CN112516286B - 环状RNAcircMAPK14编码的多肽在制备抗癌药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于肿瘤学领域，具体涉及氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的环状RNA circMAPK14编码产生的多肽在制备抗癌药物中的应用；该多肽由circMAPK14编码翻译产生，能够在体内外环境下抑制结直肠癌的增殖和转移能力，可有效抑制结直肠癌细胞的恶性生物学行为，可应用于结直肠癌的靶向治疗药物中。

Description

环状RNAcircMAPK14编码的多肽在制备抗癌药物中的应用

技术领域

本发明属于肿瘤学领域，具体涉及环状RNA circMAPK14编码产生的多肽在制备抗癌药物中的应用。

背景技术

在世界范围内，结直肠癌的发病率位居所有恶性肿瘤第三位，致死率则高居第二位。2018年全球有超过1800，000结直肠癌新发病例和881，000死亡病例。不同国家和地区情况不同，且患病个体之间存在明显的异质性。在我国，近年来,随着人们生活水平的提高和生活方式及饮食结构的改变,结直肠癌的发病率及死亡率呈上升趋势。根据中国癌症中心发布的最新2015年中国癌症数据报告显示，结直肠癌的发病率和致死率在所有恶性肿瘤当中均位列第五位。在中国，每年结直肠癌发病人数超过37万人，且仍以4.2％的速度快速增长，每年死亡人数接近20万，年增速超过1.2％。尽管随着早期诊断及治疗等有效手段技术的不断提高，但其仍成为严重威胁人类生命的消化道恶性肿瘤。结直肠癌是一种高度复杂的疾病,其发生是包括肠上皮细胞增殖、分化、凋亡等机制发生紊乱的一个复杂多级过程，其发病机制尚未明确。因此探究结直肠癌的发病机制以及寻找一种有效的早期诊断及靶向治疗手段，从而提高患者的总体生存率，对结直肠癌的治疗及预防具有重要的意义。

环状RNA(circRNA)作为一种新发现的内源性非编码RNA。它们最初被认为是丰度低，生物学功能有限的异常剪接的副产物。近些年来，随着高通量测序技术的不断发展，研究人员已经在病毒，真菌，植物和动物中鉴定出数千种circRNA。环状RNA通常来源于前体mRNA的反向剪接，其3'剪接供体序列与下游5'剪接受体序列相连接。环状RNA具有共价闭合的连续环状结构，没有5'帽或3'聚腺苷酸尾巴，并且它们对RNase的消化不敏感。因此，环状RNA比线性RNA更保守和稳定。根据其形成机理，环状RNA可以分为外显子circRNA，内含子circRNA和外显子-内含子circRNA)三类。大量研究表明，环状RNA参与了多种恶性肿瘤细胞的各种生理和病理过程，包括增殖、凋亡、侵袭和转移。circAGFG1可以充当miR-195-5p的miRNA海绵，以减轻miR-195-5p对于其靶基因CCNE1的抑制作用，从而在体内促进三阴性乳腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭。CircPVT1充当miR-497的ceRNA，间接调节Bcl-2在非小细胞肺癌细胞中的表达，从而促进了非小细胞肺癌的发展。重要的是，环状RNA在唾液，血液和外泌体中稳定表达，这使其成为诊断，预后和诊断有希望的生物标志物。目前的研究表明，环状RNA主要通过ce RNA机制发挥mi RNA海绵的作用以及通过RNA结合蛋白(RBP)来调节基因的表达。近期的研究表明一些含有翻译起始元件的环状RNA可以翻译为功能性蛋白质和多肽，从而发挥生物学作用。

目前结直肠癌临床药物治疗主要依靠奥沙利铂、5-氟尿嘧啶等化疗药物，虽然化疗方案可以延长结直肠癌患者的生存期，但总体中位生存期仍然较短。随着分子生物学的发展，肿瘤的靶向治疗逐步成为结直肠癌治疗的研究热点。目前结直肠癌靶向药研究主要集中在抗血管生成药(如贝伐单抗)、抗表皮生长因子受体药(如西妥昔单抗)、酪氨酸激酶抑制剂(如瑞格非尼)，环状RNA circMAPK14在肿瘤中尚未有研究报道。

发明内容

针对上述问题，本申请提供一种由环状RNA circMAPK14编码产生的多肽，并用以制备抑制结直肠癌细胞增殖及转移药物，为抗结直肠癌药物研发提供进行的靶向。

具体而言，本申请是通过如下技术方案实现的：

一种环状RNA circMAPK14编码的多肽在制备抗癌药物中的应用，所述多肽由175个氨基酸组成，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。该抗癌药物还可包含一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂的药物制剂(如粉末剂、颗粒剂、片剂等)；其可通过制药领域中已知的任何方法制备。药物制剂可适于通过任何适当的途径施用，例如通过经口、经直肠、经鼻、局部(包括经颊、舌下或透皮)、经阴道或肠胃外(包括皮下、皮内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、病灶内、静脉内或真皮内注射或输注)途径。

进一步而言，上述抗癌药物利优选抑制结直肠癌细胞增殖及转移的药物，特别是结直肠癌靶向药。

本申请首次发现环状RNA circMAPK14编码产生的175个氨基酸多肽，在体内及体内外环境中可以有效抑制结直肠癌的增殖和转移，具有应用于制备结直肠癌靶向药物的前景。

附图说明

图1环状RNA circMAPK14在结直肠癌组织和细胞中低表达结果示意图；

其中，A为测序以及生物信息学分析结果示意图；筛选出circMAPK14在结直肠癌组织中低表达并具备翻译潜能；

B为qRT-PCR验证circMAPK14在72例结直肠癌组织中表达下调结果示意图；

C为qRT-PCR验证circMAPK14在结直肠癌细胞系中表达下调结果示意图。

图2为circMAPK14的成环验证及亚细胞定位结果示意图，验证circMAPK14是由4号外显子和10号外显子反向剪接形成。

图3为sanger测序验证circMAPK14的剪接序列结果示意图。

图4为琼脂糖凝胶电泳验证circMAPK14的成环性结果示意图。

图5为Rnase R消化实验验证circMAPK14的稳定性结果示意图。

图6为荧光原位杂交实验结果示意图；验证circMAPK14主要定位在细胞质中。

图7为核质分离PCR结果示意图；验证circMAPK14主要表达在细胞质中。

图8为体外环境下环状RNA circMAPK14集落形成实验，验证circMAPK14能够抑制结直肠癌细胞的增殖；

图9为体外环境下环状RNA circMAPK14的Transwell实验，验证circMAPK14能够抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移。

图10 circMAPK14产生的多肽质谱检测结果示意图，验证环状RNA circMAPK14能够编码产生175个氨基酸的多肽。

图11为结直肠癌细胞系中验证结果示意图。

图12为4对结直肠癌组织中验证结果示意图。

图13为circMAPK14编码潜能的示意图。

图14为circMAPK14编码产生的多肽的氨基酸序列位于MAPK14抗体的氨基酸识别区域示意图。

图15为集落形成实验结果示意图，验证circMAPK14是通过编码产生的175个氨基酸的多肽从而发挥抑制结直肠癌细胞的增殖能力。

图16为Transwell实验检测结果示意图，验证circMAPK14是通过编码产生的175个氨基酸的多肽从而发挥抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移能力。

图17为裸鼠皮下成瘤实验检测结果，该体内验证circMAPK14是通过编码产生多肽从而抑制结直肠癌细胞的进展。

具体实施方式

下面结合具体的制备实施例和应用实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下的实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。

以下实施例中所用的组织样本来自申请人结直肠癌手术患者，病人及家属术前被充分告知研究目的及流程，并签署知情同意书。本研究已通过本单位伦理委员会的批准。

所用的结直肠癌细胞系SW480、DLD-1、LoVo、HT29、HCT116、CaCo2及正常对照细胞系NCM460均购自于上海细胞库。

所用的细胞培养基由DMEM/F12、10％胎牛血清、1％青霉素以及1％链霉素配制，均购自维森特生物技术公司；

提取RNA所用TRIzol购自Invitrogen公司；

qRT-PCR所用试剂均购自南京诺为赞公司。

实施例所涉及的氨基酸/核苷酸序列：

SEQ ID NO.1:

MGADLNNIVKCQKLTDDHVQFLIYQILRGLKYIHSADIIHRDLKPSNLAVNEDCELKILDFGLARHTDDEMTGYVATRWYRAPEIMLNWMHYNQTVDIWSVGCIMAELLTGRTLFPGTDHIDQLKLILRLVGTPGAELLKKISSESARNYIQSLTQMPKMNFANVFIGANPLGIW

SEQ ID NO.2(F)：TTGACTCAGATGCCGAAGATG；

SEQ ID NO.3(R):GACCTCGGAGAATTTGGTAGAT。

实施例1：筛选出环状RNA circMAPK14在结直肠癌中差异表达并具备翻译潜能，同时在组织和细胞中进行验证

本实施例首先通过高通量测序方法检测5对结直肠癌及配对癌旁组织中环状RNA的表达，并通过circRNADb网站数据库及IRES finder软件等生物信息学的分析，发现环状RNA circMAPK14在结直肠癌组织中表达下调，并具备翻译的潜能。进而收集了72例结直肠癌组织及配对癌旁组织样本，提取结直肠组织和细胞RNA，并利用qRT-PCR实验(本领域常规实验方法，具体可参见文献“Real-time reverse transcription PCR(qRT-PCR)and itspotential use in clinical diagnosis”)进行验证环状RNA circMAPK14的表达量。

实验所用circMAPK14的上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，下游引物R核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

表1 circMAPK14的表达量与72例结直肠癌病人临床病理特征相关性分析

*p<0.05表示有统计学差异

将环状RNA circMAPK14的表达量与72例病人的临床病理学资料进行相关性分析，circMAPK14的表达量与72例结直肠癌病人临床病理特征相关性(年龄、性别、肿瘤大小、临床分期等)如上表1所示。

图1为环状RNA circMAPK14在结直肠癌组织和细胞表达示意图，其中，图1A为测序以及生物信息学分析结果示意图，通过筛选可见circMAPK14在结直肠癌组织中低表达并具备翻译潜能；图1B为qRT-PCR验证结果示意图，图中Normal为对照组(正常组)，Tumor为实验组(即72例结直肠癌病人组)，可见circMAPK14在72例结直肠癌组织中表达下调；图1C为不同结直肠癌细胞系及正常对照细胞系的qRT-PCR验证结果示意图，可见circMAPK14在结直肠癌细胞系中表达下调。

图1及表1表明环状RNA circMAPK14在结直肠癌组织和细胞中表达下调，其表达量与肿瘤大小、临床分期及淋巴结转移呈负相关。

实施例2：验证环状RNA circMAPK14是由4号外显子和10号外显子反向剪接形成，并主要定位在细胞质中

在实施例1验证了环状RNA circMAPK14在结直肠癌中低表达之后，本实施例对circMAPK14的环状结构进行验证。

1)利用sanger测序验证circMAPK14是由4号外显子和10号外显子反向剪接而形成的。利用琼脂糖凝胶电泳实验以及Rnase R消化实验确认circMAPK14的确是一种环状结构。实验中sanger测序所用试剂及设备均由南京擎科生物公司完成。

2)构建环状RNA circMAPK14的探针，利用荧光原位杂交实验验证circMAPK14的亚细胞定位。利用核质分离RNA试剂盒提取胞核和胞浆RNA进行PCR进一步验证circMAPK14亚细胞定位。荧光原位杂交实验所用探针及试剂盒均购自广州锐博生物公司(货号C10910)。核质分离RNA提取试剂盒购自南京碧云天生物公司。

FISH实验步骤(依照试剂盒说明书列明的步骤):

1.细胞培养

以3*10⁵每孔密度的细胞均匀铺在6孔板中24小时后，使细胞融合度达到60％-70％。

2.细胞固定与通透

a.PBS清洗细胞5min，然后用4％多聚甲醛室温固定10min；

b.PBS清洗细胞5min，共3次；

c.每孔加入1ml预冷的通透液，4度静置5min；

d.弃去通透液后，加入PBS清洗细胞5min，共3次。

3.探针检测

a.每孔加入200ul预杂交液，37度封闭30min；

b.避光，将2.5ul 20uM FISH Probe Mix储存液加入到100ul杂交液中；

c.弃去预杂交液，加入100ul含有探针的探针杂交液，避光，37度杂交过夜；

d.避光，42度，杂交洗液I清洗细胞3次，每次5min；

e.避光，42度，杂交洗液II清洗细胞1次；

f.避光，42度，杂交洗液III清洗细胞1次；

g.避光，PBS清洗细胞，室温静置5min。

4.DNA染色

a.避光，加入1ml DAPI染色液染色10min；

b.避光PBS清洗细胞3次，每次5min；

c.共聚焦显微镜下检测拍照。

circMAPK14的成环验证及亚细胞定位结果如图2-7所示。具体而言，图2为circMAPK14环状结构示意图，表明circMAPK14是由4号外显子和10号外显子反向剪接形成。

图3为sanger测序结果示意图，验证circMAPK14的剪接序列，证明其是由4号外显子和10号外显子反向剪接而形成的。

图4为琼脂糖凝胶电泳结果示意图，图中A和B分别为DLD1和LoVo细胞系，验证了circMAPK14的成环性。

图5为Rnase R消化实验结果示意图，图中Mock为空白对照组，Rnase R为消化实验组，该检测结果验证了circMAPK14的稳定性。

图6为DLD1和LoVo细胞系荧光原位杂交实验结果示意图，验证circMAPK14主要定位在细胞质中。

图7为核质分离PCR验证结果示意图，图中A和B分别为DLD1和LoVo细胞系，GAPDH和U6均为内参，该检测结果证明circMAPK14主要表达在细胞质(Cytoplasm)中，而非细胞核(Nuclear)中。

实施例3：体外实验验证环状RNA circMAPK14对结直肠癌细胞恶性生物学行为的影响

本实施例具体试验步骤如下：

1)构建环状RNA circMAPK14的过表达和干扰的质粒，随后将其转染至DLD-1细胞(DLD1)中。

实验所用质粒均购自上海吉凯基因公司，细胞转染所用Lipo3000试剂盒购自Invitrogen公司(货号L3000008)，所用方法均为常规方法(参见试剂盒说明书)，获得转染后的细胞。

2)利用集落形成实验验证circMAPK14对结直肠癌细胞增殖能力的影响；

集落形成实验：

取步骤1)转染后处于对数生长期的相对应处理组的细胞，消化计数，在6孔板中以500细胞/孔的密度接种细胞，每个处理组设3个副孔，混匀。放入培养箱培养两周，正常换液，培养液为RMPI1640。两周后弃去上清，用PBS清洗两遍，每孔加入75％酒精固定2分钟。最后吸弃酒精，用结晶紫染色20分钟，观察集落形成情况，检测结果如图8所示，图8中，A为集落形成实验照片，B为不同处理组集落形成数(number of colony formation)统计结果示意图；图中，CircMAPK14-ov组即转染了circMAPK14过表达的质粒，表明上调其表达量，验证circMAPK14上调对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的影响；vector组即转染了空载的质粒，作为circMAPK14-ov组别的对照组；circMAPK14-sh组即转染了circMAPK14干扰的质粒，下调其表达量，验证circMAPK14下调对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的影响；sh-control即转染了对照的质粒，作为circMAPK14-sh组别的对照组。由图8可见集落形成的数量有显著差异，这也验证circMAPK14能够抑制结直肠癌细胞的增殖。

3)利用transwell实验验证circMAPK14对结直肠癌细胞侵袭迁移能力的影响。实验所用结晶紫溶液购自碧云天生物科技公司；

Transwell实验：将3×10⁴/孔步骤1)获得的转染后的细胞悬浮于200ul无血清培养基中，并接种到含有未铺或铺有基质胶的膜的上室中，然后将完全培养基(700ul)加入下室中。培养箱中孵育48小时后，使用0.1％结晶紫染色侵入或迁移至底层膜的细胞。在显微镜下进行观察拍照，并分析结果。

图9为不同细胞迁移(migration)和侵袭(invasion)检测结果示意图，其中A为显微镜检测结果，B为三次重复试验后不同处理组图片视野下侵袭迁移的细胞数目统计结果示意图；图中，CircMAPK14-ov组为转染了circMAPK14过表达的质粒，vector组为转染了空载的质粒，作为circMAPK14-ov组别的对照组，circMAPK14-sh组为转染了circMAPK14干扰的质粒，sh-control为转染了对照的质粒，作为circMAPK14-sh组别的对照组。该检测结果表明了体外环境下circMAPK14能够抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移。

实施例4：验证环状RNA circMAPK14能够编码产生175个氨基酸的多肽

环状RNA circMAPK14具备可翻译编码的必要的两个先决条件IRES元件和ORF序列，本实施例构建IRES元件的野生型和突变型的载体，进行双荧光素酶报告基因检测IRES元件的活性。实验所用载体及试剂盒均购自上海吉凯基因公司；

申请人发现环状RNA circMAPK14编码产生的多肽的氨基酸序列包含了MAPK14抗体的氨基酸识别区域，所以利用MAPK14的商业化的抗体进行蛋白免疫印迹实验进行验证该多肽的存在，随后进一步利用质谱验证该多肽的氨基酸序列(检测结果如图10所示)。实验所用MAPK14的抗体购自abcam公司(ab170099),质谱所用设备交由金开瑞公司完成。

蛋白免疫印迹实验(常规检测方法):

a.首先用去离子水清洗玻璃板，烘干，固定玻璃板，沿侧边灌入配制好的下层胶直至距上部大约2-3cm时，随后加入1ml异丙醇，静置30分钟，等下层胶完全凝固后，弃上边的异丙醇，加入已经配制好的上层胶，慢慢地将梳子插入，注意避免产生气泡，静置20分钟，待上层胶凝固后轻轻拔出齿梳。

b.将玻璃板插入电泳槽，加满电泳缓冲液，在孔中依次加入marker和蛋白样品。先将电压调至80V进行电泳，等待蛋白跑至分离胶后调整电压为120V继续电泳，当目的蛋白至底部时终止。按照分子量大小，裁切目的蛋白所在的部位的胶。

c.裁剪适合大小的PVDF膜，首先经甲醇浸泡后置于切好的蛋白胶上，并置于转膜液中浸润，随后按照阳极至阴极的顺序安装好，加入转膜槽，放置冰袋，恒流转膜，250mA，在冰上转90分钟。

d.封闭：将转好的膜放入配好的封闭液中，室温，摇床封闭2个小时后用TBST溶液清洗3次，每次5分钟。随后孵育一抗，4℃摇床过夜；

e.第二天用TBST溶液摇床上清洗3次，每次10分钟。室温孵育对应的二抗2小时。

f.随后同样用TBST溶液清洗3次，每次10分钟，接着配制显影液，在避光条件下放入显影仪进行曝光，保存图片(如图11、图12所示)，并进行灰度值分析。

结果如图10-14所示，其中，图10为质谱检测结果示意图，将转染circMAPK14过表达的质粒之后，进行WB实验，将跑完WB之后的胶送去质谱验证，验证出FANVFIGANPLGI，是该circMAPK14编码产生175氨基酸的多肽其中一个片段，证明circMAPK14能够编码产生多肽。

图11为结直肠癌细胞系中验证结果示意图，证明circMAPK14编码产生的多肽，其检测的蛋白样品为NCM460、SW480、DLD-1、LoVo、HT29、HCT116、CaCo2不同细胞系提取的蛋白。

图12为4对结直肠癌组织中验证结果示意图，其检测的蛋白样品指4对肠癌组织及其配对正常组织样本提取的蛋白，证明circMAPK14编码产生的多肽。

图13为circMAPK14编码潜能的示意图。

图14为circMAPK14编码产生的多肽的氨基酸序列位于MAPK14抗体的氨基酸识别区域示意图。

本实施例证明环状RNA circMAPK14能够编码产生175个氨基酸的多肽，申请人将该多肽自命名为circMAPK14-175aa。

实施例5体内外实验验证环状RNA circMAPK14是通过编码产生的175个氨基酸的多肽从而发挥抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为的功能的；

本实施例构建了IRES元件的突变质粒(IRES mut)、ATG突变的质粒(ATG mut)、该多肽的过表达质粒(175aa-ov)，将其转染细胞之后，继续通过集落形成实验、transwell实验及裸鼠皮下成瘤实验验证。实验中所用质粒均购自上海吉凯基因公司；本申请中动物实验已通过本单位动物伦理委员会批准通过。本实施例涉及的构建方法均为常规方法，具体可参见文献“CircHIPK3 promotes colorectal cancer growth and metastasis bysponging miR-7”公开的步骤。

裸鼠皮下成瘤实验:

a.从南京医科大学动物中心购买5周龄大小的雌性裸鼠，饲养于动物中心。

b.将不同转染处理之后的细胞取出，将培养液吸弃，用PBS清洗两遍后用胰酶消化细胞，将细胞转移至10ml EP管中，后放入离心机离心，离心完成后弃上层培液。

c.用PBS重悬细胞，并计数，调整细胞终浓度为10万/100ul。

d.在裸鼠的腋窝皮下注射100ul细胞悬液。注射细胞一周以后，每隔一天测量皮下肿瘤的长径与横径并记录。

e.4周后脱颈处死裸鼠，获得小鼠肿瘤样本。拍照记录后将肿瘤样本进行保存。

以上实验检测结果如图15-17所示。

图15为集落形成实验结果示意图，其中A为不同处理集落形成实图片，B和C为三次重复试验后，不同处理组集落形成数(number of colony formation)统计结果示意图；其中，CircMAPK14-ov即转染了circMAPK14过表达的质粒，表明上调其表达量，验证circMAPK14上调对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的影响；vector即转染了空载的质粒，作为circMAPK14-ov组别的对照组；circ IRES mut即转染了将circMAPK14中IRES片段进行突变后的质粒；circ ATG mut即转染了将circMAPK14中的起始密码子ATG片段进行突变后的质粒；而175aa-ov即转染了该175个氨基酸的多肽的过表达质粒；circMAPK14-sh即转染了circMAPK14干扰的质粒，下调其表达量，验证circMAPK14下调对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的影响；sh-control即转染了对照的质粒，作为circMAPK14-sh组别的对照组；而circMAPK14-sh+175aa-ov即共同转染了circMAPK14干扰的质粒和175个氨基酸的多肽的过表达质粒，即为回复实验。该体外实验显示不同处理之间，集落形成的数量有显著差异，共同验证circMAPK14是通过编码产生的175个氨基酸的多肽从而发挥抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为的功能。

图16为不同细胞迁移(migration)和侵袭(invasion)检测结果示意图，其中A为显微镜检测结果，B、C为三次重复试验后不同处理组图片视野下侵袭迁移的细胞数目统计结果示意，CircMAPK14-ov即转染了circMAPK14过表达的质粒，vector即转染了空载的质粒，作为circMAPK14-ov组别的对照组；circ IRES mut即转染了将circMAPK14中IRES片段进行突变后的质粒；circ ATG mut即转染了将circMAPK14中的起始密码子ATG片段进行突变后的质粒；175aa-ov即转染了该175个氨基酸的多肽的过表达质粒；circMAPK14-sh即转染了circMAPK14干扰的质粒；sh-control即转染了对照的质粒，作为circMAPK14-sh组别的对照组；而circMAPK14-sh+175aa-ov即共同转染了circMAPK14干扰的质粒和175个氨基酸的多肽的过表达质粒，即为回复实验。该检测验证circMAPK14是通过编码产生的175个氨基酸的多肽从而发挥抑制结直肠癌细胞的侵袭迁移能力。

图17为裸鼠皮下成瘤实验结果，CircMAPK14-ov即转染了circMAPK14过表达的质粒，表明上调其表达量，验证circMAPK14上调对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的影响；vector即转染了空载的质粒，作为circMAPK14-ov组别的对照组；而175aa-ov即转染了该175个氨基酸的多肽的过表达质粒；circMAPK14-sh即转染了circMAPK14干扰的质粒，下调其表达量，验证circMAPK14下调对结直肠癌细胞的恶性生物学行为的影响；sh-control即转染了对照的质粒，作为circMAPK14-sh组别的对照组；而circMAPK14-sh+175aa-ov即共同转染了circMAPK14干扰的质粒和175个氨基酸的多肽的过表达质粒，即为回复实验。该体内实验的不同组别共同验证环状RNA circMAPK14是通过编码产生的175个氨基酸的多肽从而发挥抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为的功能。

以上实施例说明本发明提供的多肽是由环状RNA circMAPK14编码产生并具备抑制结直肠癌细胞恶性生物学行为的能力，可应用于制备结直肠癌靶向药物。

本发明不限于这些公开的实施方案，本发明将覆盖在专利书中所描述的范围，以及权利要求范围的各种变型和等效变化。

序列表

<110> 江苏省人民医院（南京医科大学第一附属医院）

<120> 环状RNAcircMAPK14编码的多肽在制备抗癌药物中的应用

<141> 2020-11-16

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 175

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Ala Asp Leu Asn Asn Ile Val Lys Cys Gln Lys Leu Thr Asp

1 5 10 15

Asp His Val Gln Phe Leu Ile Tyr Gln Ile Leu Arg Gly Leu Lys Tyr

20 25 30

Ile His Ser Ala Asp Ile Ile His Arg Asp Leu Lys Pro Ser Asn Leu

35 40 45

Ala Val Asn Glu Asp Cys Glu Leu Lys Ile Leu Asp Phe Gly Leu Ala

50 55 60

Arg His Thr Asp Asp Glu Met Thr Gly Tyr Val Ala Thr Arg Trp Tyr

65 70 75 80

Arg Ala Pro Glu Ile Met Leu Asn Trp Met His Tyr Asn Gln Thr Val

85 90 95

Asp Ile Trp Ser Val Gly Cys Ile Met Ala Glu Leu Leu Thr Gly Arg

100 105 110

Thr Leu Phe Pro Gly Thr Asp His Ile Asp Gln Leu Lys Leu Ile Leu

115 120 125

Arg Leu Val Gly Thr Pro Gly Ala Glu Leu Leu Lys Lys Ile Ser Ser

130 135 140

Glu Ser Ala Arg Asn Tyr Ile Gln Ser Leu Thr Gln Met Pro Lys Met

145 150 155 160

Asn Phe Ala Asn Val Phe Ile Gly Ala Asn Pro Leu Gly Ile Trp

165 170 175

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ttgactcaga tgccgaagat g 21

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacctcggag aatttggtag at 22

Claims (2)

1.环状RNA circMAPK14编码的多肽在制备抗癌药物中的应用，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述抗癌药物是指抑制结直肠癌细胞增殖及转移的药物。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述抗癌药物是指结直肠癌靶向药。

Images