CN111381045B - 一种跨膜蛋白的检测方法 - Google Patents

一种跨膜蛋白的检测方法 Download PDF

Info

Publication number
CN111381045B
CN111381045B CN202010063756.6A CN202010063756A CN111381045B CN 111381045 B CN111381045 B CN 111381045B CN 202010063756 A CN202010063756 A CN 202010063756A CN 111381045 B CN111381045 B CN 111381045B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
extraction reagent
membrane
sample
minutes
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010063756.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111381045A (zh
Inventor
练杨华
晏剑虹
张瑶
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuhan Sanying Biotechnology Co ltd
Original Assignee
Wuhan Sanying Biotechnology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuhan Sanying Biotechnology Co ltd filed Critical Wuhan Sanying Biotechnology Co ltd
Priority to CN202010063756.6A priority Critical patent/CN111381045B/zh
Publication of CN111381045A publication Critical patent/CN111381045A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111381045B publication Critical patent/CN111381045B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种跨膜蛋白的检测方法。该方法为针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：1）用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；2）在4‑37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行western blot检测。本发明提出的跨膜蛋白检测方法，采用的蛋白提取液配方简单，性能温和，对蛋白质的结构和活性影响小，却可以高效地提取膜蛋白；且在4‑37℃条件下制样，蛋白不易形成聚集体，可以有效保留蛋白的三级结构，对跨膜蛋白的结构功能及后续免疫学实验影响较小。

Description

一种跨膜蛋白的检测方法
技术领域
本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种跨膜蛋白的检测方法。
背景技术
细胞膜蛋白（包括酶）以外在膜蛋白和内在膜蛋白两种形式分别与膜脂质相结合。外在膜蛋白是水溶性蛋白，以非共价键形式结合在膜表面蛋白质分子上，或结合在磷脂分子的亲水头上，而细胞膜磷脂分子的流动性与环境中的离子强度、温度等有关系，因此只要改变溶液的离子强度甚至提高温度就可以将外在膜蛋白从膜脂质上分离下来，而膜结构并不被破坏；内在膜蛋白又称跨膜蛋白，其将疏水的羟基部分与磷脂的疏水部分共价紧密结合，两端带有极性，贯穿膜的内外，这种结合方式有利于实现细胞与环境物质、能量和信息的交换，却使得膜蛋白提取变得很困难。
钠钾ATP酶通道蛋白和ATP结合盒式蛋白属于细胞膜上两类比较重要且有代表性的蛋白质。钠钾ATP酶通道蛋白属于内在膜蛋白，可产生和维持膜电位，调节控制细胞内外的离子成分，建立势能储备，在细胞膜物质跨膜运输、信号传递和细胞识别等重要的生理功能中起着非常重要的作用；ATP结合盒式蛋白有两个跨膜结构域，具有保守的功能结构域，可参与信号转导、细胞解毒及病毒防御等重要的生理过程。钠钾ATP酶通道蛋白和ATP结合盒式蛋白与多种人类疾病相关，提高钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白提取的数量和质量对于研究其功能有着重要的意义。
实验室中常用SDS或者RIPA裂解液裂解细胞，从得到的裂解液中检测目的蛋白，这种检测方法存在以下不足：SDS裂解液和RIPA裂解液通常会破坏蛋白组件完整性，并且改变它们的结构和功能特性，不利于后续免疫学实验的进行；如果目的蛋白是膜蛋白，SDS或者RIPA裂解液的提取效率低，利用该方法检测目的膜蛋白是比较困难的，需要进一步富集，才能得到理想的实验结果。
进一步来说，现在技术中膜蛋白的制样和检测过程中普遍存在以下问题：由于跨膜蛋白中嵌入脂双层内的蛋白是由一些非极性的氨基酸组成，疏水性很强，制样时若温度过高，则很容易形成聚集体，影响目的蛋白的检测。
发明内容
针对现有技术中的不足，本发明提出了一种跨膜蛋白的检测方法，该方法结合特定的提取条件和制样条件，膜蛋白提取率高且在4-37℃条件下制样，蛋白不易形成聚集体，可以有效保留蛋白的三级结构，有利于western blot对于目的跨膜蛋白的检测。
为实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：
一种跨膜蛋白的检测方法，所述方法为针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：1）用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；2）在4-37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行western blot检测；
所述组织或细胞中的跨膜蛋白的提取方法为：
步骤1、取抽提试剂A加入干净组织或细胞中，破碎细胞，获取混合组分；
步骤2、差速离心混合组分获取含有膜蛋白的粗组分；
步骤3、以抽提试剂B选择性分离含有膜蛋白的粗组分，获取组织中的跨膜蛋白；
所述抽提试剂A由以下成分组成：0.32M Sucrose，10mM Tris，1mM MgCl2•6H2O，120mM KCl，5mM EDTA，10mM NaF，调pH值至弱碱性；
所述抽提试剂B由以下成分组成：50mM HEPES，150mM NaCl，100mM KCl，1mMMgCl2•6H2O，10wt%甘油，2wt% TritonX-100，5mM EDTA，2mM EGTA，调pH值至弱碱性。
进一步地，所述跨膜蛋白为钠钾ATP酶通道蛋白、ATP结合盒式蛋白中的一种或两种。
进一步地，所述差速离心的具体操作方法为：
（1）4℃，300g离心混合组分10分钟，收集上清；沉淀使用膜蛋白抽提试剂A继续匀浆8-12次，4ºC，700g离心10分钟，收集并合并上清；
（2）4℃，700g离心步骤（1）上清10分钟，收集上清液至一新的离心管中；
（3）4℃，14000g离心步骤（2）所获上清液30分钟，以沉淀细胞膜碎片；继续4℃，14000g离心10秒，去除上清并保留沉淀。
进一步地，所述选择性分离含有膜蛋白的粗组分的具体操作方法为：加入抽提试剂B，涡旋2分钟，然后冰浴10分钟；涡旋过程中，涡旋操作依照启动5-12秒、停止5-12秒重复循环直至2分钟结束，从而使膜蛋白更好地从磷脂双分子层脱离下来。
进一步地，所述抽提试剂A的pH值调节至7.4。
进一步地，所述抽提试剂B的pH值调节至7.4。
进一步地，使用抽提试剂A之前，向抽提试剂A中加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠，所述PMSF和原钒酸钠的终浓度均为1µM。
进一步地，使用抽提试剂B之前，向抽提试剂B中加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠，所述PMSF和原钒酸钠的终浓度均为1µM。
进一步地，所述制样方法包括：
（1）检测膜蛋白提取物中蛋白浓度；
（2）根据步骤（1）测定的蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，充分混合，浓度调整至4µg/µl，样品备用；
（3）将步骤（2）制备好的样品静置于4-37℃条件下；
（4）将步骤（3）中的样品在4℃，10000g的条件下离心5分钟，留上清用于westernblot检测。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
（1）本发明提出的一种跨膜蛋白的检测方法，该方法结合特定的提取条件和制样条件，显著提高跨膜蛋白提取总量，且在4-37℃条件下制样，蛋白不易形成聚集体，有利于western blot对于目的蛋白的检测，可以有效保留蛋白的三级结构，对跨膜蛋白的结构功能及后续免疫学实验影响较小。
（2）本发明的膜蛋白抽提试剂主要成分是Triton X-100和蔗糖，裂解强度温和，对蛋白的活性和功能影响低；采用差速离心法进一步富集目的膜蛋白。因此，本发明优化的膜蛋白提取试剂配方简单、优化的提取工艺步骤简单，其膜蛋白提取率却显著提高。
（3）本发明的检测方法所用试剂都是实验室常规试剂；同时，对于提取的膜蛋白的样品的处理只需要使用实验室常规的仪器设备，因此，本发明的检测方法适用于大部分实验室。
附图说明
图1A至D为实施例1方法提取的膜蛋白经4℃、25℃、37℃处理后进行钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB检测图，其中图1A、图1B、图1C、图1D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。
图2A至D为实施例2中37℃处理RIPA裂解液、SDS裂解液、本发明的膜蛋白提取液后进行钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB对照检测图，其中图2A、图2B、图2C、图2D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。
图3A至D为实施例3方法提取的膜蛋白在不同制样条件（不同温度）下钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB检测图，其中图3A、图3B、图3C、图3D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。
具体实施方式
展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的精神和范围之内。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下3个实施例提取自小鼠大脑组织膜蛋白或HepG2细胞膜蛋白，并对钠钾ATP酶通道蛋白ATP1A1、ATP1A3和ATP结合盒式蛋白ABCC1、ABCC4进行跨膜蛋白检测，但本发明检测的跨膜蛋白并不局限于钠钾ATP酶通道蛋白ATP1A1、ATP1A3和ATP结合盒式蛋白ABCC1、ABCC4。
实施例1
1、实验材料预处理
准备好冰盒、将膜蛋白抽提试剂A、膜蛋白抽提试剂B和PBS提前冰浴，试剂在使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠（PMSF和原钒酸钠的使用终浓度均为1µM）。
抽提试剂A由以下成分组成：0.32M Sucrose，10mM Tris，1mM MgCl2•6H2O，120mMKCl，5mM EDTA，10mM NaF，调pH值至7.4；
所述抽提试剂B由以下成分组成：50mM HEPES，150mM NaCl，100mM KCl，1mMMgCl2•6H2O，10wt%甘油，2wt% TritonX-100，5mM EDTA，2mM EGTA，调pH值至7.4。
2、提取膜蛋白
（1）取新鲜的小鼠大脑组织用预冷的PBS洗净脂肪和血液等杂质；用细胞刮收集HepG2细胞，连同培养液一起，在 4℃条件下 500 g 离心 5 min，取沉淀，用预冷的 PBS 洗涤两次，在 4℃条件下 500 g 离心 5 min，倒掉上清。将洗干净的小鼠大脑组织块转移到干净的平皿中，加入膜蛋白抽提试剂A用200目的筛网研磨充分（每克小鼠大脑组织使用10ml膜蛋白抽提试剂A）；将膜蛋白抽提试剂A加入离心后的HepG2细胞中（每2×107个细胞使用10ml膜蛋白抽提试剂A）。然后分别转移至对应大小的预冷玻璃匀浆器中匀浆30下左右，取5µl匀浆液在显微镜下观察，如果有70%-80%的细胞无完整细胞形态，则可进行下一步实验。否则，重新匀浆。
（2）取步骤（1）的匀浆液4ºC、300g离心10分钟，收集上清。沉淀使用适量的膜蛋白抽提试剂A继续匀浆10次左右，4ºC，700g离心10分钟，合并上清。
（3）步骤（2）上清液4ºC、700g离心上清10分钟，小心收集上清液至一新的离心管中。
（4）步骤（3）上清液4ºC、14000g离心30分钟，以沉淀细胞膜碎片。
（5）继续以4ºC、14000g离心10秒，尽最大努力吸尽上清。向沉淀中加入膜蛋白抽提试剂B，涡旋2分钟（开10秒，关10秒重复循环直至2分钟结束），然后冰浴10分钟。
（6）重复前述步骤的涡旋和冰浴孵育2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4ºC，14000g离心5分钟，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。
3、使用BCA法检测样品蛋白浓度
4、制样
（1）根据测定的蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，充分混合，浓度调整至4µg/µl，样品备用；
（2）取3份步骤（1）制备好的样品，分别置于4℃、25℃、37℃条件下处理样品，具体操作为：一份样品在4℃静置45min，另两份样品分别在25℃、37℃水浴45 min。
（3）将步骤（2）中处理的样品在4℃，10000g的条件下离心5分钟，留上清用于western blot检测。
5、蛋白检测
（1）制备6%的SDS-PAGE胶，每种样品各点样30µg，并点上标准品。
（2）开始用80v电压电泳，当溴酚蓝进入下层胶时，将电压调至120v。当溴酚蓝刚刚跑出胶时，停止电泳。
（3）采用恒流法(200mA，90min）进行湿法转膜。
（4）分别用钠钾ATP酶通道蛋白ATP1A1、ATP1A3和ATP结合盒式蛋白ABCC1、ABCC4的一抗和相应二抗进行免疫交联。
（5）曝光显色，结果见图1A至D。
图1A至D为进行钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB检测图，其中图1A、图1B、图1C、图1D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。由图可得：使用本发明的跨膜蛋白检测方法可以得到稳定的WB检测结果。
实施例2
1、实验材料预处理
取新鲜的小鼠大脑组织用预冷的PBS洗净脂肪和血液等杂质；用细胞刮收集HepG2细胞，连同培养液一起，在 4℃条件下 500 g 离心 5 min，取沉淀，用预冷的 PBS 洗涤两次，在 4℃条件下 500 g 离心 5 min，倒掉上清。
2、SDS裂解液及RIPA裂解液实验组
（1）将洗干净的小鼠大脑组织块用滤纸吸干水分，放入预冷过的陶瓷研钵中，加入适量PMSF及原钒酸钠，用剪刀将其剪碎。加入适量的液氮，反复研磨，将组织块研磨到如面粉一般细，将粉末转移到离心管中。
（2）向上述研磨好的盛有小鼠大脑组织的离心管和离心后的盛有HepG2的离心管中分别加入适量的SDS裂解液或RIPA裂解液，裂解液在使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠，用移液枪混匀。
（3）将混匀好的样品转移到对应大小的预冷玻璃匀浆器中，在冰盒中上下匀浆30次左右，避免气泡产生，移动研杵应慢且稳。匀浆完成后转移到对应大小的离心管中。
（4）如果使用的是RIPA裂解液则需在冰盒中冰浴裂解30min，期间轻轻混匀使其裂解更充分，裂解完成后再超声破碎；如果使用的是SDS裂解液则可以直接进行超声破碎。
（5）将样品放在冰上，使用超声破碎仪200W，超声2.5min，拿出放在冰盒中静置2.5min，再重复上述超声步骤一次。超声过程中避免泡沫产生，以免温度升高，使蛋白降解。超声结束后观察破碎效果。
3、膜蛋白提取液实验组：
（1）准备好冰盒、将膜蛋白抽提试剂A、膜蛋白抽提试剂B和PBS提前冰浴，试剂在使用前加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠（PMSF和原钒酸钠的使用终浓度均为1µM）。膜蛋白抽提试剂A、膜蛋白抽提试剂B同实施例1。
（2）将洗干净的小鼠大脑组织块转移到干净的平皿中，加入膜蛋白抽提试剂A用200目的筛网研磨充分（每克小鼠大脑组织使用10ml膜蛋白抽提试剂A）；将膜蛋白抽提试剂A加入离心后的HepG2细胞中（每2×107个细胞使用10ml膜蛋白抽提试剂A）。然后分别转移至对应大小的预冷玻璃匀浆器中匀浆30下左右，取5ul匀浆液在显微镜下观察，如果有70%-80%的细胞无完整细胞形态，则可进行下一步实验。否则，重新匀浆。
（3）4ºC，300g离心10分钟，收集上清。沉淀使用适量的膜蛋白抽提试剂A继续匀浆10次左右，4ºC， 700g离心10分钟，合并上清。
（4）4ºC，700g离心上清10分钟，小心收集上清液至一新的离心管中。
（5）4ºC，14000g离心30分钟，以沉淀细胞膜碎片。
（6）4ºC，14000g离心10秒，尽最大努力吸尽上清。向沉淀中加入膜蛋白抽提试剂B，涡旋2分钟（开10秒，关10秒），然后冰浴10分钟。
（7）重复前述步骤的涡旋和冰浴孵育2次，以充分抽提膜蛋白。随后，4ºC，14000g离心5分钟，收集上清即为细胞膜蛋白溶液。
4、使用BCA法检测样品蛋白浓度。
5、制样
（1）根据测定的蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，充分混合，浓度调整至4µg/µl，样品备用；
（2）将提取的RIPA样品、SDS样品和膜蛋白样品，于37℃条件下水浴45 min。
（3）将步骤（2）中处理的样品在4℃，10000g的条件下离心5分钟，留上清用于western blot检测。
6、跨膜蛋白检测
（1）制备6%的SDS-PAGE胶，每种样品各点样30µg，并点上标准品。
（2）开始用80v电压电泳，当溴酚蓝进入下层胶时，将电压调至120v。当溴酚蓝刚刚跑出胶时，停止电泳。
（3）采用恒流法(200mA，90min）进行湿法转膜。
（4）分别用钠钾ATP酶通道蛋白ATP1A1、ATP1A3和ATP结合盒式蛋白ABCC1、ABCC4的一抗和相应二抗进行免疫交联。
（5）曝光显色，结果见图2A至D。
图2A至D为RIPA裂解液、SDS裂解液、本发明的膜蛋白提取液制样后钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB对照检测图，其中图2A、图2B、图2C、图2D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。由图可得：使用本发明检测到的钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白总量最多。
实施例3
1、实验材料预处理
实验材料预处理方法同实施例1。
2、提取膜蛋白
提取膜蛋白方法同实施例1。
3、使用BCA法检测样品蛋白浓度
4、制样
（1）根据测定的蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，充分混合，浓度调整至4µg/µl，样品备用；
（2）取9份步骤（1）制备好的样品，将提取的膜蛋白样品分别于4℃、25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃和100℃进行样品处理，具体操作为：一份样品在4℃静置45min，另八份样品分别在25℃、37℃、45℃、55℃、65℃、75℃、85℃和100℃水浴45 min。
（3）将步骤（2）中处理的样品在4℃，10000g的条件下离心5分钟，留上清用于western blot检测。
5、蛋白检测
（1）制备6%的SDS-PAGE胶，每种样品各点样30µg，并点上标准品。
（2）开始用80v电压电泳，当溴酚蓝进入下层胶时，将电压调至120v。当溴酚蓝刚刚跑出胶时，停止电泳。
（3）采用恒流法(200mA，90min）进行湿法转膜。
（4）分别用钠钾ATP酶通道蛋白ATP1A1、ATP1A3和ATP结合盒式蛋白ABCC1、ABCC4的一抗和相应二抗进行免疫交联。
（5）曝光显色，结果见图3A至D。
图3A至D为不同制样条件（不同温度）下钠钾ATP酶通道蛋白及ATP结合盒式蛋白的WB检测图，其中图3A、图3B、图3C、图3D分别为ATP1A1蛋白、ATP1A3蛋白、ABCC1蛋白、ABCC4蛋白的检测结果。由图可得：使用本发明在4-37℃处理膜蛋白样品，检测到的目的蛋白聚集带少甚至没有，WB检测结果比较好；37（不包括37℃）-100℃条件下，随着温度的升高，蛋白聚集体积累的越来越多，导致在相应的分子量处检测到的目的蛋白减少。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述方法为针对跨膜蛋白提取和制样的组合检测方法，包括：
用膜蛋白抽提试剂提取组织或细胞中的跨膜蛋白获取膜蛋白提取物；
在4-37℃条件下对提取的膜蛋白提取物制样并对样品进行western blot检测；
所述组织或细胞中的跨膜蛋白的提取方法为：
步骤1：取抽提试剂A加入干净组织或细胞中，破碎细胞，获取混合组分；
步骤2：差速离心混合组分获取含有膜蛋白的粗组分；
步骤3：以抽提试剂B选择性分离含有膜蛋白的粗组分，获取组织中的跨膜蛋白；所述抽提试剂A由以下成分组成：0.32M Sucrose，10mM Tris，1mM MgCl2·6H2O，120mM KCl，5mMEDTA，10mM NaF，调pH值至弱碱性；
所述抽提试剂B由以下成分组成：50mM HEPES，150mM NaCl，100mM KCl，1mM MgCl2·6H2O，10wt％甘油，2wt％TritonX-100，5mM EDTA，2mM EGTA，调pH值至弱碱性；
所述膜蛋白提取物制样方法步骤包括：
S1.检测膜蛋白提取物中蛋白浓度；
S2.根据步骤S1测定的蛋白浓度，加入蛋白上样缓冲液，充分混合，浓度调整至4μg/μl，样品备用；
S3.将步骤S2制备好的样品静置于4-37℃条件下；
S4.将步骤S3中的样品在4℃，10000g的条件下离心5分钟，留上清用于western blot检测。
2.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述跨膜蛋白为钠钾ATP酶通道蛋白、ATP结合盒式蛋白中的一种或两种。
3.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述差速离心的具体操作方法为：
(1)4℃，300g离心混合组分10分钟，收集上清；沉淀使用膜蛋白抽提试剂A继续匀浆8-12次，4℃，700g离心10分钟，收集并合并上清；
(2)4℃，700g离心步骤(1)中所收集的上清10分钟，收集上清液至一新的离心管中；
(3)4℃，14000g离心步骤(2)所获上清液30分钟，以沉淀细胞膜碎片；继续4℃，14000g离心10秒，去除上清并保留沉淀。
4.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述选择性分离含有膜蛋白的粗组分的具体操作方法为：加入抽提试剂B，涡旋2分钟，然后冰浴10分钟；涡旋过程中，涡旋操作依照启动5-12秒、停止5-12秒重复循环直至2分钟结束。
5.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述抽提试剂A的pH值调节至7.4。
6.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，所述抽提试剂B的pH值调节至7.4。
7.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，使用抽提试剂A之前，向抽提试剂A中加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠，所述PMSF和原钒酸钠的终浓度均为1μM。
8.根据权利要求1所述的一种跨膜蛋白的检测方法，其特征在于，使用抽提试剂B之前，向抽提试剂B中加入蛋白酶抑制剂PMSF和原钒酸钠，所述PMSF和原钒酸钠的终浓度均为1μM。
CN202010063756.6A 2020-01-20 2020-01-20 一种跨膜蛋白的检测方法 Active CN111381045B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010063756.6A CN111381045B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种跨膜蛋白的检测方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010063756.6A CN111381045B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种跨膜蛋白的检测方法

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111381045A CN111381045A (zh) 2020-07-07
CN111381045B true CN111381045B (zh) 2023-07-25

Family

ID=71218610

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010063756.6A Active CN111381045B (zh) 2020-01-20 2020-01-20 一种跨膜蛋白的检测方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111381045B (zh)

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102375062A (zh) * 2010-08-19 2012-03-14 上海市第六人民医院 乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段检测方法
CN104447975A (zh) * 2014-11-18 2015-03-25 深圳市人口和计划生育科学研究所 一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6773894B1 (en) * 2000-01-21 2004-08-10 Biochain Institute, Inc. Isolation and extraction of subcellularly compartmentalized protein
CN101835798A (zh) * 2007-08-21 2010-09-15 新英格兰生物实验室公司 将感兴趣蛋白靶向宿主细胞包膜的方法和组合物
DE102007060599A1 (de) * 2007-12-15 2009-06-18 Merck Patent Gmbh Verfahren zur Extraktion von Membranproteinen
CN103816540B (zh) * 2012-11-16 2018-01-02 中国科学院上海生命科学研究院 降低β‑抑制蛋白1与APH‑1蛋白的结合的物质在制备防治神经退行性疾病药物中的应用
GB201509575D0 (en) * 2015-06-03 2015-07-15 King S College London Diagnostic target
CN108383901A (zh) * 2018-02-12 2018-08-10 昆明医科大学 一种脑组织膜蛋白的提取方法
CN110437301A (zh) * 2019-08-27 2019-11-12 上海美吉生物医药科技有限公司 一种适合环境类样本和粪便类样本的宏蛋白提取方法
CN110488000B (zh) * 2019-08-28 2021-02-23 武汉金开瑞生物工程有限公司 一种用于抽提膜蛋白的裂解液

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102375062A (zh) * 2010-08-19 2012-03-14 上海市第六人民医院 乳酸杆菌整合膜蛋白活性片段检测方法
CN104447975A (zh) * 2014-11-18 2015-03-25 深圳市人口和计划生育科学研究所 一种提取人肿瘤细胞膜蛋白的方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111381045A (zh) 2020-07-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111257073B (zh) 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-大分子载体偶联复合物
CN111253491B (zh) 一种用于分离临床样本中的糖基化外泌体的凝集素-磁性载体偶联复合物
EP2373390A1 (de) Parallel-extraktion von unterschiedlichen biomolekülen aus formalin-fixiertem gewebe
CN109468265B (zh) 一种提取乳外泌体的方法
WO2009135936A1 (de) Verfahren zur anreicherung und isolierung von biomolekülen oder viren
CN112048471A (zh) 一种骨髓间充质干细胞外泌体的制备方法
CN113774008A (zh) 一种外泌体的提取方法及其应用
CN109207473B (zh) 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法
CN106497915A (zh) 一种磁珠法提取唾液核酸的裂解液
CN112831457A (zh) 一种分离和浓缩外泌体的方法
CN111381045B (zh) 一种跨膜蛋白的检测方法
CN112852725A (zh) 利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用
WO2023246012A1 (zh) 一种分离提取胃癌组织来源细胞外囊泡多种亚群的方法
DE102006060717B4 (de) Verfahren zur Aufreinigung wenigstens einer nachzuweisenden Zielsubstanz
CN116116385B (zh) 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法
CN113029728B (zh) 一种使用冰冻切片机提高组织外泌体产量的方法
CN110548138B (zh) 适配体修饰的α-Gal脂质体及其制备方法与应用
CN110777083A (zh) 一种从酵母细胞中提取外泌体的方法
CN114397388B (zh) 一种基于peg沉淀法与sec柱法相结合的尿液外泌体提取试剂盒及应用
CN113234677A (zh) 一种从体外肿瘤组织中提取外泌体的方法
CN112980006A (zh) 蛋白交联纳米亲和微球及制备方法和应用
CN112574950A (zh) 一种细胞外泌体的提取方法
CN116555160B (zh) 一种白芍外泌体和汤剂体的提取方法
CN114457066B (zh) 一种dna提取方法、试剂盒以及构建的dna文库
CN114350610B (zh) 一种用于分离脑和脊髓组织细胞核的试剂盒及细胞核的分离方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant