CN110777083A - 一种从酵母细胞中提取外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种从酵母细胞中提取获得的外泌体，所述外泌体内部含有特异肽段蛋白。本发明还提供了一种从酵母细胞中提取外泌体的方法，包括以下步骤：对酵母细胞进行培养，获得细胞培养物后进行离心，收集上清过滤后，将上清与分离液混合，再次离心，获得的沉淀物即为酵母细胞外泌体。本发明的外泌体是从酵母细胞中提取获得，它含有特异肽段蛋白，基于该特点可将其作为酵母的标志物，运用于临床，具有极大的市场前景和应用价值。

Description

一种从酵母细胞中提取外泌体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从酵母细胞中提取外泌体的方法。
背景技术
外泌体是细胞主动分泌的，大小均一，直径为30～100nm，密度是1.10～1.18g/ml的囊泡小体，其本质是脂质双分子层。外泌体大多含有微管蛋白、肌动蛋白、热休克蛋白及CD9、CD63等，还携带有大量母细胞来源的蛋白，如抗原提呈细胞来源的外泌体上富含主要组织相容性复合体(MHC)、T细胞来源的外泌体上携带CD3，其核酸主要为信使RNA(mRNA)和微小RNA(miRNA)，可调节遗传信息的表达(贺娇，中华实用诊断与治疗杂志，2018年7月)。在大多数体液中如外周血、唾液、尿液、脑脊液、关节液、精液、羊水、腹水等体液中可检测到外泌体。与同源组织器官类型的正常细胞和正常体液相比，肿瘤细胞能分泌更多的外泌体，癌性体液能包含更多的外泌体。不同细胞来源的外泌体，其内容物也有所不同，但都富含生物活性分子，如核酸、蛋白质、脂质。外泌体所携带的内容物作用于靶细胞，使细胞间的通信得以进行，最终实现调节靶细胞基因表达和细胞功能。研究表明，外泌体能携带肿瘤遗传信息，影响肿瘤微环境的形成，促进肿瘤血管生成，增强肿瘤细胞侵袭和转移能力，介导肿瘤免疫抑制及参与肿瘤放化疗抵抗，进而促进肿瘤的发生、发展。根据其生物学特征，外泌体能在体液中被检测到，检测体液中外泌体的水平及其所含的miRNAs和DNA可以反映肿瘤进展和治疗预后，可作为一种新的癌症诊断标志物，在疾病诊断和临床方面中有较好的应用前景(钟国斌，重庆医学2018年11月)。
目前主要从体液和体外细胞培养液中提取外泌体。液体样本中提取外泌体的方法，如专利：人体体液(血液)中外泌体的提取方法(CN201610597323.2)，从唾液样本中提取外泌体的方法，如专利：唾液外泌体的制备方法及其在分子诊断中的应用(CN201610035433.X)，从尿液中提取外泌体的方法，如专利：从尿液中分离肿瘤细胞来源的外泌体的方法(CN201510918998.8)；还有从体外培养的细胞中提起外泌体的方法，例如：一种诱导多能干细胞外泌体提取培养基及其制备方法和利用其提取外泌体的方法(CN201810647971.3)，一种带有人关节液间充质干细胞外泌体提取物的风湿骨痛疾病治疗注射剂及其制备方法(CN201810803937.0)等，但是从酵母细胞中获得外泌体的方法还未见报道。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种从酵母细胞中提取外泌体的方法。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种细胞外泌体，其特征在于，所述外泌体是从酵母细胞中提取获得，所述外泌体内部含有特异肽段蛋白，以及miRNA、tRNA、rRNA、snRNA中的至少一种。
一种从酵母细胞中提取外泌体的方法，包括以下步骤：对酵母细胞进行培养，获得细胞培养物后进行离心，收集上清过滤后，将上清与分离液混合，再次离心，获得的沉淀物即为酵母细胞外泌体。
优选地，所述酵母细胞培养通过以下方式实现：将酵母细胞进行原代培养，传至2～3，使细胞融合度达到80～90％时，收集细胞，进行消化。
优选地，所述消化通过以下方式实现：用胰酶消化，所述消化液为0.05％EDTA和0.3％胰蛋白酶1∶4的混合液，在37℃温箱内孵育15～20min，培养液的pH值为7.4～7.5。
优选地，所述离心还包括以下步骤：收集细胞培养上清，室温或4℃条件下离心3500g，5min，去除细胞碎片，将培养上清分别经过直径为1μm，0.45μm及0.22μm滤膜过滤。
优选地，所述上清与分离液混合通过以下方式实现：以聚乙烯醇为分离液，取收集的酵母细胞培养上清液与外泌体分离液以体积比为上清液:分离液＝3:1的比例混合，混合后上下颠倒。
优选地，所述聚乙烯醇浓度为100～900mg/ml。
优选地，所述聚乙烯醇浓度为300～800mg/ml。
优选地，所述聚乙烯醇浓度为400mg/ml。
本发明的有益效果：本发明的外泌体是从酵母细胞中提取获得，它含有特异肽段蛋白，基于该特点可将其作为酵母的标志物，运用于临床，具有极大的市场前景和应用价值。
具体实施方式
为了更加简洁明了的展示本发明的技术方案、目的和优点，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细描述。
实施例1
1材料
培养液RPMI购自Gibco公司；牛血清(fetal bovine serum，FBS)购自Sigma公司；胰蛋白酶、EDTA购自Invitrogen公司。
2方法
2.1获得酵母细胞
将酵母细胞用含有10％胎牛血清的RPMI培养基，置于5％CO2、37℃饱和湿度的培养箱内培养进行原代培养，用0.25％的胰蛋白酶消化液消化传至3代后，用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化以去除，最后得到细胞系，其中传代时用0.05％的EDTA和0.3％胰蛋白酶1∶4的混合液在37℃温箱内孵育15～20min，培养液的pH值为7.4～7.5。
2.2酵母细胞培养上清的处理
收集细胞培养上清，室温或4℃条件下离心3500g，5min，去除细胞碎片；将培养上清分别经过直径为1μm，0.45μm及0.22μm滤膜过滤，以去除其中可能存在的凋亡小体。
2.3收获外泌体
将聚乙烯醇配制成浓度为500mg/ml的外泌体分离液，取收集的酵母细胞培养上清液30ml与外泌体分离液混合，以体积比为上清液:分离液＝3:1的比例混合，得到混合液。混合后上下颠倒，放入4℃冰箱静置过夜。过夜后取出，4℃条件下2500×g离心30min，取出倒掉上清液，收集的沉淀即为酵母细胞的外泌体。
实施例2酵母细胞的外泌体蛋白鉴定
在酵母细胞的外泌体中加入磷酸缓冲液，制备成悬浮液。取1ml其悬浮液，再加入2μLTriton-100(聚乙二醇辛基苯基醚)、5μL蛋白酶抑制剂cocktail冰上裂解30分钟。在4℃，15000g离心60分钟，上清即为外泌体蛋白裂解液。取1.0μg唾液外泌体蛋白进行HPLC检测，并采用q-TOF-MS/MS，对得到了酵母细胞外泌体肽段进行鉴定，本发明方法得到了更多的肽段组分。
表1本发明方法和离心方法提取外泌体蛋白的对比
方法 酵母细胞外泌体蛋白 SD RSD(％)
本发明方法 8.23±1.2 0.056 1.28
离心方法 5.84±0.9 0.081 3.55
由表1可知，本发明的方法相比离心得方法更稳定可信且得到了更多的外泌体蛋白，说明本方法有助于酵母细胞外泌体及外泌体蛋白的提取。
实施例3酵母细胞的外泌体RNA含量检测
将上述获得细胞外泌体采用Trizol法提取RNA，使用Agilent2200核酸自动化电泳系统，按照High Sensitivity RNA检测试剂说明书指示进行RNA浓度和质量检测，具体如下：
取1μL对应的RNA sample，4μL sample buffer(共5μL)混匀。混匀的样品在PCR仪中72℃孵育3min，孵育后在冰上放置2min，短暂离心使样品集中在8联管底部。把8联管放入Agilent220核酸自动化电泳系统的样品槽中，进行自动化电泳，结果如表2所示。
表2酵母细胞的外泌体RNA含量检测
小RNA种类 含量 占比
miRNA 3620 34％
tRNA 1256 1.2％
rRNA 2314 2.6％
snRNA 1036 0.8％
其他 4215 45％
由上表可知，本发明的外泌体中含有所述外泌体内部含有miRNA、snRNA等核酸物质。
实施例4
将聚乙烯醇配制成以不同浓度的分离液，选出聚乙烯醇提取酵母细胞的外泌体的最佳分离液浓度，结果如表4所示：
表3：不同浓度聚乙烯醇提取外泌体的效果
Figure BDA0002261222420000051
Figure BDA0002261222420000061
由表3可以看随着聚乙烯醇浓度的提高，提取的蛋白和核酸含量越高，但是当聚乙烯醇浓度为400mg/ml时，提取的蛋白和核酸物质的含量最高，提取效果最佳。因此，当聚乙烯醇浓度为400mg/ml时，为本发明的最优选方案。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (9)

1.一种细胞外泌体，其特征在于，所述外泌体是从酵母细胞中提取获得，所述外泌体内部含有特异肽段蛋白，以及miRNA、tRNA、rRNA、snRNA中的至少一种。
2.一种从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：对酵母细胞进行培养，获得细胞培养物后进行离心，收集上清过滤后，将上清与分离液混合，再次离心，获得的沉淀物即为酵母细胞外泌体。
3.如权利要求2所述的从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，所述酵母细胞培养通过以下方式实现：将酵母细胞进行原代培养，传至2～3，使细胞融合度达到80～90％时，收集细胞，进行消化。
4.如权利要求2所述的从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，所述消化通过以下方式实现：用胰酶消化，所述消化液为0.05％EDTA和0.3％胰蛋白酶1∶4的混合液，在37℃温箱内孵育15～20min，培养液的pH值为7.4～7.5。
5.如权利要求2所述的从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，所述离心还包括以下步骤：收集细胞培养上清，室温或4℃条件下离心3500g，5min，去除细胞碎片，将培养上清分别经过直径为1μm，0.45μm及0.22μm滤膜过滤。
6.如权利要求2所述的从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，所述上清与分离液混合通过以下方式实现：以聚乙烯醇为分离液，取收集的酵母细胞培养上清液与外泌体分离液以体积比为上清液:分离液＝3:1的比例混合，混合后上下颠倒。
7.如权利要求6所述的从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，所述聚乙烯醇浓度为100～900mg/ml。
8.如权利要求7所述的从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，所述聚乙烯醇浓度为300～800mg/ml。
9.如权利要求9所述的从酵母细胞中提取外泌体的方法，其特征在于，所述聚乙烯醇浓度为400mg/ml。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113583950A (zh) * 2021-08-06 2021-11-02 合肥滴碧云生物科技有限公司 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用
CN116042422A (zh) * 2023-02-07 2023-05-02 广东丸美生物技术股份有限公司 一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130273544A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Life Technologies Corporation Methods and compositions for exosome isolation
US20160331686A1 (en) * 2015-05-12 2016-11-17 Clsn Laboratories, Inc. Compositions and Methods for Yeast Extracellular Vesicles as Delivery Systems

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20130273544A1 (en) * 2012-04-17 2013-10-17 Life Technologies Corporation Methods and compositions for exosome isolation
US20160331686A1 (en) * 2015-05-12 2016-11-17 Clsn Laboratories, Inc. Compositions and Methods for Yeast Extracellular Vesicles as Delivery Systems

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
钱立生，金光明: "精细化工配方常用原料手册", 安徽科学技术出版社, pages: 1094 - 1095 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113583950A (zh) * 2021-08-06 2021-11-02 合肥滴碧云生物科技有限公司 一种制备干细胞活性因子的方法及其应用
CN116042422A (zh) * 2023-02-07 2023-05-02 广东丸美生物技术股份有限公司 一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用
CN116042422B (zh) * 2023-02-07 2024-03-26 广东丸美生物技术股份有限公司 一种酵母来源外泌体及其制备方法和应用

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