CN114712392A - 来自自体血液分离的免疫细胞制剂及其应用 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种来自自体血液分离的免疫细胞制剂及其应用。该免疫细胞制剂包含稳定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，所述flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白，所述淋巴细胞包括表达CD4和/或CD8的T淋巴细胞。该表达flgE相关蛋白的淋巴细胞具有靶向抑制CD8+、CD4+的肿瘤细胞增殖的功能。进一步通过动物实验证实了，本申请公开的表达flgE相关蛋白的淋巴细胞通过抑制肿瘤组织PBX3表达和HMGA2蛋白表达，受到肿瘤细胞的刺激而大量分泌γ‑干扰素，进而实现靶向抑制肿瘤增长和调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。

Description

来自自体血液分离的免疫细胞制剂及其应用
技术领域
本申请涉及免疫细胞技术领域，尤其涉及来自自体血液分离的免疫细胞制剂及其应用，更具体的涉及稳定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞及其制备方法，以及在抗肿瘤中的应用。
背景技术
目前，手术治疗、放疗、化疗作为针对肿瘤的三大常规治疗方法，远远不能改变肿瘤治疗的现状。随着分子生物学技术的发展、免疫学理论的不断丰富，肿瘤的免疫疗法逐渐兴起，细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocyte，CTL)由于其具有杀瘤谱广、杀瘤活性高、增殖能力强等特点，已成为过继性免疫治疗中常用的效应细胞，如何提高CTL细胞数量及活性、增强其抗肿瘤特异性是提高过继性免疫治疗效果的关键。
通过对CTL细胞进行基因重编和改造，能够提高CTL细胞的肿瘤靶向性和体外稳定性，以此制得的细胞制剂往往需要安全性高、活性高、数量多、能够达到临床级的CTL细胞量，以发展其良好的临床应用价值。
发明内容
本申请发明人经过创造性地发现，将flgE基因相关片段进行克隆，构建重组质粒，以对自体来源的T细胞进行基因重编，提高了自体来源T细胞的体外稳定性，并且还能保持一定免疫原性和免疫保护性，对于结肠癌细胞和人慢性髓原白血病细胞具有特异的靶向性。
第一方面，本申请实施例公开了一种来自自体血液分离的免疫细胞制剂，其包含稳定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，所述flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白，所述淋巴细胞包括表达CD4和/或CD8的T淋巴细胞。
在本申请实施例中，所述免疫细胞制剂还包含与血浆等渗的电解质溶液，溶解或分散在所述电解质溶液中的血白蛋白和葡萄糖注射液。在进一步的实施例中，血白蛋白在免疫制剂中的浓度为4～18wt％，葡萄糖浓度为0.5～3.5wt％，稳定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞的浓度不低于1000万/mL。其中，所述电解质溶液为氯化钠注射液、复方氯化钠注射液、复方电解质注射液、乳酸林格氏液中的任一种；或者所述电解质溶液为生理盐水、氯化钾注射液、葡萄糖酸钙注射液的混合溶液。
在本申请实施例中，所述淋巴细胞包括CD4+T细胞和CD8+T细胞，且所述免疫制剂中的CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量比例为5:3
第二方面，本申请实施例公开了第一方面所述的免疫细胞制剂的制备方法，其包括：
构建携带SEQ ID NO.1～10任一所示的核苷酸序列的重组质粒；
分离自体血液中的淋巴细胞，所述淋巴细胞包括表达CD4和/或CD8的T淋巴细胞；
将所述重组质粒核转染入所述淋巴细胞，获得稳定表达表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，所述flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白；以及
将所述淋巴细胞配制成所述免疫细胞制剂的步骤。
在本申请实施例中，“构建携带SEQ ID NO.1～10任一所示的核苷酸序列的重组质粒”的步骤具体包括：获得SEQ ID NO.1～10任一所示的核苷酸序列，经过扩增得到对应的片段，将所述对应的片段与经过酶切的线性化载体片段进行连接，转化感受态细菌，培养，得到阳性克隆，分离所述阳性克隆中的质粒，即为所述重组质粒。
在本申请实施例中，所述扩增使用的引物组包括用于扩增SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.16～17所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.18～19所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的如SEQID NO.20～21所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的如SEQ IDNO.22～23所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.24～25所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.26～27所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.28～29所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.30～31所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.32～33所示的上下游引物和用于扩增SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.34～35所示的上下游引物。
在本申请实施例中，“分离自体血液中的淋巴细胞”的步骤具体包括：
获得自体外周血，稀释，离心，收集白膜层细胞，再次用Hank's缓冲液清洗，离心，收集细胞沉淀，重悬于DMEM完全培养基，24℃培养箱培养3h后收集上层悬浮细胞；
于流式管中配置1mL小鼠淋巴细胞约1×107个/mL若干管，分别在不同的流式管中加入CD4-Cocktail 100μL/mL和CD8-Cocktail 100μL/mL，混合孵化3min后加入Rapidspheres 50μL/mL，继续混合孵化3min；将流式管插进磁铁中孵化3min，倒出上清液，此时目的细胞附着在管壁上，洗涤液洗涤2次；最后用完全培养基重悬以培养，得到CD8+T细胞和CD+T细胞。
在本申请实施例中，“将所述重组质粒核转染入所述淋巴细胞，获得稳定表达表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，所述flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白”的步骤具体包括：
将上述步骤得到的CD8+T细胞和CD4+T细胞密度为8×105个/mL悬浮淋巴细胞，去除培养液上清，用DPBs清洗两边后，转移至6孔细胞培养板中每孔600μL，300g离心5min，去除上清，加入1mL的淋巴细胞培养基重悬，以便进行核转染；
根据细胞转染试剂盒说明书，将两种核转染试剂按照规定比例提前混合成100μL体系；
细胞用DPBS洗一遍，300g离心5min，去除上清，细胞沉淀用100μL预混的核转反应液缓慢重悬；
轻轻加入3μg质粒混匀，将细胞质粒核转体系小心转移到配套的电转杯内，防止气泡产生；电转杯置于杯槽内，选择最优B-016程序，电击转染后用淋巴细胞培养基培养于24孔板；
转染24h后换液，培养48h后即得稳定表达flgF相关目的蛋白的CD8+T细胞和CD4+T细胞。
第三方面，本申请实施例公开了第一方面所述的免疫细胞制剂、或第二方面所述的制备方法制得的免疫细胞制剂在制备抗结肠癌、人慢性髓原白血病细胞中的应用。
本申请实施例通过构建flgE重组质粒，将其核转染至小鼠自体外周血淋巴细胞中，以得到稳定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，并进一步分选为CD8+T细胞和CD4+T细胞，该淋巴细胞表达的flgE相关蛋白具有一定的免疫原性和免疫保护性。
本申请进一步通过细胞实验证实了该表达flgE相关蛋白的淋巴细胞具有靶向抑制CD8+、CD4+的肿瘤细胞增殖的功能。进一步通过动物实验证实了，本申请公开的表达flgE相关蛋白的淋巴细胞通过抑制肿瘤组织PBX3表达和HMGA2蛋白表达，受到肿瘤细胞的刺激而大量分泌γ-干扰素，实现靶向抑制肿瘤增长，调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。由此提示，本申请提供的flgE相关蛋白及稳定表达的淋巴细胞在制备肿瘤药物中具有十分重要的应用前景。
附图说明
图1为本申请实施例提供的flgE相关片段的扩增产物电泳图。
图2为本申请实施例提供的重组质粒酶切产物电泳图。
图3为本申请实施例提供的flgE相关蛋白电泳图。
具体实施方式
为了使本申请的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。本申请中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。
需要说明的是，本发明的说明书和权利要求书及上述附图中的术语“第一”、“第二”等是用于区别类似的对象，而不必用于描述特定的顺序或先后次序，也不对其后的技术特征起到实质的限定作用。应该理解这样使用的数据在适当情况下可以互换，以便这里描述的本发明的实施例能够以除了在这里图示或描述的那些以外的顺序实施。此外，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。
flgE重组质粒的制备
1、目的片段选取及引物设计
本申请实施例涉及的目的基因为NCBI中公开的铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa strain PA0750)flgE基因>CP034908.2，对其基因中的相关片段进行选取，以作为目的片段。如表1所示。
表1
Figure BDA0003645740020000061
采用本领域技术人员熟知的常规技术手段合成如表1中所示的实施例1～10和对比例1～5分别提供目的片段和各目的片段扩增所用的上下游引物。其中，上游引物添加BamHI切割位点，下游引物添加EcoRI位点，以对应目的片段为模板，进行PCR扩增，使用PCR产物纯化试剂盒(PCR Clean Up Kit，碧云天)回收纯化后的产物，步骤按照试剂盒说明书进行，最终洗脱体积40μL；PCR产物如图1所示。
2、重组质粒的构建
将纯化的PCR产物及pcDNA3.1(+)质粒利用BamHI(D6053，碧云天)和EcoRI(D6329，碧云天)进行酶切，酶切反应条件为37℃水浴2h，酶切反应体系为50μL：DNA 1μg、BamHI 1μL、EcoRI 1μL、10×Buffer 5.0μL补水至50μL。酶切产物上样至1％琼脂糖凝胶，电泳分离后，紫外灯下切胶，采用DNA凝胶回收试剂盒回收线性化的载体片段，对回收后的PCR片段及pcDNA3.1(+)质粒定量后，进行DNA连接反应；取10μL连接产物，转化XL1-Blue感受态菌(优宝生物)，转化后菌铺至LB-Ampr+平板，37℃温箱孵育过夜；挑取平板上长出的单克隆至LBAmpr+液体培养基，37℃，200r/min，振荡培养15h，采用质粒提取纯化试剂盒(Cytiva)提取细菌培养物中的质粒，再次采用BamHI和EcoRI进行双酶切(酶切反应体系同上)，酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，如图2所示，并送上海生工生物科技有限公司进行测序，已确定构建的质粒正确。
表达flgE相关蛋白的淋巴细胞系的构建
1、小鼠自体外周血淋巴细胞的分离和培养
将8～12周龄BALB/c nude裸鼠(赛业生物)麻醉后，用70％酒精棉球擦拭体表，使用肝素抗凝管抽取尾静脉外周血，立刻混匀，在超净工作台中用Hank's缓冲液对全血稀释3倍，混匀后，取分离液各3mL于15mL离心管中，再各取2mL稀释血液缓缓置于分离液液面上，1000r/min水平离心20min，收集白膜层细胞，加入5倍体积的Hank's缓冲液洗2次，1000r/min离心5min收集细胞沉淀，重悬于DMEM完全培养基，24℃培养箱培养3h后收集上层悬浮细胞，0.2％台盼蓝活性计数，调整细胞浓度为6×105个/mL进行后续培养。
2、淋巴细胞体外代谢活力的检测
将密度为6×105个/mL悬浮淋巴细胞接种在含有0.3μg/mL PHA的DMEM完全培养基中，用96孔培养板培养，培养温度为24℃。分别在0,6h,12h,18h,24h,36h,48h加入50μL MTT溶液，继续孵育4h。洗掉MTT溶液后，每孔加150μL DMSO，平板摇床缓缓摇动10min，采用酶标仪检测570nm波长处每孔细胞的光密度重复3次。
3、小鼠淋巴细胞的共刺激培养与扩增
用抗CD3单克隆抗体(ab119827，Abcam)包被细胞培养6孔板中添加浓度为1mg/L，4℃包被过夜，24h后洗涤2次，按8.0×105/mL的浓度接种细胞，使用完全培养基培养，同时加入2mg/L抗CD28单克隆抗体(ab243228，Abcam)混匀。共刺激培养3d后，半量更换含同等浓度r1L-2(重组人白介素2注射液，北京四环生物公司)的新鲜培养基。当细胞生长到1×107个时，转入含有预包被抗CD3单克隆抗体的细胞培养袋中培养，定期给更换培养基，即为小鼠淋巴细胞。
4、磁珠分选CD8+T细胞和CD4+T细胞
于流式管中配置1mL小鼠淋巴细胞约1×107个/mL若干管，分别在不同的流式管中加入CD4-Cocktail 100μL/mL(货号130-092-916，Miltenyi)和CD8-Cocktail 100μL/mL(货号GWB-Q01581，Genwaybio)，混合孵化3min后加入Rapidspheres 50μL/mL，继续混合孵化3min。将流式管插进磁铁中孵化3min，倒出上清液，此时目的细胞附着在管壁上，洗涤液洗涤2次。最后用完全培养基重悬以培养，得到CD8+T细胞和CD+T细胞。并分别采用与50μL鼠抗人FITC-CD4，FITC-CD8单克隆抗体混匀，4℃静置30min，洗弃上清，流式细胞仪分别检测其特异结合率，以鉴定获得的CD8+T细胞和CD4+T细胞。
5、转染
(1)将上述步骤得到的CD8+T细胞和CD4+T细胞密度为8×105个/mL悬浮淋巴细胞，去除培养液上清，用DPBs清洗两边后，转移至6孔细胞培养板中每孔600μL，300g离心5min，去除上清，加入1mL的淋巴细胞培养基(货号S001-1，品牌达晖)重悬，以便进行核转染。
(2)根据细胞转染试剂盒(北京泽平Lonza Amaxa)说明书，将两种核转染试剂按照规定比例提前混合成100μL体系。
(3)细胞用DPBS洗一遍，300g离心5min，去除上清，细胞沉淀用100μL预混的核转反应液缓慢重悬，防止气泡产生。
(4)轻轻加入3μg质粒混匀，将细胞质粒核转体系小心转移到配套的电转杯内，防止气泡产生；电转杯置于杯槽内，选择最优B-016程序(核转染仪，Lonza公司)，电击转染后用淋巴细胞培养基培养于24孔板；
(5)转染24h后换液，培养48h后即得稳定表达flgF相关目的蛋白的CD8+T细胞和CD4+T细胞。
6、基因重编的淋巴细胞系的生物特征学鉴定
(1)目的蛋白的纯化
收集上述步骤制得的稳定表达flgF相关目的蛋白的CD8+T细胞和CD4+T细胞，用0.45μm的滤膜过滤以除去细胞碎片或其它固形物质，将滤液上样至经过平衡和去除气泡的His-Trap FF crude层析柱，上样流速为1mL/min，待出现上样峰后，用结合缓冲液洗去杂蛋白，大约5个柱体积，流速为1mL/min，待基线平衡稳定后用洗脱缓冲液梯度洗脱杂蛋白，流速1mL/min，0～100％的梯度在10个柱床体积内完成。在UV检测下收集蛋白峰，以1mL/份收集入1.5mL的EP管中。收集洗脱下的蛋白峰，取适量蛋白液经12％SDS-PAGE进行鉴定，用GelDoc凝胶成像分析系统扫描分析，结果应用Quantity One分析软件进行半定量分析，并以均值±标准差表示，实验数据用SigmaState统计软件进行One Way ANOVA统计学分析和显著性差异标记。
对上述制得的结果如图3所示，第1代CD8+T细胞和CD4+T细胞能够在检测出目的蛋白。并且相对于对比例1～5，实施例1～10提供的CD8+T细胞和CD4+T细胞具有更高的表达量。
表2目的蛋白相对表达水平
实施方式 P1 P10 P50
实施例1 1.25±0.32b 1.21±0.16b 1.18±0.21b
实施例2 1.24±0.24b 1.22±0.21b 1.22±0.19b
实施例3 1.25±0.26b 1.18±0.18b 1.15±0.23b
实施例4 1.21±0.19b 1.17±0.20b 1.15±0.24b
实施例5 1.31±0.20ab 1.26±0.16b 1.22±0.21b
实施例6 1.27±0.15b 1.25±0.17b 1.21±0.18b
实施例7 1.34±0.17ab 1.32±0.21ab 1.32±0.20a
实施例8 1.42±0.19a 1.39±0.23a 1.36±0.22a
实施例9 1.38±0.21a 1.35±0.18a 1.32±0.23a
实施例10 1.43±0.23a 1.41±0.25a 1.38±0.19a
对比例1 0.55±0.05c 0.35±0.09d 0.14±0.06d
对比例2 1.32±0.19ab 0.72±0.15c 0.25±0.05c
对比例3 0.51±0.06c 0.26±0.08d 0.12±0.08d
对比例4 0.42±0.11d 0.32±0.07d 0.19±0.06c
对比例5 0.48±0.09c 0.30±0.06d 0.17±0.07d
表2示出第1、10和50代的各实施例1～10和对比例1～5制得的CD8+T细胞和CD4+T细胞中相应的目的蛋白的表达水平。由表2可知，实施例1～10制得的制得的CD8+T细胞和CD4+T细胞中目的蛋白表达水平在细胞系传代50代后无显著下降，并且表达水平仍然高于对比例1～5。由此说明，本申请实施例提供的CD8+T细胞和CD4+T细胞系具有稳定表达目的蛋白的性能，遗传特性更稳定。
(2)目的蛋白去除内毒素
将上述步骤(1)制得的目的蛋白调节pH值7～8，上样至HB-H-7树脂层析，以去除其中内毒素，具体步骤参照“刘娟娟，李依宸，郭红星，李涛；HB-H-7血浆灌流树脂清除血液内毒素和炎性细胞因子实验研究[J]，生物医学工程与临床，2018，第2期，ISSN：1009-7090”公开的方法进行，经内毒素检测试剂盒(湛江安度斯)检测经处理的目的蛋白样品，直至纯化后的目的蛋白中内毒素低于0.05EU/mg蛋白。
(3)目的蛋白免疫原性检测
将去除内毒素的目的蛋白样品作用抗原，免疫8～12周龄BALB/c nude裸鼠(赛业生物)，于第1次免疫后的第3和第7天各重复免疫一次，共免疫3次，第56天分离血清作为抗血清。
间接ELISA测定抗体效价：包被目的蛋白浓度为1μg/mL，一抗为1:200稀释的抗血清，酶标二抗为羊抗兔IgG-HRP(1:2000)。以空白对照孔调零，492nm测吸光度(A)值。
被动保护试验:在小鼠腹腔内注射抗血清或2倍稀释梯度的抗血清0.5mL，2h后，用300LD50(Reed-Muench法)量的目的蛋白经腹腔攻击，观察4d，计算小鼠存活率。结果如表3可知，实施例1～10提供的目的蛋白免疫小鼠后血清抗体效价较高，小鼠无死亡发生。
由此说明，本申请实施例提供的目的蛋白不仅具有免疫原性，还具有免疫保护性。
表3
Figure BDA0003645740020000111
Figure BDA0003645740020000121
细胞实验
本实验采用LDH-Cytotoxicity Colorimetric Assay Kit II试剂盒(Biovision)检测表达flgF相关目的蛋白的CD8+T细胞和CD4+T细胞相关细胞的靶向性。具体步骤如下：
以CD8阳性K562和CD4+K562细胞(武汉普诺赛)作为靶细胞，以每孔5.0E+04加入96孔U型板中，同时用CD8阴性K562细胞和CD4-K562细胞做对照(武汉普诺赛)，每孔105个/mL；以实施例1～10和对比例1～5分别提供的第10代表达flgE相关蛋白的淋巴细胞系作为效应细胞，按照每孔106个/mL分别加入对应的靶细胞孔中，每孔终体积100μL；每孔设5个复孔，将混合后的细胞(96孔板中)放入37℃、5％CO2培养箱中孵育12个小时；将细胞混合液96孔板中取出，放入离心机中600g，4℃，离心10分钟，取上清10μL，放入新的96孔平底板中进行LDH检测；再加入预先配制好的LDH反应混合液100μL，混合后室温避光放置30分钟；加入10％终止液终止反应，放入酶标仪中读取OD450nm(reference 650nm)；计算靶细胞生长抑制率＝(1-OD阳性组/OD阴性组)×100％。
表4示出了实施例1～10和对比例1～5分别提供的第10代表达flgE相关蛋白的淋巴细胞系作为效应细胞分别处理CD4阳性K562、CD4阴性K562、CD8阳性K562和CD8阴性K562细胞的靶细胞生长抑制率，具体为表达flgE相关蛋白的的CD4+T细胞处理CD4阳性K562、CD4阴性K562，为表达flgE相关蛋白的的CD8+T细胞处理CD4阳性K562、CD8阴性K562。表4中，“－”表示未检出。
表4靶细胞生长抑制率
实施方式 CD4阳性K562 CD4阴性K562 CD8阳性K562 CD8阴性K562
实施例1 78.12±3.62a 34.06±1.22a 72.27±4.41a 26.51±1.28a
实施例2 76.82±2.44a 34.24±2.10a 74.40±3.27a 27.39±2.03a
实施例3 77.49±3.36a 35.35±3.18a 73.26±5.32a 25.43±1.21a
实施例4 76.62±5.52a 34.26±2.26a 72.19±4.41a 28.62±1.16a
实施例5 78.42±6.47a 34.41±1.32a 74.32±5.36a 26.57±2.18a
实施例6 79.37±5.51a 33.33±2.24a 74.23±4.25a 27.49±1.21a
实施例7 80.48±4.45a 34.26±1.15a 72.04±3.36a 29.65±2.14a
实施例8 78.28±4.36a 33.21±2.29a 73.12±5.29a 30.37±1.16a
实施例9 79.43±3.42a 34.19±1.16a 75.28±4.35a 28.42±2.25a
实施例10 81.62±2.59a 35.08±1.25a 75.32±6.02a 29.62±2.02a
对比例1 7.32±0.05b 2.30±0.12b 5.69±0.17b 2.30±0.12b
对比例2 － － － －
对比例3 8.47±0.13b 3.13±0.08b 4.32±0.13b 3.13±0.13b
对比例4 － － 2.19±0.36b 1.87±0.13b
对比例5 － － － －
结果如表4所示，实施例1～10提供的表达flgE相关蛋白的CD4+T细胞对CD4+K562细胞的杀伤效果相助高于CD4-K562细胞，实施例1～10提供的表达flgE相关蛋白的CD8+T细胞对CD8+K562细胞的杀伤效果相助高于CD8-K562细胞，由此说明本申请实施例提供的表达flgE相关蛋白的CD4+T细胞和CD8+T细胞对肿瘤细胞具有一定的靶向性。并且实施例1～10提供的表达flgE相关蛋白的CD4+T细胞和CD8+T细胞对肿瘤细胞的杀伤性能由于对比例1～5。
动物实验
一、材料与方法
1、实验动物
健康8～12周龄BALB/c nude裸鼠(赛业生物)，所有裸鼠均饲养于SPF级动物房，饲养环境温度为22～27℃,12h光照，12h黑暗。小鼠接受标准饲料和自来水自由觅食，笼具和垫料每周更换2次，笼具均用高压灭菌。
2、供试品
采用上述实施例1～10和对比例1～5分别提供的定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞制成的免疫细胞制剂。其中，flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白，所述淋巴细胞包括表达CD4和/或CD8的T淋巴细胞。
另外，该免疫细胞制剂还包含包含与血浆等渗的电解质溶液，溶解或分散在所述电解质溶液中的血白蛋白和葡萄糖注射液。电解质溶液为氯化钠注射液、复方氯化钠注射液、复方电解质注射液、乳酸林格氏液中的任一种；或者所述电解质溶液为生理盐水、氯化钾注射液、葡萄糖酸钙注射液的混合溶液。
一个具体的实施例中，以该免疫细胞制剂为供试品，其中包含表达CD4和/或CD8的T淋巴细胞不低于1000万/mL，乳酸林格氏液作为缓冲液，血白蛋白在免疫制剂中的浓度为12wt％，葡萄糖浓度为2.8wt％。
3、人结肠癌裸鼠移植瘤模型的建立
将LoVo细胞((人结肠癌细胞，武汉普诺赛)在含10％胎牛血清、1％青链霉素的RPMI1640培养基上于37℃、5％CO2培养箱中培养5～7d，待细胞长满瓶底后用0.1％胰蛋白酶消化成单个细胞，制备成1010个/mL的单细胞悬液，用0.4％锥虫蓝染色检测细胞活力，显示细胞活力在95％以上。对裸鼠碘酊局部皮肤消毒后，于裸鼠右侧肩胛骨区按照每只0.2mL的剂量将单细胞悬液接种于于裸鼠右侧肩胛骨区。连续观察6周，观察成瘤率和皮下瘤的直径。MRI检查细胞接种1周以及异体移植瘤移植后1周定期观察肿瘤体积，测量其长(a)、宽(b),然后按公式V＝1/6πab2计算肿瘤的体积。
3、分组实验和治疗
取正常裸鼠作为正常组，将移植有人结肠癌瘤的裸鼠分为模型组、试验1组、试验2组和试验3组。模型组，裸鼠移植瘤模型成功后注射生理盐水做模型对照。试验1组，裸鼠移植瘤模型成功后注射实施例1～10和对比例1～5分别提供的包含表达flgE相关蛋白的CD4+T细胞的免疫细胞制剂。试验2组，裸鼠移植瘤模型成功后注射实施例1～10和对比例1～5分别提供的包含表达flgE相关蛋白的CD8+T细胞的免疫细胞制剂。试验3组，裸鼠移植瘤模型成功后注射实施例1～10和对比例1～5分别提供的表达flgE相关蛋白的CD4+T细胞和CD8+T细胞的免疫细胞制剂，其中CD4+T细胞和CD8+T细胞的比例为5:3。在肿瘤体积达到1.5cm3时开始治疗，每次注射1ml，每周一次，连续四周。正常组不做任何处理。检测四周后以肿瘤体积计的肿瘤抑制率。
4、裸鼠移植瘤相关表达
(1)PBX3表达和HMGA2蛋白表达的方法
人道处死各组小鼠后，取移植瘤组织，随后用PBS缓冲液冲洗干净后，用4％多聚甲醛将剪取的标本进行固定，随后经过不同浓度的乙醇溶液进行处理，分别为:70％乙醇30min、80％乙醇30min、90％乙醇30min两遍、95％乙醇30min两遍、100％乙醇3 0min两遍、二甲苯透明3 0min两遍，55℃石蜡中30min两遍，标本经过上述过程处理后用铜制模具将其进行包埋，切片，将组织标本切片用二甲苯溶液浸泡，时长为110min，随后按照如下顺序进行处理：二甲苯溶液II 10min、100％乙醇I10min、100％乙醇II 10min、95％乙醇10min、75％乙醇10min；用自来水将组织切片冲洗3次，水后再用PBS缓冲液进行浸泡，每次5min，共2次；向组织切片上滴加抗原修复液，于室温环境下放置20min，随后用PBS缓冲液清洗3次，每次5min；除去PBS缓冲液，在标记有HMGA2和PBX3的切片上，分别滴加对应的HMGA2单克隆抗体(H00008091-M01，品牌艾美捷Abnova)和PBX3单克隆(H00005090-M01,品牌Abnova)一抗，每片约50μL，将切片放入4℃冰箱过夜；然后将切片取出放至室温，用PBS缓冲液浸洗3次，每次2min；向组织切片上滴加生物素化二抗(IgG)，预后于3 7℃孵育20min，用PBS浸泡3次，每次为5min；向组织切片上滴加辣根酶标记链霉素、卵白素工作液(S-A/HRP，于3 7℃湿盒中放置30min，用PBS浸泡3次，每次为5min；向组织切片上滴加DAB液，随后于显微镜下观察以掌握染色程度，显色时长为6min，染色结束后用蒸馏水冲洗组织切片以终止染色；用苏木精对组织切片进行复染，时长为2min，随后用1％盐酸酒精进行分化处理，时长为1～2s}氨水蓝化，用常规浓度梯度乙醇溶液进行脱水处理，最后用中性树脂封片。用显微镜对获得的组织标本染色切片进行观察，以细胞核呈棕黄色为阳性染色，观察各组荷瘤鼠肿瘤组织标本中PBX3蛋白表达和HMGA2蛋白的表达情况，用多功能图象分析仪对拍摄的组织标本图像进行分析，以随机5个视野进行阳性细胞计数和免疫组化评分(immunohistochemicalscores,IHS，评分标准为A为阳性细胞数分级0～1％＝0，1～10％＝1，10～50％＝2，50～80％＝3，80～100％＝4；B为阳性细胞显色强度分级0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性)；IHS＝A×B。
(2)γ-干扰素(IFN-γ)
检测用ELISA检测试剂盒(RAYBIO)检测肿瘤组中γ-干扰素水平。人道处死各组小鼠后，取移植瘤组织，随后用PBS缓冲液冲洗干净后，匀浆，经1000g 4℃离心后，取滤液取各5μL加入96孔板中；用PBS稀释第一抗体，在96孔板中每孔加50μL抗体，4℃过夜；每孔用250μL PBST洗板，共洗3遍；5％脱脂奶粉(PBST)封闭，每孔用250μL PBST洗板，共洗3遍；加标准品和样品(标准品配制：取10μL于640μL含1％BSA的PBS中，浓度为1000pg/ml，以此为母液进行2倍稀释，分别为500pg/ml、250pg/ml、125pg/ml、62.5pg/ml、31.3pg/ml、15.6pg/ml)，样品分布按照自己习惯排布；每孔用250μLPBST洗板，共洗3遍；每孔加入50μL稀释好的第二抗体，37度孵育1小时；每孔用250μL PBST洗板，共洗3遍；每孔加入50μL streptavidin-HRP(取375μL于15ml Reagent diluent中)，室温30min；每孔用250μL PBST洗板，共洗3遍；每孔加入50μL TMB(天根#PA107-01)，室温30分钟；每孔加入50μL 1M浓硫酸，终止反应；酶标仪读取OD 450nm，Reference 620nm，计算样品中γ-干扰素含量。
5、数据处理
所有测试数据均以平均值和标准偏差表示，应用SPSS13.0软件处理数据，并对每列数据进行多重比较和显著性差异标记。
二、结果
表5
Figure BDA0003645740020000171
表6
Figure BDA0003645740020000172
Figure BDA0003645740020000181
表7
Figure BDA0003645740020000182
表8
Figure BDA0003645740020000183
Figure BDA0003645740020000191
表5～8示了正常组、模型组、试验1组、试验2组和试验3组的荷瘤鼠在经过试验后的肿瘤抑制率、PBX3表达和HMGA2蛋白表达的免疫组学评分以及肿瘤组织中γ-干扰素的表达水平。表5～8为连续的表序列，对其每一列数据进行多重比较和显著性差异标记。表5～8中，“－”表示未检出或者无此检测项。
由表5～8可知，相对于正常组，模型组荷瘤鼠肿瘤组织的体积达到了1.5cm3，模型组荷瘤鼠肿瘤组织中的PBX3表达和HMGA2蛋白表达的免疫组学评分显著升高，而γ-干扰素表达水平无显著升高，说明伴随肿瘤生长，荷瘤鼠的肿瘤组织中PBX3表达和HMGA2蛋白表达升高，而γ-干扰素并未受到刺激而过度分泌。
高迁移率蛋白A2(high mobility group A2,HMGA2)为一种广泛表达于高等真核动物的癌胚蛋白，在胚胎发育中表达较高，在正常细胞和组织中则较少,其过表达与恶性肿瘤的发生和发展过程密切相关。PBX3蛋白在多种恶性肿瘤中的作用机制己有报道。PBX3是PBX家族中的主要辅因子，被预测为同源盒A(HOXA)家族调控网络中的顶级转录调控因子，它可以增加HOX蛋白的DNA结合/转录活性，诱导和维持急性髓系白血病的耐药性；PBX3可与HNF1A-AS结合增加OTX1表达，从而激活ERK/MAPK途径并能够促进结肠癌中的血管生成；PBX3可以通过AKT信号通路促进宫颈癌细胞增殖，并影响肿瘤的大小和重量，是影响宫颈癌患者生存的独立预后指标。由此可见，通过观察肿瘤组织中PBX3表达和HMGA2蛋白表达能够更加深入探明本申请实施例提供的表达flgE相关蛋白的淋巴细胞对肿瘤组织的抑制作用机制。
由表5～8可知，相对于模型组，试验1组、试验2组和试验3组的荷瘤鼠在经过试验后的肿瘤抑制率均超过60％，并且试验3组的肿瘤抑制率最高，由此说明采用本申请实施例提供的表达flgE相关蛋白的CD8+T细胞或CD4+T细胞、或者二组组合能够明显抑制荷瘤鼠的肿瘤生长，具有明显的抗肿瘤作用。
由表5～8可知，相对于模型组，试验1组、试验2组和试验3组的荷瘤鼠肿瘤组织中的PBX3表达和HMGA2蛋白表达的免疫组学评分均显著降低，γ-干扰素表达显著升高。由此说明采用本申请实施例提供的表达flgE相关蛋白的CD8+T细胞或CD4+T细胞、或者二组组合能够明显抑制荷瘤鼠肿瘤组织中的两类标志蛋白的表达，γ-干扰素有可能受到肿瘤细胞的刺激而大量分泌，实现靶向抑制肿瘤增长，调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。
综上所述，本申请实施例通过构建flgE重组质粒，将其核转染至小鼠自体外周血淋巴细胞中，以得到稳定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，并进一步分选为CD8+T细胞和CD4+T细胞，该淋巴细胞表达的flgE相关蛋白具有一定的免疫原性和免疫保护性。
本申请进一步通过细胞实验证实了该表达flgE相关蛋白的淋巴细胞具有靶向抑制CD8+、CD4+的肿瘤细胞增殖的功能。进一步通过动物实验证实了，本申请公开的表达flgE相关蛋白的淋巴细胞通过抑制肿瘤组织PBX3表达和HMGA2蛋白表达，受到肿瘤细胞的刺激而大量分泌γ-干扰素，实现靶向抑制肿瘤增长，调节机体的免疫防御机制限制肿瘤的生长。由此提示，本申请提供的flgE相关蛋白及稳定表达的淋巴细胞在制备肿瘤药物中具有十分重要的应用前景。
以上所述，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。
序列表
<110> 西部医美生物科技成都有限公司双流医疗分公司
<120> 来自自体血液分离的免疫细胞制剂及其应用
<141> 2022-05-13
<160> 45
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 1
ctgcaattgg gtaccggtgt gcgcgtcgtc ggcacccaga agatcttcac cccgggcagc 60
ctgcagacca ccgagcagcc gctggacatg gcggtcaacg ggcgcggctt cttccaggtc 120
ctgctgccgg acggcaccgt gtcctacacc cgcgacggca gcttccacct gaactccgac 180
gggcagatcg tcacctccaa cg 202
<210> 2
<211> 205
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 2
tgcaattggg taccggtgtg cgcgtcgtcg gcacccagaa gatcttcacc ccgggcagcc 60
tgcagaccac cgagcagccg ctggacatgg cggtcaacgg gcgcggcttc ttccaggtcc 120
tgctgccgga cggcaccgtg tcctacaccc gcgacggcag cttccacctg aactccgacg 180
ggcagatcgt cacctccaac ggctt 205
<210> 3
<211> 203
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 3
tgcaattggg taccggtgtg cgcgtcgtcg gcacccagaa gatcttcacc ccgggcagcc 60
tgcagaccac cgagcagccg ctggacatgg cggtcaacgg gcgcggcttc ttccaggtcc 120
tgctgccgga cggcaccgtg tcctacaccc gcgacggcag cttccacctg aactccgacg 180
ggcagatcgt cacctccaac ggc 203
<210> 4
<211> 207
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 4
ctgtccgccc aggacatgaa cctgaccacc atttccaaca acctggccaa cgtatccacc 60
accggcttca agcgcgaccg cgcggagttc caggacctgc tgtaccagat ccggcgccag 120
ccgggcggcc agtcgaccca ggacagcgag ctgccttcgg gcctgcaatt gggtaccggt 180
gtgcgcgtcg tcggcaccca gaagatc 207
<210> 5
<211> 202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 5
caattgggta ccggtgtgcg cgtcgtcggc acccagaaga tcttcacccc gggcagcctg 60
cagaccaccg agcagccgct ggacatggcg gtcaacgggc gcggcttctt ccaggtcctg 120
ctgccggacg gcaccgtgtc ctacacccgc gacggcagct tccacctgaa ctccgacggg 180
cagatcgtca cctccaacgg ct 202
<210> 6
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 6
caattgggta ccggtgtgcg cgtcgtcggc acccagaaga tcttcacccc gggcagcctg 60
cagaccaccg agcagccgct ggacatggcg gtcaacgggc gcggcttctt ccaggtcctg 120
ctgccggacg gcaccgtgtc ctacacccgc gacggcagct tccacctgaa ctccgacggg 180
cagatcgtca cctccaacgg cttc 204
<210> 7
<211> 204
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 7
gcaattgggt accggtgtgc gcgtcgtcgg cacccagaag atcttcaccc cgggcagcct 60
gcagaccacc gagcagccgc tggacatggc ggtcaacggg cgcggcttct tccaggtcct 120
gctgccggac ggcaccgtgt cctacacccg cgacggcagc ttccacctga actccgacgg 180
gcagatcgtc acctccaacg gctt 204
<210> 8
<211> 233
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 8
caggtgatcg gcaacatcca gaccgccgac ttcatcaacc cggccggcct gcaggccatc 60
ggcaacaacc tgttcctgga aaccggctcc agcggcgcgc cccaggtcgg tacgccgggt 120
ctcaacggcc tcggcacggt tgcccagaac accctggaaa actccaacgt caacgtggtc 180
gaggaactgg tgaacatgat caccacccag cgcgcctacg agatgaactc caa 233
<210> 9
<211> 210
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 9
caacgcccag ccgcaggtga tcggcaacat ccagaccgcc gacttcatca acccggccgg 60
cctgcaggcc atcggcaaca acctgttcct ggaaaccggc tccagcggcg cgccccaggt 120
cggtacgccg ggtctcaacg gcctcggcac ggttgcccag aacaccctgg aaaactccaa 180
cgtcaacgtg gtcgaggaac tggtgaacat 210
<210> 10
<211> 202
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 10
ccgacttcat caacccggcc ggcctgcagg ccatcggcaa caacctgttc ctggaaaccg 60
gctccagcgg cgcgccccag gtcggtacgc cgggtctcaa cggcctcggc acggttgccc 120
agaacaccct ggaaaactcc aacgtcaacg tggtcgagga actggtgaac atgatcacca 180
cccagcgcgc ctacgagatg aa 202
<210> 11
<211> 345
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 11
tcatcaagaa cgagccggac ccgaatgcga ccccgccgat tccggagaac agctggacca 60
tgaaagtgct gatcgacggc gtcaatccgc tcgatccgtc gaacaagacg ccgatgagct 120
tcaacgtcac cttcgacgcc agcggccaga tgacctcggt tcgggcgccg gacggcagca 180
ccagcgggcc gggcttcagc atcgacgcga ccaccaacgt gatccagttc agtccggcca 240
ctggcaatcc gccgactccc ggcaccggct ggattccggc ggcctcggac ggcaagaccc 300
cgccgaccta cgcctggaac ggcgcgaccg gtgccgccag cggca 345
<210> 12
<211> 638
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<400> 12
ctcgatccgt cgaacaagac gccgatgagc ttcaacgtca ccttcgacgc cagcggccag 60
atgacctcgg ttcgggcgcc ggacggcagc accagcgggc cgggcttcag catcgacgcg 120
accaccaacg tgatccagtt cagtccggcc actggcaatc cgccgactcc cggcaccggc 180
tggattccgg cggcctcgga cggcaagacc ccgccgacct acgcctggaa cggcgcgacc 240
ggtgccgcca gcggcatctc cttcgacatg cgcaagacca cccagtactc caccgcgttc 300
gcccagagca acccgatcca ggacggctac accaccggtc agttggcagg cctggaaatc 360
gacgacaccg gggtgatctt cgcccgctac accaacggcc agtccaaggt gcagggccag 420
gtggtgctgg ccaacttcgc caacatccag ggcctgacgc cgatcggcaa gacctcctgg 480
gtgcagtcct cggagtccgg cgagccggcg gtcggcgcgc cgcgctcggg caccctgggg 540
gcgttgcaat ccggcgcgct ggaagcgtcc aacgtggaca tctccaacga actggtgaac 600
ctcatcgtcc accagcgcaa ctaccaggcc aatgccaa 638
<210> 13
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<213> Artificial Sequence
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acctggccaa cgtatccacc accggcttca agcgcgaccg cgcggagttc caggacctgc 60
tgtaccagat ccggcgccag ccgggcggcc agtcgaccca ggacagcgag ctgccttcgg 120
gcctgcaatt gggtaccggt gtgcgcgtcg tcggcaccca gaagatcttc accccgggca 180
gcctgcagac caccgagcag ccgctggaca tggcggtcaa cgggcgcggc ttcttccagg 240
tcctgctgcc ggacggcacc gtgtcctaca cccgcgacgg cagcttccac ctgaactccg 300
acgggcagat cgtacctcca acgg 324
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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caacaacctg gccaacgtat ccaccaccgg cttcaagcgc gaccgcgcgg agttccagga 60
cctgctgtac cagatccggc gccagccggg cggccagtcg acccaggaca gcgagctgcc 120
ttcgggcctg caattgggta ccggtgtgcg cgtcgtcggc acccagaaga tcttcacccc 180
gggcagcctg cagaccaccg agcagccgct ggacatggcg gtcaacgggc gcggcttctt 240
ccaggtcctg ctgccggacg gcaccgtgtc ctacacccgc gacggcagct tccacctgaa 300
ctccgacggg cagatcgtca cctccaacgg 330
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caccatttcc aacaacctgg ccaacgtatc caccaccggc ttcaagcgcg accgcgcgga 60
gttccaggac ctgctgtacc agatccggcg ccagccgggc ggccagtcga cccaggacag 120
cgagctgcct tcgggcctgc aattgggtac cggtgtgcgc gtcgtcggca cccagaagat 180
cttcaccccg ggcagcctgc agaccaccga gcagccgctg gacatggcgg tcaacgggcg 240
cggcttcttc caggtcctgc tgccggacgg caccgtgtcc tacacccgcg acggcagctt 300
ccacctgaac tccgacgggc agatc 325
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ctgcaattgg gtaccggtgt 20
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ctgcaattgg gtaccggtgt 20
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tgcaattggg taccggtgtg 20
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aagccgttgg aggtgacgat 20
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tgcaattggg taccggtgt 19
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gccgttggag gtgacgatct 20
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ctgtccgccc aggacatgaa 20
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gatcttctgg gtgccgacga 20
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caattgggta ccggtgtgc 19
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agccgttgga ggtgacgat 19
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caattgggta ccggtgtgcg 20
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gaagccgttg gaggtgacga 20
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gcaattgggt accggtgtg 19
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aagccgttgg aggtgacga 19
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caggtgatcg gcaacatcca 20
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ttggagttca tctcgtaggc g 21
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ccgcaggtga tcggcaa 17
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atgttcacca gttcctcgac c 21
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ccgacttcat caacccggc 19
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ttcatctcgt aggcgcgctg 20
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tcatcaagaa cgagccggac 20
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ttgcgcatgt cgaaggagat 20
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gctcgatccg tcgaacaaga 20
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ttggcattgg cctggtagtt 20
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ccgttggagg tgacgatctg 20
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caacaacctg gccaacgtat 20
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ccgttggagg tgacgatct 19
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caccatttcc aacaacctgg c 21
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gatctgcccg tcggagttca 20

Claims (9)

1.一种来自自体血液分离的免疫细胞制剂，其包含稳定表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，所述flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白，所述淋巴细胞包括表达CD4和/或CD8的T淋巴细胞。
2.根据权利要求1所述的免疫细胞制剂，其还包含与血浆等渗的电解质溶液，溶解或分散在所述电解质溶液中的血白蛋白和葡萄糖注射液。
3.根据权利要求2所述的免疫细胞制剂，其中，所述淋巴细胞包括CD4+T细胞和CD8+T细胞，且所述免疫制剂中的CD4+T细胞和CD8+T细胞的数量比例为5:3。
4.权利要求1或2所述的免疫细胞制剂的制备方法，其包括：
构建携带SEQ ID NO.1～10任一所示的核苷酸序列的重组质粒；
分离自体血液中的淋巴细胞，所述淋巴细胞包括表达CD4和/或CD8的T淋巴细胞；
将所述重组质粒核转染入所述淋巴细胞，获得稳定表达表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，所述flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白；以及
将所述淋巴细胞配制成所述免疫细胞制剂的步骤。
5.根据权利要求3所述的制备方法，其中，“构建携带SEQ ID NO.1～10任一所示的核苷酸序列的重组质粒”的步骤具体包括：获得SEQ ID NO.1～10任一所示的核苷酸序列，经过扩增得到对应的片段，将所述对应的片段与经过酶切的线性化载体片段进行连接，转化感受态细菌，培养，得到阳性克隆，分离所述阳性克隆中的质粒，即为所述重组质粒。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其中，所述扩增使用的引物组包括用于扩增SEQ IDNO.1所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.16～17所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.2所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.18～19所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.3所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.20～21所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.4所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.22～23所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.5所示核苷酸序列的如SEQID NO.24～25所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的如SEQ IDNO.26～27所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.7所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.28～29所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.8所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.30～31所示的上下游引物、用于扩增SEQ ID NO.9所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.32～33所示的上下游引物和用于扩增SEQ ID NO.10所示核苷酸序列的如SEQ ID NO.34～35所示的上下游引物。
7.根据权利要求3所述的制备方法，其中，“分离自体血液中的淋巴细胞”的步骤具体包括：
获得自体外周血，稀释，离心，收集白膜层细胞，再次用Hank's缓冲液清洗，离心，收集细胞沉淀，重悬于DMEM完全培养基，24℃培养箱培养3h后收集上层悬浮细胞；
于流式管中配置1mL小鼠淋巴细胞约1×107个/mL若干管，分别在不同的流式管中加入CD4-Cocktail 100μL/mL和CD8-Cocktail 100μL/mL，混合孵化3min后加入Rapidspheres50μL/mL，继续混合孵化3min；将流式管插进磁铁中孵化3min，倒出上清液，此时目的细胞附着在管壁上，洗涤液洗涤2次；最后用完全培养基重悬以培养，得到CD8+T细胞和CD+T细胞。
8.根据权利要求3所述的制备方法，其中，“将所述重组质粒核转染入所述淋巴细胞，获得稳定表达表达flgE相关蛋白的淋巴细胞，所述flgE相关蛋白包括以SEQ ID NO.1～10任一所示作为编码基因经过翻译和表达的蛋白”的步骤具体包括：
将上述步骤得到的CD8+T细胞和CD4+T细胞密度为8×105个/mL悬浮淋巴细胞，去除培养液上清，用DPBs清洗两边后，转移至6孔细胞培养板中每孔600μL，300g离心5min，去除上清，加入1mL的淋巴细胞培养基重悬，以便进行核转染；
根据细胞转染试剂盒说明书，将两种核转染试剂按照规定比例提前混合成100μL体系；
细胞用DPBS洗一遍，300g离心5min，去除上清，细胞沉淀用100μL预混的核转反应液缓慢重悬；
轻轻加入3μg质粒混匀，将细胞质粒核转体系小心转移到配套的电转杯内，防止气泡产生；电转杯置于杯槽内，选择最优B-016程序，电击转染后用淋巴细胞培养基培养于24孔板；
转染24h后换液，培养48h后即得稳定表达flgF相关目的蛋白的CD8+T细胞和CD4+T细胞。
9.权利要求1～3任一所述的免疫细胞制剂、或权利要求4～8任一所述的制备方法制得的免疫细胞制剂在制备抗结肠癌、人慢性髓原白血病细胞中的应用。
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