CN106967711A - 一种荞麦rna的优化提取方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种荞麦RNA的优化提取方法，本发明具体采用十六烷基三甲基溴化铵优化提取荞麦根、茎和叶RNA；所需玻璃器皿、枪头、EP管和去离子水通过高压湿热灭菌消毒，采用CTAB去除多糖和酚类等物质，聚乙烯吡咯烷酮和β‑巯基乙醇去除酚类物质，异丙醇沉淀RNA效果明显，Tris‑HCl缓冲液和NaCl起到防止RNA降解作用。本发明技术方案可分别提取荞麦根、茎和叶不同部位RNA，提取浓度可达到100~500 ng/μL，可用于RT‑qPCR和RACE等后续实验。本发明操作简便快捷，成本低，获得RNA的浓度和纯度较高。
Description
技术领域
本发明涉及农作物植株不同部位的RNA提取方法，具体涉及一种荞麦RNA的优化提取方法。
背景技术
十六烷基三甲基溴化铵（Hexadecyltrimethy Ammonium Bromide，简称CTAB）是一种离子型表面活性剂，能溶解细胞膜和和膜蛋白，使核蛋白解聚，从而使RNA得以游离出来，与其他提取方法相比可以更有效地去除多糖和酚类等物质。而且提取的RNA浓度和纯度都高，可以支持后续的实验。
目前，现有技术中有很多提取RNA的试剂盒，TaKaRa MiniBEST Plant RNAExtraction Kit和TaKaRa RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）。但是，前者提取的浓度和回收量达不到后续实验的应用要求，而且费用较高；后者，价格虽然便宜，但是比较适用于一些内含物质较少的草本植物和微生物及动物组织细胞；而荞麦组织中富含蛋白质、酚类、多糖，目前，还没有一种提取荞麦植株不同器官RNA方法的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供了一种提取RNA浓度高、纯度高、操作成本低、安全快捷的荞麦RNA的提取优化方法。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案予以实现：
一种荞麦RNA的优化提取方法，它包括以下步骤：
（1）灭菌处理：对所用的器皿和器具进行高压湿热灭菌消毒；
（2）配制Tris-HCl缓冲溶液和CTAB提取溶液，所述CTAB提取液包含质量比为3% CTAB、质量比为2% PVP、25 mmol/L EDTA、2 mol/L NaCl，用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制；
（3）研磨样品：将荞麦的待提取材料放入EP管中，置液氮环境下研磨直至研磨成粉末；
（4）提取液浸提：加入预热的所述CTAB提取液于样品中，快速混匀，再加入β-巯基乙醇，快速混匀，再加入氯仿-异戊醇萃取，混匀后静置，离心后取上清液；
（5）重复步骤（4）萃取，向上清液中加入氯仿-异戊醇，混匀后静置，4 ℃离心，取上清液；
（6）然后向上清液中加入4 ℃异丙醇溶液，混匀后置于-20 ℃下10 ~ 30 min沉淀RNA，4 ℃离心，EP管底部为RNA沉淀，倒掉上清液，乙醇清洗两次，4 ℃离心；
（7）向沉淀中加双蒸水，50 ~ 60 ℃温浴后震荡混匀获得荞麦RNA，做电泳定性检测或定量测定RNA浓度。
进一步的：所述步骤（1）中高压湿热灭菌消毒为在121 ℃、0.2 MPa压力下进行。
进一步的：所述步骤（3）中待提取材料为荞麦的根、茎和叶。
进一步的：所述待提取材料中根选取靠近根尖3 ~ 5 cm的部分；茎选取接近根部的2 ~ 3 cm的部分；叶选取第2片真叶。
进一步的：所述步骤（3）中用酒精火焰烧融对枪头进行灭菌，用烧融枪头的封口端快速研磨样品，每次间隔5 ~ 10 s放入液氮速冻。
进一步的：所述步骤（4）中加入β-巯基乙醇，快速混匀后，置65 ℃水浴锅中温浴，立即放入冰盒中静置5 min，取出加氯仿-异戊醇萃取，混匀后静置，4 ℃离心，取上清液。
进一步的：所述步骤（6）中加入的异丙醇溶液与上清液体积相同。
与现有技术相比，本发明的优点和技术效果是：本发明具体采用十六烷基三甲基溴化铵优化提取荞麦根、茎和叶RNA；采用CTAB去除多糖和酚类等物质，聚乙烯吡咯烷酮和β-巯基乙醇去除酚类物质，异丙醇沉淀RNA效果明显，Tris-HCl缓冲液和NaCl起到防止RNA降解作用。本发明通过CTAB法的优化，改LiCl沉淀为异丙醇沉淀，减少了LiCl沉淀的后续抽提工作。本发明技术方案可分别提取荞麦根、茎和叶不同部位RNA，提取浓度达到100 ~ 500ng/μL，可用于RT-qPCR和RACE等后续实验。本发明操作简便快捷，成本低，获得RNA的浓度和纯度较高。
附图说明
图1是本发明提取的RNA浓度和定性检测结果。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明。
实施例1
本发明所述荞麦RNA的提取优化方法具体包括以下步骤：
1、灭菌处理：用高压锅在高压（0.2 MPa）湿热（121 ℃）对所用的玻璃器皿和塑料制品灭菌1 h。所述玻璃器皿和塑料制品包括250 mL量筒，250 mL烧杯，400 mL锥形瓶，去离子水，细口瓶，EP管，枪头等。
2、配制溶液：配制溶液所需容器均为步骤（1）中灭菌处理后的容器。
（1）、配制Tris-HCl缓冲溶液：量取200 mL灭菌去离子水，加入Tris 0.605 g，溶解后，用HCl（200 μL）调节pH值至8.0。
（2）、配制CTAB提取溶液：称取CTAB 6 g，PVP 4 g，EDTA 1.46125 g，NaCl 23.376g，放入烧杯加入150 mLTris-HCl超声波震荡至溶解，用量筒定容至200 mL，放入细口瓶中，用锡箔纸封盖；
（3）、氯仿：异戊醇 = 24 : 1（v/v）；
（4）、冷藏保存的异丙醇（分析纯级别）。
3、研磨样品：称取荞麦植株不同器官（包括根、茎和叶）的待提取材料约0.1 g于灭菌EP管中，并做标记，放于液氮中速冻，备用或放入-80℃冰箱中待用。
所述待提取材料中根选取靠近根尖3 ~ 5 cm的部分；茎选取接近根部的2 ~ 3 cm的部分；叶选取第2片真叶。
用灭菌处理后经酒精火焰烧融封口的蓝色枪头，在液氮环境下研磨待提取材料，间隔5 ~ 10 s再放入液氮速冻，直至研磨成粉末；叶片容易研磨，根和茎因为纤维较多，应适当增加研磨时间。
4、提取液浸提：取650 μL 65 ℃预热的所述提取液，立即再次加入20 μL的β-巯基乙醇，迅速震荡，混匀，后放入65 ℃水浴锅中，温浴20 min，期间间隔5 min摇晃10 s。然后迅速放入冰盒中5 min，然后加入等体积（680 μL）的氯仿-异戊醇（体积比24 : 1），混匀后静置2 min，4 ℃离心（12000 r/min）15 min，取上清液于另一灭菌EP管。
5、重复步骤4萃取两次，向上清液中添加等体积氯仿-异戊醇，混匀后静置2 min，4℃离心（12000 r/min）15 min，取上清液于另一灭菌并标记的EP管。
6、加入与上清液等体积的（500 μL）4 ℃放置异丙醇溶液，混匀后置于-20 ℃冰箱30 min ~ 1 h，沉淀RNA，4 ℃离心（12000 r/min）15 min，EP管底部有RNA沉淀，如果没有看到沉淀可以继续放入-20 ℃冰箱适当延长沉淀时间。倒掉上清液，75%乙醇（灭菌水配制）清洗两次，每次750 μL。
7、加15 ~ 30 μL双蒸水，50 ~ 60 ℃温浴5 min后震荡混匀，然后做电泳定性检测或定量测定RNA浓度。
按照以上操作步骤获得的RNA浓度和纯度较高，荞麦根部RNA浓度100 ~ 500 ng/μL，茎部RNA浓度100 ~ 500 ng/μL，叶片RNA浓度100 ~ 1000 ng/μL。
序号1 ~ 6为TaKaRa RNAiso Plus（Total RNA 提取试剂）试剂盒提取RNA的结果，7 ~ 12为利用本发明优化后的CTAB法提取RNA的结果，提取的RNA浓度和定性检测结果见表1和图1。
表1 提取的RNA浓度
| 序号 | 名称 | 浓度/（ng/μL） | 260/280 | 260/230 |
| 1 | 茎 | 147.2 | 1.56 | 0.93 |
| 2 | 茎 | 92.6 | 1.77 | 2.16 |
| 3 | 根 | 45.7 | 1.71 | 2.07 |
| 4 | 根 | 90.6 | 1.81 | 2.16 |
| 5 | 叶 | 117.1 | 1.89 | 1.75 |
| 6 | 叶 | 221.1 | 1.88 | 1.79 |
| 7 | 根 | 175.3 | 2.04 | 2.24 |
| 8 | 根 | 123.8 | 2.01 | 2.22 |
| 9 | 茎 | 285.0 | 1.93 | 2.23 |
| 10 | 茎 | 464.7 | 1.96 | 2.25 |
| 11 | 叶 | 554.0 | 2.01 | 2.17 |
| 12 | 叶 | 512.4 | 1.92 | 2.12 |
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其进行限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的普通技术人员来说，依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明所要求保护的技术方案的精神和范围。
Claims (7)
1.一种荞麦RNA的优化提取方法，其特征在于，它包括以下步骤：
（1）灭菌处理：对所用的器皿和器具进行高压湿热灭菌消毒；
（2）配制Tris-HCl缓冲溶液和CTAB提取溶液，所述CTAB提取液包含质量比为3% CTAB、质量比为2% PVP、25 mmol/L EDTA、2 mol/L NaCl，用pH 8.0的Tris-HCl缓冲液配制；
（3）研磨样品：将荞麦的待提取材料放入EP管中，置液氮环境下研磨直至研磨成粉末；
（4）提取液浸提：加入预热的所述CTAB提取液于样品中，快速混匀，再加入β-巯基乙醇，快速混匀，再加入氯仿-异戊醇萃取，混匀后静置，离心后取上清液；
（5）重复步骤（4）萃取，向上清液中加入氯仿-异戊醇，混匀后静置，4 ℃离心，取上清液；
（6）然后向上清液中加入4 ℃异丙醇溶液，混匀后置于-20 ℃下10 ~ 30 min沉淀RNA，4 ℃离心，EP管底部为RNA沉淀，倒掉上清液，乙醇清洗两次，4 ℃离心；
（7）向沉淀中加双蒸水，50 ~ 60 ℃温浴后震荡混匀获得荞麦RNA，做电泳定性检测或定量测定RNA浓度。
2.根据权利要求1所述的荞麦RNA的优化提取方法，其特征在于：所述步骤（1）中高压湿热灭菌消毒为在121 ℃、0.2 MPa压力下进行。
3.根据权利要求1所述的荞麦RNA的优化提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中待提取材料为荞麦的根、茎和叶。
4.根据权利要求3所述的荞麦RNA的优化提取方法，其特征在于：所述待提取材料中根选取靠近根尖3 ~ 5 cm的部分；茎选取接近根部的2 ~ 3 cm的部分；叶选取第2片真叶。
5.根据权利要求1所述的荞麦RNA的优化提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中用酒精火焰烧融对枪头进行灭菌，用烧融枪头的封口端快速研磨样品，每次间隔5 ~ 10 s放入液氮速冻。
6.根据权利要求1所述的荞麦RNA的优化提取方法，其特征在于：所述步骤（4）中加入β-巯基乙醇，快速混匀后，置65 ℃水浴锅中温浴，立即放入冰盒中静置5 min，取出加氯仿-异戊醇萃取，混匀后静置，4 ℃离心，取上清液。
7.根据权利要求1所述的荞麦RNA的优化提取方法，其特征在于：所述步骤（6）中加入的异丙醇溶液与上清液体积相同。
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2017
- 2017-05-03 CN CN201710302652.4A patent/CN106967711A/zh active Pending
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