CN111118171A - 一种鉴别鱼翅种的dna条形码引物对、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对、试剂盒及方法。本发明的引物对的上、下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2所示，利用该引物对对待测鱼翅样品DNA进行PCR扩增，然后对PCR产物进行测通及拼接获取COI序列，将获得的COI序列进行数据库比对及聚类分析鉴定，从而确定待测鱼翅样品的种属。本发明的引物对能够鉴别13种鱼翅物种，分子系统发育树显示，同一个物种的不同个体基本都能形成单系，节点支持率为99％～100％，聚类分析显示，同一物种都位于同一个分支，且不同个体的鱼类的COI序列相似度均大于95％；该方法可为市场流通的鱼翅制品的鉴定提供分子生物学基础。

Description

一种鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对、试剂盒及方法。

背景技术

鱼翅作为著名的养生保健佳品，一直深受消费者的喜爱，价格一度水涨船高。市场流通多为加工后的干鱼翅制品，但由于鲨鱼物种种类繁多，相似物种之间外观形态差异小，通过传统形态学鉴定难以保证干鱼翅制品标识的准确性，造成不良商家以次充好，更有不法生产者从濒危鲨鱼上采集鱼翅。

DNA条形码技术是利用生物体线粒体DNA中一段保守片段对物种进行快速而准确的分子生物学水平的鉴定。2005年，国际已开始合作实施鱼类生命条形码计划(FISH-BOL)，该计划是以电子数据库形式构建含有DNA条形码图像和地理坐标的全球鱼类参考标准数据库。Ward等人利用条形码方法对澳大利亚超过200种海洋鱼类和印度洋沿岸35种鱼类进行分析，研究表明南非与澳洲海域的鱼类之间存在较大差异，地域群系之间种内差异性显著，通过建立N-J进化树的分析结论表明，能够使用线粒体细胞色素氧化酶亚基I(CytochromeOxidase subunit I,COI)作为海洋鱼类的DNA条形码标准序列。DNA条形码技术近年在海洋鱼类的鉴定上取得较好的鉴定效果，但鉴定对象多为新鲜或是冰冻鱼类，这些鱼类大多细胞组织保存完好，而针对市售鱼翅的DNA条形码鉴定鲜有报道。

并且，由于鱼翅制品属于致密结缔组织，自身含有丰富的硫酸多糖，多糖的去除一直是DNA提取过程中面临的主要难题，传统提取方法获得的DNA纯度低，往往造成后续分子生物学实验的失败，所以高效的提取鱼翅DNA也是DNA条形码技术顺利进行的前提。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对、试剂盒及方法，本发明的试剂及方法提取的DNA含量高，更适合作为鱼翅的DNA条形码技术中的DNA提取方法；本发明的DNA条形码能准确鉴别市场上流通的干鱼翅的种属，为鱼翅制品的鉴定提供分子生物学基础。

本发明的第一个目的是提供一种鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的第二个目的是提供一种鉴别鱼翅种的DNA条形码试剂盒，所述的试剂盒包含所述的鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对。

优选，所述的试剂盒还包含DNeasy mericon Food Kit DNA提取试剂盒。该DNeasymericon Food Kit DNA提取试剂盒是QIAGEN公司生产的。

本发明的第三个目的是提供一种鉴别鱼翅种的DNA条形码方法，包括以下步骤：

a.提取待测鱼翅样品的DNA；

b.利用所述的鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对对待测鱼翅样品DNA进行PCR扩增；

c.对PCR产物进行测通及拼接获取COI序列，将获得的COI序列进行数据库比对及聚类分析鉴定，确定待测鱼翅样品的种属。

优选，所述的鱼翅种包括低鳍真鲨、大青鲨、尖吻鲭鲨、尖吻斜锯牙鲨、路氏双髻鲨、犁头鳐、丝鲨、无沟双髻鲨、尖齿柠檬鲨、舒氏星鲨、高鳍真鲨、浅海长尾鲨和沙拉真鲨。

优选，所述的步骤a中利用DNeasy mericon Food Kit DNA提取试剂盒提取待测鱼翅样品的DNA。

优选，所述的步骤b中PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mM dNTPMixture 2.0μL，10μM上、下游引物各0.5μL，Taq 0.5μL；加水补至25.0μL。

优选，所述的步骤b中PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明通过选择适合鱼翅DNA的提取方法，筛选出COI序列DNA条形码通用引物，对鱼翅DNA进行PCR扩增并测序，应用MEGA 6.0软件对64条鱼翅COI序列进行多序列比对，基于邻接法(N-J)构建进化树，并进行遗传距离分析。同时应用DNAMan构建相应COI序列的聚类同源树。结果表明，实验所建立的条形码技术能够鉴别13种鱼翅物种，分子系统发育树显示，同一个物种的不同个体基本都能形成单系，节点支持率大都为99％～100％，聚类分析显示，同一物种都位于同一个分支，且不同个体的鱼类的COI序列相似度均大于95％。该方法为流通的鱼翅制品的鉴定提供分子生物学基础，尤其适合应用于广东省市场流通的鱼翅干制品的物种鉴定。

(2)本发明采用DNeasy mericon Food Kit DNA试剂盒进行鱼翅样品DNA的提取，提取的DNA浓度及纯度显著提高，保证后续的实验顺利进行。

附图说明

图1为64条鱼翅的COI序列N-J进化树。

图2为64条鱼翅的COI序列的聚类同源树。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1

1、材料

本研究所用鱼翅均由广州市海味干果行业商会提供，其中用于DNA提取效果研究的6种鱼翅为市面上常见的正品鱼翅，并从形态学上进行物种鉴定，确保品质正宗，物种明确，包括：20沙青片(低鳍真鲨)、蝶勾(尖齿柠檬鲨)、牙勾(大青鲨)、8寸五羊勾(丝鲨)、10上勿骨勾(浅海长尾鲨)和白蝉片(尖吻斜锯牙鲨)。鉴定后的鱼翅作为标准样品，用于后续实验研究。

用于鱼翅DNA条形码研究的35种鱼翅来源于广东省市场流通鱼翅，其中2种鱼翅是以明胶为主要原料制作的假鱼翅，作为阴性对照。

利用经典CTAB法、广州双螺旋生物科技有限公司生产的动物组织基因组DNA提取试剂盒或QIAGEN公司生产的DNeasy mericon Food Kit提取正品鱼翅DNA，采用广州维伯鑫生物科技有限公司生产的鱼源性(fish)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)检测DNA提取效果。

2、仪器与设备

高速台式离心机，5418R，德国Eppendorf；基因扩增仪，L96G，杭州朗基；荧光定量PCR仪，7500，Applied Biosystems；微量移液器，1000μL、200μL、100μL、10μL，德国Eppendorf；生物安全柜，BSC-100011B2，苏净安泰；凝胶成像系统，WD-9413B，北京六一。

3、实验方法

3.1实验材料预处理

选取的干鱼翅样品，使用灭菌二次水充分清洁鱼翅表面，并使用95％的酒精对鱼翅表面进行轻柔擦拭，以清除鱼翅表面的杂质与灰尘，放置烘箱内烘干；使用灭菌手术剪刀剪下约50g鱼翅样品，尽量剪碎放入研磨机中，20000rpm研磨20min，并观察样品粉碎情况。

3.2 DNA提取

经典CTAB法参照《参考分子克隆》动物DNA提取方法，动物组织基因组DNA提取试剂盒和DNeasy mericon Food Kit均参照商品自带说明书。

采用鱼源性(fish)核酸检测试剂盒对提取DNA纯度进行分析。25μL的反应体系，其成分包括：20μL的fish反应液，酶液1μL，样品DNA、阴性质控或阳性质控各4μL。设置反应程序为：Holding Stage为95℃10min，1个循环；Cycling Stage为95℃15s，55℃1min，40个循环，并收集荧光信号。

3.3 DNA条形码PCR反应体系

利用筛选出的鱼翅COI DNA条形码引物：上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQID NO.2。利用筛选出的上述鱼翅COI DNA条形码通用引物对提取的样品鱼翅DNA进行PCR扩增，扩增的目的片段为COI基因靠近5’末端，长度为680bp左右的序列，其中，SEQ ID NO.1：5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’，SEQ ID NO.2：5’-TAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA-3’。

以提取的DNA为模板进行PCR扩增。25.0μL PCR反应体系如下：10×PCR Buffer2.5μL、dNTP Mixture(2.5mM)2.0μL、上下游引物(10μM)各0.5μL、Taq 0.5μL、模板用量根据PCR扩增情况有一定程度的变化，加水补至25μL。

PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min。

3.4 DNA条形码PCR产物分析

琼脂糖凝胶电泳检测获得的样品DNA条形码PCR产物，将在680bp位置有条带的PCR产物送至上海生工公司进行测通序列与拼接序列，获取680bp左右的COI序列。

搜索BOLD以及NCBI网站的数据库对样品的COI序列进行鉴定以及相似度比对分析，根据比对结果，自NCBI中下载相关鲨类物种COI序列。将整理后的样品COI序列与GenBank下载的相关序列应用MEGA 6.0软件进行多序列比对，基于邻接法(N-J)构建进化树，选用K2P替代模型，Bootstrap自展检测1000次。同时应用DNAMan构建相应COI序列的聚类同源树。

4、结果与分析

4.1 DNA提取及效果分析

根据鱼源性(fish)核酸检测试剂盒(荧光-PCR法)说明书，扩增阈值(CT值)≤40判定为检出鱼源性，表示提取鱼翅DNA成功；CT值>40判定为未检出鱼源性，表示提取鱼翅DNA失败。同一扩增条件下，CT值越小，表示初始扩增模板浓度越高；CT值越大，表示初始扩增模板浓度越低。

结果显示，利用不同的方法对6个物种明确的鱼翅样品(分别是：20沙青片(低鳍真鲨)、蝶勾(尖齿柠檬鲨)、牙勾(大青鲨)、8寸五羊勾(丝鲨)、10上勿骨勾(浅海长尾鲨)和白蝉片(尖吻斜锯牙鲨))进行DNA提取，经典CTAB法提取成功3个样品，动物组织基因组DNA提取试剂盒提取成功5个样品，DNeasy mericon Food Kit提取成功6个样品(见表1)。样品3采用经典CTAB法提取DNA的CT值小于动物组织基因组DNA提取试剂盒提取DNA的CT值；而所有样品采用DNeasy mericon Food Kit提取DNA的CT值均小于采用经典CTAB法和动物组织基因组DNA提取试剂盒提取的DNA的CT值，说明DNeasy mericon Food Kit提取的DNA浓度明显高于另外两种方法提取的DNA浓度。

表1不同方法获得的DNA浓度比较结果

因此，本实施例通过鱼源性(fish)核酸检测试剂盒测定提取DNA的阈值，从而分析出提取DNA的浓度，直接分析目的基因的浓度，从而排除其他因素的干扰。实验结果表明：DNeasy mericon Food Kit提取的DNA含量明显高于另外两种方法提取的DNA含量，更适合作为鱼翅的提取方法。

4.2 DNA条形码获取序列比对结果

DNA条形码实验：

根据研究结果，对选取的广东省市场流通的用于鱼翅DNA条形码研究的35种鱼翅采用DNeasy mericon Food Kit的方法进行DNA提取。通过PCR扩增和测序，有5个干鱼翅样品(sample11、sample28、sample31、sample34和sample35)无法扩增成功，其中sample34和sample35为明胶制品(阴性对照)，所以无法扩增出目的片段。而sample11、sample28和sample31用鱼源性(fish)核酸检测试剂盒检测阈值均>40，可能原因是在干鱼翅的加工过程中DNA严重降解，无法提取足量的DNA进行后续研究。

本实施例获得了30个鱼翅个体的线粒体COI基因序列。该序列是位于COI基因5’端一段约为680bp的片段。将获得的COI序列进行数据库比对及聚类分析鉴定，鉴定结果如下表2所示。30个鱼翅来源于13种鲨鱼物种：Carcharhinus leucas(低鳍真鲨)、Prionaceglauca(大青鲨)、Isurus oxyrinchus(尖吻鲭鲨)、Rhizoprionodon acutus(尖吻斜锯牙鲨)、Sphyrna lewini(路氏双髻鲨)、Glaucostegus cemiculus(犁头鳐科)、Carcharhinusfalciformis(丝鲨)、Sphyrna mokarran(无沟双髻鲨)、Negaprion acutidens(尖齿柠檬鲨)、Mustelus schmitti(舒氏星鲨)、Carcharhinus amboinensis(高鳍真鲨)、Alopiaspelagicus(浅海长尾鲨)、Carcharhinus sorrah(沙拉真鲨)，从样品来源分析得出：6个样品来源于大青鲨，5个样品来源于丝鲨，4个样品来源于尖吻斜锯牙鲨，4个样品来源于路氏双髻鲨，其他样品的来源比较零星分散；从分类阶元分析得出：4种物种来源于真鲨属，7种物种来源于真鲨科，10种物种来源于真鲨目，说明真鲨目的鱼类适合于加工鱼翅制品，其中又以真鲨科真鲨属的鱼类采用的最多。从NCBI中下载这13种鲨鱼物种相似度达97％的基因序列共32条，另外下载市面常见鱼翅物种Isurus paucus(长鳍鲭鲨，鲭鲨属、鲭鲨科、鲭鲨目)基因序列32条，共计64条鲨鱼基因作为日常实验室检测的基因库。

表2不同鱼翅在NCBI数据库的鉴定结果

4.3构建进化树和同源树

构建64条鲨鱼基因的分子系统发育树显示(见图1)，同一个物种的不同个体基本都能形成单系，节点支持率大都为99％～100％，但同科聚类效果不是很明显，例如真鲨目中，真鲨科的7种物种和双髻鲨科的2种物种节点支持率仅为为78％。而不同目间的遗传距离明显更大，这与传统的鲨鱼分类学结果是一致的，证明了鲨鱼线粒体COI基因种内具有高度的保守性，种间具有明显的差异性。

同时进行的64条鲨鱼基因聚类分析显示(见图2)，同一物种都位于同一个分支，且不同个体的鱼类的COI序列相似度均大于95％，说明DNA条形码技术鉴别鱼类较为准确，不会随个体有较大的变化；不同鱼类物种相似度各不相同，其中真鲨科和双髻鲨科的属间相似度均为89％，而真鲨目三个属间的相似度为87％，随着分类阶元越高，相似度逐渐下降，最低相似度为76％。构建的同源树不仅能反应不同鱼类的亲缘关系，还能够直接看出不同鱼类COI序列的相似度，表明亲缘关系较近的物种，特别是聚类到一个种类的物种可以通过DNA条形码技术进行鉴别。

本实施例获得了30个鱼翅个体的线粒体COI基因序列，同时采用的聚类同源树分析显示：同种鱼翅样品的序列因分类亲和性而与相关参考序列聚在一起，形成一个聚类关系，以此可根据NCBI中参考序列的物种信息确定样品所属分类。

由此可以得出结论：本发明建立的DNA条形码方法适用于鱼翅制品的鉴定研究，且大多可以鉴定到种的水平。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

实施例2：适合于广东省鱼翅干制品的物种鉴定的DNA条形码引物的筛选和优化

鉴于现有报道鱼类DNA条形码引物的多样化，针对实施例1中采集的33个真鱼翅样品，采用实施例1的DNA条形码引物及另外三种常用DNA条形码扩增引物进行扩增分析。表3结果表明，经优化PCR扩增条件和测序对比，结果证明引物对F1和R1(即实施例1的DNA条形码引物，上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2)在扩增成功率和测序成功率均优于其他引物，更适合应用广东省鱼翅干制品的物种鉴定。

表3候选DNA条形码扩增引物扩增获得的有效序列比例

序列表

<110> 广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心）

<120> 一种鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对、试剂盒及方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcaaccaacc acaaagacat tggcac 26

<210> 2

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tagacttctg ggtggccaaa gaatca 26

Claims (8)

1.一种鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对，其特征在于，所述的引物对的上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述的引物对的下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.一种鉴别鱼翅种的DNA条形码试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包含DNeasy mericonFood Kit DNA提取试剂盒。

4.一种鉴别鱼翅种的DNA条形码方法，其特征在于，包括以下步骤：

a.提取待测鱼翅样品的DNA；

b.利用所述的鉴别鱼翅种的DNA条形码引物对对待测鱼翅样品DNA进行PCR扩增；

c.对PCR产物进行测通及拼接获取COI序列，将获得的COI序列进行数据库比对及聚类分析鉴定，确定待测鱼翅样品的种属。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的鱼翅种包括低鳍真鲨、大青鲨、尖吻鲭鲨、尖吻斜锯牙鲨、路氏双髻鲨、犁头鳐、丝鲨、无沟双髻鲨、尖齿柠檬鲨、舒氏星鲨、高鳍真鲨、浅海长尾鲨和沙拉真鲨。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤a中利用DNeasy mericon FoodKit DNA提取试剂盒提取待测鱼翅样品的DNA。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中PCR扩增的反应体系为：10×PCR Buffer 2.5μL，2.5mM dNTP Mixture 2.0μL，10μM上、下游引物各0.5μL，Taq 0.5μL；加水补至25.0μL。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述的步骤b中PCR扩增的反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，35个循环；72℃延伸5min。

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