JP2021193070A - 杜仲葉由来のエクソソームを含むウイルス感染症改善剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】植物由来のエクソソームは、植物に含有される割合が極めて少なく世界中でいろいろな植物が、試験されている。本発明は、医薬または食品に利用可能な植物由来のエクソソーを見出すことを課題とする。【解決手段】杜仲葉由来のエクソソームであって、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含むウイルス感染症改善剤。【選択図】図１
Description
本発明は、杜仲葉を加工した生成物に関する。さらに詳細には、杜仲葉加工物を含む、ウイルス感染症改善剤、杜仲葉エクソソームに内包されるＲＮＡの内、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）に基する改善剤に関する。さらに本発明は、当該ウイルス感染症改善剤、杜仲葉エクソソームに内包されるＲＮＡの内、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）に基する改善剤を含む経口摂取用組成物、医薬組成物、食品組成物等に関する。
近年の研究により細胞間のコミュニケーションに細胞外小胞（Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｖｅｓｉｃｌｅｓ、ＥＶ）が使用されているということが知られ、そのサイズや生物学的機能からＥｘｏｓｏｍｅｓ（エクソソーム）、Ｍｉｃｒｏｖｅｓｉｃｌｅｓ（ＭＶ； 微小小胞体）などに分類され、中でも直径３０−１５０ｎｍの小胞はエクソソームと呼ばれ、近年生体内での機能の解明が急速に進んでいる。エクソソームの膜表面上にはテトラスパニン（Ｔｅｔｒａｓｐａｎｉｎ）と呼ばれる４回膜貫通タンパク質が多く発現しており、ＣＤ９やＣＤ６３といった分子が一般的なエクソソームのマーカーとして知られている。内部にはタンパク質、脂質、核酸などが含まれている。「エクソソーム」自体の発見は今から３０年ほど前にさかのぼるが、発見当初は細胞の不要物的な存在としか認知されず、その機能や存在意義などは長い間、不明であった。ところが、２００８年にエクソソーム内にメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）や機能的に重要な役割を担っているｓｍａｌｌ ｎｃＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）ｍｉＲＮＡを含む核酸物質が内包されて他の細胞へと受け渡されている可能性が示されるや否や、ここ数年の間に関連研究が一気に加速し、今日に至っている。
エクソソームの中には、ＲＮＡが内包されており、ＲＮＡは、翻訳されるかどうかで大きく２種類に分けられる。翻訳を受けるＲＮＡからは、タンパク質が合成される。ＤＮＡからタンパク質をコードする配列をコピーして、タンパク質合成を担うリボソームまでＤＮＡの遺伝情報を運ぶ役目を持つメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）がこれに相当する。他方のｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）は、ゲノム上にコードされ、多段階的な生成過程を経て最終的に２０から２５塩基長の微小ＲＮＡとなる機能性核酸である。この鎖長の短いｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）は、機能性のｎｃＲＮＡ （タンパク質へ翻訳されないＲＮＡの総称）に分類されており、ほかの遺伝子の発現を調節する、生命現象において重要な役割を担っている事が、明らかになっている。ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）は、その標的ｍＲＮＡに対して不完全な相同性をもって結合し、一般に標的遺伝子の３’ＵＴＲを認識して、標的ｍＲＮＡを不安定化するとともに翻訳抑制を行うことでタンパク質産生を抑制する。ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）が介する転写抑制は、発生、細胞増殖および細胞分化、アポトーシスまたは代謝といった広範な生物学的プロセスに重要な役割を担うことが明らかになった。
エクソソーム、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）が、上皮間葉転換制御（上皮細胞がその細胞極性や周囲の細胞との接着機能を喪失し，未分化な間葉様細胞へと脱分化することで遊走能や浸潤能を獲得するプロセスを制御）やがん幹細胞の制御にも関与し、乳癌、肺癌、大腸癌、糖尿病の改善効果などが期待されていたが、令和元年６月には、東京医科大学などにより上皮間葉転換（ＥＭＴ）に関わる２種類のｍｉＲ（ｍｉＲ−５０９−５ｐとｍｉＲ−１２４３）が同定された。これにより乳癌、肺癌、大腸癌、糖尿病の改善効果への改善作用が明らかになった。
杜仲（Ｅｕｃｏｍｍｉａ ｕｌｍｏｉｄｅｓ）は、中国中央部起源のトチュウ科トチュウ属の一科一属一種に分類される落葉性木本類で、樹高が２０ｍに達する立木である。杜仲は、一般にお茶と称するツバキ科の植物と比較し、カフェインを全く含んでいないほか、含有物も異なる。杜仲葉は、１９８０年代から飲料としての用途が普及している。杜仲の樹皮は医薬品として取り扱われており、中国では「高血圧症、腰痛、関節痛、腎臓病、肝臓病、ストレス、精力減退、利尿困難、物忘れ」に有効な漢方薬として利用されている。発明者らは、この杜仲の葉を、収穫後直ちに発酵を阻止しさらに粉末状にすることで、機能性分や栄養成分の高い食品を開発してきたが、その機能性の高さは、肺癌、大腸癌、乳癌、血糖値、アレルギー、ウイルス、Ｂ１６細胞メラニン産生抑制効果、アトピーなどの改善効果が顕著に得られている。その為発明者らは、茨城大学や横浜市立大学らと癌の研究を行い、癌幹細胞を消滅させる新規化合物、ユーコミシンＡを発見し特許申請をしている（特許文献１参照）。
エクソソーム（３０−１５０ｎｍ）は「細胞外小胞」の中の氷山の一角であり、まだ未解明の部分が多く残されている。今後、バイオロジーから臨床研究まで、様々なアプローチで研究が展開されるであろうが、植物由来のエクソソームは、植物に含有される割合が極めて少なく世界中でいろいろな植物が、試験されている。バイオロジーの分野において「エクソソーム」を多く含有している生成物は、研究を進める上からも必要であり求められているが、発明者らは、２０１９年６月に東京医科大学と杜仲葉の緑粉末の中に、１ｍｇあたりエクソソームの粒子数を、５．７２×１０８個（溶媒ＰＢＳ）、２．３７×１０８個（溶媒 ＭｉｌｌｉＱ Ｗａｔｅｒ）が含有されていることを、見出している。
さらにエクソソームを抽出するのに溶解液として、塩基性のアルカリ性溶解液を使用するとエクソソームが、２倍得られることを見出した。また杜仲葉の先端部分にエクソソームが多く含有されていることを見出し、杜仲葉由来のエクソソームの含有率の高い抽出物を、得ることに成功した。また、こうして得られた杜仲由来のエクソソームは、Ｂ１６細胞メラニン産生抑制効果が極めて高く、有効な化粧品の素材になることを見出した。
本発明は、天然の素材を原料とし、副作用が少なく長期にわたって摂取した場合でも安全であり、ウイルス感染症、杜仲葉エクソソームに内包されるＲＮＡの内、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）の上皮間葉転換制御がもたらす乳癌、肺癌、大腸癌、糖尿病、アレルギー、痴ほう症、高血糖の改善剤、動脈硬化予防剤、それを含む医薬または食品を提供することを目的とする。
本発明者は、上記の課題解決のために鋭意研究を進めたところ、杜仲葉加工物のｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含むエクソソーム組成物の上皮間葉転換制御による、ウイルス感染症、杜仲葉エクソソームに内包されるＲＮＡの内、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む健康改善剤による乳癌、肺癌、大腸癌、糖尿病アレルギー、痴ほう症、高血糖、動脈硬化に関する。さらに本発明は、当該ウイルス感染症、杜仲葉エクソソームに内包されるＲＮＡの内、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む上皮間葉転換制御の健康改善剤を見いだし、本発明を完成させた。すなわち本発明の一つの側面によれば、杜仲葉加工物を含む、ウイルス感染症、杜仲葉エクソソームに内包されるＲＮＡの内、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む上皮間葉転換制御による健康改善剤として、乳癌、肺癌、大腸癌、糖尿病アレルギー、痴ほう症、高血糖、動脈硬化の改善剤が提供される。すなわち、本発明は以下の実施形態を含む。
（１）杜仲葉由来のエクソソームを含むウイルス感染症改善剤。
（２）前記杜仲葉由来のエクソソームが、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む（１）に記載のウイルス感染症改善剤。
（３）錠剤、カプセル、又はドリンク剤の形態である、（１）又は（２）に記載のウイルス感染症改善剤。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の改善剤を含む医薬品。
（５）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の改善剤を含む飲食品。
（６）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の改善剤を含む、機能性食品、健康食品、健康補助食品、栄養補助食品、保険機能食品、特定保険用食品または栄養機能食品である、請求項５に記載の飲食品。
（７）杜仲葉を収穫後、直ちに−１０〜０℃に１〜３時間、生葉を冷蔵庫内に置いて荒熱をとる工程と、その後、冷蔵庫から前記生葉をとりだし、除湿又は送風により乾燥環境下の湿度を１％以上５０％以下に保ち、室温度を０℃以上１００℃以下で、２４時間乾燥させる工程と、を含む杜仲葉加工物の製造方法。
（８）前記乾燥工程が、乾燥途中に杜仲葉の裁断や荒粉砕などの工程、更に工程の杜仲に５０℃から４００℃の遠赤外線等による熱を５分間杜仲葉に掛ける工程、さらに、そうして得られた杜仲葉を１００℃以下で粉砕し、５〜２５μに粉砕し杜仲エクソソームを抽出する工程を含む（７）に記載の杜仲葉加工物の製造方法。
（２）前記杜仲葉由来のエクソソームが、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む（１）に記載のウイルス感染症改善剤。
（３）錠剤、カプセル、又はドリンク剤の形態である、（１）又は（２）に記載のウイルス感染症改善剤。
（４）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の改善剤を含む医薬品。
（５）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の改善剤を含む飲食品。
（６）（１）〜（３）のいずれか１項に記載の改善剤を含む、機能性食品、健康食品、健康補助食品、栄養補助食品、保険機能食品、特定保険用食品または栄養機能食品である、請求項５に記載の飲食品。
（７）杜仲葉を収穫後、直ちに−１０〜０℃に１〜３時間、生葉を冷蔵庫内に置いて荒熱をとる工程と、その後、冷蔵庫から前記生葉をとりだし、除湿又は送風により乾燥環境下の湿度を１％以上５０％以下に保ち、室温度を０℃以上１００℃以下で、２４時間乾燥させる工程と、を含む杜仲葉加工物の製造方法。
（８）前記乾燥工程が、乾燥途中に杜仲葉の裁断や荒粉砕などの工程、更に工程の杜仲に５０℃から４００℃の遠赤外線等による熱を５分間杜仲葉に掛ける工程、さらに、そうして得られた杜仲葉を１００℃以下で粉砕し、５〜２５μに粉砕し杜仲エクソソームを抽出する工程を含む（７）に記載の杜仲葉加工物の製造方法。
本発明に係る改善剤は、杜仲エクソソームのＲＮＡのｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）による上皮間葉転換制御の発現作用による機能性の改善効果によるものである。ウイルス感染症の改善効果だけでなく、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）の上皮間葉転換制御により乳癌、肺癌、大腸癌、糖尿病、アレルギー、痴ほう症、高血糖、動脈硬化の改善効果も得られる。またこれらのｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）は単一的に作用するだけでなく複合的に機能成の効果が得られ健康回復にも極めて総合的に相乗的に健康改善を図る。また元々食品として２千年の昔から使用され、副作用が無く、長い間使用しても害が無い為三大漢方薬の一つに、数えられており、食経験から極めて安心な薬品、サプリメント、食品と成る。
前記の課題を解決するため、本発明者らは、鋭意検討を行った結果、杜仲生葉を収穫後直ちにマイナス下の特定環境下で３時間乾燥させ、望ましくは、２時間ほど乾燥し、マイナス下から室温に戻し、環境温度を０℃から１００℃、更に望ましくは、０〜５０℃以下、更に望ましくは、０℃〜１０℃、更に望ましくは、０℃〜５℃の室温で、２４時間除湿を行ない、湿度を６０％以下、望ましくは、５０％以下、望ましくは３０％以下に保ち、乾燥温度を１００度以下、望ましくは、６０℃以下、望ましくは、３０℃以下、更に望ましくは、５℃以下に保ち、更に工程の杜仲に２４時間置き、水分率３％の乾燥葉を得た。こうした乾燥の中で５０℃から４００℃の遠赤外線等による熱を５分間、さらに望ましくは、１分間遠赤外線等による乾燥工程をおり込んだ乾燥で乾燥し、乾燥後荒粉砕をし、更に１０〜２５ミクロン、望ましくは、さらに５〜１５ミクロンに微粉砕し杜仲粉末をえる。
こうして得た、杜仲葉粉末緑粉末を用いて、エクソソームの検体を得る為に、ＰＢＳに杜仲茶を加えＶｏｒｔｅｘし、室温で２０分間、２，０００×ｇにて撹拌溶解し、上清をとりさらに２０分間、１２，０００×ｇにて撹拌溶解し、上清を超遠心し、更に上清を、０．２２μｍＦｉｌｔｅｒで上清した。上清した１ｍＬを超遠心機で、２００，０００×ｇ、７０分撹拌し、ｐｅｌｌｅｔに取りＰＢＳで懸濁し検体を得た（図１参照）。
この「杜仲粉末」を、ＰＢＳに杜仲茶を加え室温で２０分、２，０００×ｇにて撹拌溶解した後、上清をとりさらに２０分間、１２，０００×ｇにて撹拌溶解し、更に上清をとり超遠心し、ＰＢＳで懸濁しエクソソームの１．６０×１０８のエクソソームを検出した。さらにエクソソームに内包されるＲＮＡの数量を検査した。さらにＲＮＡの１粒のエクソソーム内に６ＴｏｔａｌＲＮＡ（×１０４ｐｇ／ｐａｒｔｉｃｌｅ）のＲＮＡが含有されているのを検査した。これらの検査を、杜仲粉末のみを使用したものと、杜仲茶＋桑茶粉末を使用した二つを比較実施した。
次に、杜仲１００％（碧山）と杜仲茶＋桑茶（瑞茶）の二つの検体についてさらにエクソソームの粒子のサイズと量をについてｑＮａｎｏを用いて計測した。図３及び表１に示したように、杜仲１００％（碧山）は、粒子数は、１．６０×１０８であった。杜仲茶＋桑茶（瑞茶）は、１．１１×１０９であった。杜仲茶は、粒子サイズの平均は、最高値で１５８ｎｍであった。杜仲茶＋桑茶は、１４５ｎｍであった。
次に、杜仲１００％（碧山）と杜仲茶＋桑茶（瑞茶）の二つの検体について１粒当たりのＲＮＡの量を調べた。杜仲は、６．５Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（×１０４ｐｇ／ｐａｒｔｉｃｌｅ）であった。杜仲茶＋桑茶（瑞茶）は、１．５Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ（×１０４ｐｇ／ｐａｒｔｉｃｌｅ）であった（図４参照）。この数字から見るとほとんど桑にはＲＮＡは、含有されていないことに成る。
次に、Ａ、杜仲１００％（碧山）とＢ，杜仲茶＋桑茶（瑞茶）の二つの検体について、ＲＮＡの粒子のサイズ測定をおこなった。Ａ，Ｂの二つのグラフからｍｉＲＮＡが、含有されていることが、明らかである（図５）。また参考にｎｏｎ−ｃｏｄｉｎｇ ＲＮＡカテゴリーＳｍａｌｌ（ｍｉＲＮＡ）の図６を、みると２０〜３０ｎｔがｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）であることが、それらの働きについても既知機能として書かれている通り働きは、翻訳制御、ｍＲＮＡの安定性制御、ゲノムの安定制御である。
このｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）の働きにより、ウイルス感染症、乳癌、肺癌、大腸癌、糖尿病、アレルギー、痴ほう症、高血糖、動脈硬化の予防について改善効果をもたらす改善剤、予防剤、それを含む医薬または食品を提供する。予防剤、それを含む医薬または食品を提供する為の大量精製加工方法として、杜仲粉末から抽出したリッターサイズのエクソソーム溶液から、製剤化しやすい形態での１ｇ／バッチのエクソソーム大量精製の為の、限外濾過方とフィルトレーションを組み合わせたタンジェンシャルフロー系による生産方式による製造方法を行った。
また、発明者らは、杜仲粉末による抗ウイルス作用の効果を、検証する為に呼吸器ウイルス（パラインフルエンザウイルス３型）感染症に対する効果の試験を行なった。ＰＢＳ１ｍｌに杜仲粉末１ｍｇの濃度の検体にＰＩＶ３をＭＯＩ（感染効率）＝１で投入する。ウイルス感染すると上清中に胎盤由来分泌型アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）を分泌する。ＰＩＶ３を投入後、４８時間培養し、ＲＴ−ＰＣＲ法にてアッセイを行なった。
（図７を参照）
（図７を参照）
ＰＩＶ３感染症抑制能の検討を行なう為に、培養後のＳＥＡＰの検討を行なった。その結果を図８及び９に示す。培養後のＳＥＡＰ値は、杜仲粉末を用いた時は、６５８１１０．５であるのに対し杜仲粉末を用いない時は、１０４５３５０．６６７であった。このことから杜仲粉末は、指摘濃度においてパラインフルエンザウイルス３型の感染を抑制した。
Claims (8)
- 杜仲葉由来のエクソソームを含むウイルス感染症改善剤。
- 前記杜仲葉由来のエクソソームが、ｓｍａｌｌ ＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｐｉＲＮＡ）を含む請求項１に記載のウイルス感染症改善剤。
- 錠剤、カプセル、又はドリンク剤の形態である、請求項１又は２に記載のウイルス感染症改善剤。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の改善剤を含む医薬品。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の改善剤を含む飲食品。
- 請求項１〜３のいずれか１項に記載の改善剤を含む、機能性食品、健康食品、健康補助食品、栄養補助食品、保険機能食品、特定保険用食品または栄養機能食品である、請求項５に記載の飲食品。
- 杜仲葉を収穫後、直ちに−１０〜０℃に１〜３時間、生葉を冷蔵庫内に置いて荒熱をとる工程と、その後、冷蔵庫から前記生葉をとりだし、除湿又は送風により乾燥環境下の湿度を１％以上５０％以下に保ち、室温度を０℃以上１００℃以下で、２４時間乾燥させる工程と、を含む杜仲葉加工物の製造方法。
- 前記乾燥工程が、乾燥途中に杜仲葉の裁断や荒粉砕などの工程、更に工程の杜仲に５０℃から４００℃の遠赤外線等による熱を５分間杜仲葉に掛ける工程、さらに、そうして得られた杜仲葉を１００℃以下で粉砕し、５〜２５μに粉砕し杜仲エクソソームを抽出する工程を含む請求項７に記載の杜仲葉加工物の製造方法。
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|---|---|---|---|---|
| CN118236415A (zh) * | 2024-02-20 | 2024-06-25 | 广东医科大学附属医院 | 杜仲来源的外泌体纳米囊泡在制备抗骨肿瘤药物中的应用 |
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2020
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