪下200mg左右的鱼翅制品样品，放置于50mL离心管中。向离心管中加入约50mL灭菌的0.06M NaOH溶液。

将离心管置于震荡水浴锅中，60℃震荡水浴2h，直至鱼翅充分软化。4000rpm的条件下离心10分钟，小心倒掉上清液。

将软化后的鱼翅剪碎后置于培养皿中，并放入真空冷冻干燥机中冻干。冻干温度为-54℃，冻干时间为8小时，将冻干后的鱼翅制品样品研碎。

(2)裂解消化

取100mg冻干研碎后的样品置于2mL EP管中，加入1mL CTAB裂解液和75μL蛋白酶K(20mg/ml)，60℃震荡水浴约8小时，得到鱼翅制品样品裂解消化液。CTAB裂解液的配方如下：体积比为2％的CTAB、100mM Tris-HCl(pH8.0)、20mM EDTA(pH8.0)、1.4M NaCl，pH8.0。

(3)用平衡酚和氯仿-异戊醇混合液分步骤抽提DNA

向步骤(2)所得到的样品裂解消化液中加入等体积的平衡酚，充分混匀后，12000rpm的条件下离心10分钟，小心吸取上清液至另一EP管中。

向上述含有上清液的EP管中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿：异戊醇体积比24:1)，充分混匀，12000rpm的条件下离心10分钟，小心吸取上清液至另一EP管中，重复一次，得到含有DNA的提取液。

(4)沉淀DNA

向上述含有DNA的提取液中加入两倍体积的预冷异丙醇高盐溶液，混匀，-20℃放置2小时，4℃、12000rpm的条件下离心10分钟，弃上清，得到DNA沉淀。上述异丙醇高盐溶液由异丙醇纯溶液和5M NaCl按体积比3:1混合而成。

(5)洗涤DNA沉淀

向上述DNA沉淀中迅速加入50～100μL的75％乙醇溶液(-20℃预冷)，12000rpm的条件下离心15～30秒后，小心吸出上清液；重复一次。将得到DNA沉淀置于56℃烘箱中，放置15-20分钟，使乙醇充分挥发。

(6)溶解DNA

向得到的DNA沉淀中，加入50μL的TE溶液，TE溶液可以经56℃预热。然后充分震荡溶解DNA，并置于-18℃以下的温度保存。

用微量核酸蛋白仪检测所提取的DNA的质量，经测量，DNA浓度为50～200ng/μL，A260/A280平均值为1.72，A260/A230平均值为1.93，说明提取得到的DNA满足纯度及浓度要求。

以上述提取的DNA为模板，使用通用16S rRNA、COI、CYTB引物进行PCR扩增，引物序列及反应条件与实施例1相同。

琼脂糖凝胶电泳显示，扩增产物的带型清晰、稳定，说明提取的DNA质量能够满足鱼翅鉴定所需(见图2)。

Claims (8)

1.一种提取高质量鱼翅制品DNA的方法，其特征在于它包括以下步骤：

(1)预处理对鱼翅制品样品进行预处理，包括在弱碱溶液中软化鱼翅和破碎鱼翅；

(2)裂解消化用CTAB裂解液和蛋白酶K对经过所述步骤(1)处理后的样品进行裂解消化，得到鱼翅制品样品裂解液，所述CTAB裂解液的成分及其终浓度为：体积比2％CTAB、100mM的Tris-HCl、2.0mM的EDTA、1.4M NaCl；所述CTAB裂解液pH8.0；

(3)用平衡酚和氯仿-异戊醇分步抽提DNA

先用平衡酚对所述步骤(2)中得到的所述鱼翅制品样品裂解液抽提一次，接着使用氯仿-异戊醇混合溶液进行两次抽提，得到含有DNA的水相，所述氯仿-异戊醇混合溶液中氯仿：异戊醇的体积比为24:1；

(4)沉淀溶解DNA

在步骤(3)得到的含有DNA的水相中加入两倍体积预冷的异丙醇高盐溶液，低温静置后离心，弃去上清，得到DNA沉淀，用体积分数为75％的乙醇水溶液洗涤DNA沉淀，充分干燥，再将DNA沉淀溶解，并保存；所述异丙醇高盐溶液由异丙醇纯溶液、5M NaCl水溶液按体积比3:1混合而成。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中，所述在弱碱溶液中软化鱼翅的过程是，用无菌水冲洗鱼翅表面以去除灰尘及污物，在无菌条件下用95％的乙醇溶液进一步清理鱼翅表面，待乙醇充分挥发之后，将鱼翅从基部向末端沿纹路剪下，用弱碱溶液浸泡鱼翅，然后离心，收集处理后的鱼翅制品样品；所述弱碱溶液是0.06M NaOH。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述浸泡鱼翅的过程是，将剪下的鱼翅置于弱碱溶液，在60℃震荡2小时，然后将浸泡液在4000rpm的条件下离心10分钟，倒掉上层液体，取出鱼翅组织备用。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(1)中破碎鱼翅的过程是，将软化后的鱼翅制品样品剪碎，然后对剪碎后的鱼翅进行冷冻干燥，冷冻干燥完成后，将鱼翅制品样品进行研碎。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于所述冷冻干燥是在真空下进行，所用冻干温度为-54℃，冻干时间为8小时。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤(2)中，所述裂解消化为将预处理后的鱼翅制品样品放入所述CTAB裂解液之后，加入蛋白酶K，在60℃震荡至鱼翅制品样品被彻底裂解消化。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤(3)中，用平衡酚抽提的过程是，向所述鱼翅制品样品裂解液中加入等体积的平衡酚，充分混匀后离心，然后吸取上层水相至另一无菌容器中；用氯仿-异戊醇混合液抽提的过程是，向平衡酚抽提后得到的所述上层水相中加入等体积的氯仿-异戊醇混合液，充分混匀后离心，然后吸取水相至另一无菌容器中，重复抽提两次，得到含有DNA的水相。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于在所述步骤(4)的充分干燥：在56℃条件下干燥所述DNA沉淀，然后用TE溶液溶解干燥后的DNA沉淀，并置于-30℃以下的温度保存，所述TE溶液的的成分及其终浓度为10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0。