CN113293211B - 靶向herv-h的物质在肿瘤中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及生物技术领域，特别涉及靶向HERV‑H的物质在肿瘤中的应用。本发明所述HERV‑H可以作为靶点应用于肿瘤药物。本发明首先设计并合成针对新靶点HERV‑H的shRNA，将其转染至体外培养系统中，检测结直肠癌细胞和类器官的增殖情况，证实干扰HERV‑H的表达后可有效抑制结直肠癌的发生及发展。再设计并合成靶向HERV‑H的siRNA，进行细胞表型实验，进一步证明HERVH可以作为治疗靶点。HERV‑H gag原位杂交探针可以应用于检测肿瘤细胞和组织中HERV‑H的表达。本发明为结直肠癌、胃癌、膀胱尿路上皮癌、肺鳞癌、头颈部鳞状细胞癌和肝细胞肝癌等肿瘤的治疗提供新的药物研发方向。

Description

靶向HERV-H的物质在肿瘤中的应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其涉及靶向HERV-H的物质在肿瘤中的应用。
背景技术
肿瘤是我国的主要死亡原因，在过去的半个世纪，我国肿瘤的发生率和死亡率均保持上升趋势。2018年，肿瘤的新发病例约430万例，死亡病例约290万例。如何有效治疗肿瘤是亟待解决的公共卫生问题。
与传统的放疗和化疗治疗手段相比，肿瘤的分子靶向治疗作为一种革命性的肿瘤疗法，分子靶向治疗具有更高的特异性，能选择性地抑制肿瘤细胞，对正常组织的损伤较低，副作用小。美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)已经批准的一些分子靶向药在治疗结直肠癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等肿瘤中取得了成功。临床上应用的结直肠癌等肿瘤的靶向药主要分为两大类。第一类是根据肿瘤细胞依赖癌基因或抑癌基因驱动的信号传导通路，如图1A所示，通过靶向抑制这些关键信号通路从而特异抑制肿瘤细胞的生长、增殖和转移，诱导细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的效果；这一类药物包括图1B所示的抑制血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的贝伐单抗(bevacizumab)，以及抑制上皮生长因子受体(epithelial growth factor receptor，EGFR)的西妥昔单抗(cetuximab)等。第二类则是靶向激活免疫细胞，如派姆单抗(pembrolizumab)高度选择拮抗免疫细胞表面的程序性死亡受体-1(Programmed celldeath protein 1，PD-1)，减弱T细胞受到的增殖抑制作用，使得T细胞杀伤肿瘤细胞的作用增强，从而出现抗肿瘤效果。
尽管现有的分子靶向药物提高了患者的总体生存率，但主要适用于出现靶点突变或扩增等特征的部分病人。目前市场上靶向分子治疗的药物仍然较少，无法覆盖所有病人，首要原因是缺乏有效的特异靶点，包括目前分子治疗靶点在内的全部基因的编码序列总共只占人类基因组序列的2％左右，亟需寻找新的有效靶点。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种靶向 HERV-H的物质在肿瘤中的应用，为肿瘤的靶向治疗提供强有力的手段。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质在肿瘤中的应用。
较佳的，靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
较佳的，所述靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质用于干扰或降低 HERV-H的表达水平。
较佳的，所述的靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质选自基于RNA 干扰技术敲低HERV-H的表达的双链RNA。
较佳的，所述的敲低HERV-Hgag、pro和pol的表达水平的双链RNA 为siRNA或shRNA。
较佳的，所述的siRNA包括siHERVH#1和siHERVH#2；所述 siHERVH#1的正向序列如SEQ ID NO.18所示，反向序列如SEQ ID NO.19 所示；
所述siHERVH#2的正向序列如SEQ ID NO.20所示，反向序列如SEQ ID NO.21所示。
较佳的，所述的shRNA包括shHERVH#1和shHERVH#2；所述 shHERVH#1的正向序列如SEQ ID NO.10所示，所述反向序列如SEQ ID NO.11所示；
所述shHERVH#2的正向序列如SEQ ID NO.12所示，所述反向序列如SEQ ID NO.13所示。
在体外慢病毒介导的shRNA敲低HERV-H显著抑制肿瘤细胞增殖，在体内HERV-H敲低还抑制裸鼠异种移植瘤的生长；
在体外用siRNA靶向干扰HERV-H后抑制肿瘤细胞生长。
较佳的，HERV-H gag原位杂交探针在利用原位杂交方法检测肿瘤细胞和组织中HERV-H的表达中的应用。
较佳的，所述的HERV-H gag原位杂交探针具有SEQ ID NO.22-65 中任意一个序列。
另一方面，本发明提出一种肿瘤药物的设计方法，以抑制或降低 HERV-Hgag、pro和pol表达为靶点
(三)有益效果
本发明的有益效果是：本发明所提供的HERV-Hgag，pro和pol区域可以作为靶点应用于肿瘤药物，靶向HERV-Hgag，pro和pol的物质在肿瘤中的应用。本发明首先设计并合成针对新靶点HERV-Hgag和pro的 shRNA，将其转染至体外培养系统中，如K-ras突变型，微卫星高度不稳定等多种不同遗传背景的结直肠癌细胞系，以及免疫缺陷小鼠和结直肠癌病人肿瘤组织来源的类器官，检测结直肠癌细胞和类器官的增殖情况，证实干扰HERV-H的表达后可有效抑制结直肠癌的发生及发展。再针对 shRNA序列设计并合成靶向HERV-H gag和pro的siRNA，进行细胞表型实验，证明HERV-H作为治疗靶点的可靠性。此外，本发明首先设计并合成针对新靶点HERV-H gag的探针，用于检测细胞或肿瘤组织中 HERV-H的表达量和定位。本发明为结直肠癌、胃癌、膀胱尿路上皮癌、肺鳞癌、头颈部鳞状细胞癌和肝细胞肝癌等肿瘤的治疗提供新的药物研发方向。
附图说明
图1A为用于开发靶向药的关键通路。
图1B为FDA批准的肿瘤靶向药。
图2为HERV-H中间区域的结构图。
图3为根据TCGA(The Cancer Genome Atlas，肿瘤基因组数据图谱计划)和CGP(Cancer Genome Project，癌症基因组计划)数据库的多个癌种的癌旁组织和癌症组织样本的差异分析结果，HERV-H在胃癌 (STAD)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、结肠癌(COAD)、肺鳞癌(LUSC)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)和肝细胞肝癌(LIHC)中异常高表达。
图4中荧光定量PCR显示不同结直肠癌细胞中HERV-H gag表达量高于HERV-K。
图5为HERRV-H gag、pro和pol的序列合成shRNA及siRNA的示意图。
图6中在结直肠癌细胞LS174T中用shRNA干扰HERV-H后，与对照组shGFP比较，HERVH-pol和HERVH-gag均下调表达。
图7敲低HERV-H后，肿瘤细胞增殖受到显著抑制，图7a中上方的折线表示shHERVH#1,下方的折线表示shGFP。用t检验比较差异，*** 表示p<0.001。图7b说明对照组(shGFP)中细胞克隆数比干扰HERVH 组的多。
图8为用siHERVH#1和siHERVH#2干扰HERV-H后，HERV-H的表达量。
图9为用siHERVH#1干扰HERVH后，观察存活的细胞数量图。
图10为裸鼠异种移植瘤实验中肿瘤体积的变化。
图11中结直肠癌病人来源的类器官实验说明干扰HERV-H后，抑制肿瘤生长；图11A为培养结直肠癌病人来源的结直肠癌类器官的过程；图11B为荧光原位杂交实验检测shHERVH能有效降低HERV-H的表达量；图11C-E表达干扰HERV-H后结直肠癌类器官体积、数目变化图；图11F-H为上皮来源的标志物E-Cadherin、细胞增殖标志物Ki67免疫荧光和TUNEL染色实验图。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
目前分子治疗靶点在内的全部基因的编码序列总共只占人类基因组序列的2％左右，但内源性逆转录病毒序列(endogenous retroviruses,ERVs) 大约占人类基因组的8％。目前，还未见报道将HERV-H gag，pro和pol 区域作为靶点，应用于肿瘤疾病中。
如表1所示，ERVs包括HERV-K(Human endogenous retrovirus subfamily K，人内源性逆转录病毒序列亚家族K)、HERV-H(Human endogenous retrovirus subfamily H，人内源性逆转录病毒序列亚家族H，) 等大约600个亚家族。ERV在肿瘤的发生中发挥重要作用。HERV-H也记作HERVH。图2是以一个ERV亚家族HERV-H为例，其中间区域 (HERVH-int)由gag(group specific antigen，组特异性抗原)、pro(protease，蛋白酶)、pol(polymerase，聚合酶)和env(envelope，包膜)组成。
表1部分ERV亚家族
ERV亚家族 中间区域(internal region,int) 对应的长末端重复序列(LTR)
HERV-K HERVK-int LTR5B,LTR5_Hs,LTR5A,LTR5
HERV-K9 HERVK9-int MER9a3,MER9a2,MER9B,MER9a1
HERV-K14 HERVK14-int LTR14A,LTR14B
HERV-L HERVL-int MLT2A1,MLT2A2
ERV-L ERVL-int MLT2B5,MLT2B3
HERV-H HERVH-int LTR7,LTR7A,LTR7B,LTR7C,LTR7Y
THE1 THE1-int NA
HERV-H在正常组织中几乎检测不到表达。但是，HERV-H在多种类型肿瘤组织及细胞中高效表达，如结直肠癌、胃癌、膀胱尿路上皮癌、结肠癌、肺鳞癌、头颈鳞状细胞癌和肝细胞肝癌。通过在肿瘤细胞或者组织中检测到高表达的HERV-H，能够进行癌症的诊断。
此外，本发明人进一步发现特异性针对HERV-H gag、pro和pol靶向能极显著抑制癌细胞的增殖及生长，从而为肿瘤的治疗提供了新的有效靶点，HERV-H gag、pro和pol可以作为肿瘤治疗的新靶点，在此基础上完成了发明。
本发明一方面提供一种靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质在肿瘤中的应用。上述肿瘤选自结直肠癌、胃癌、膀胱尿路上皮癌、结肠癌、肺鳞癌、头颈鳞状细胞癌和肝细胞肝癌。
本发明中靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质在制备治疗肿瘤的药物中的用途。
本发明中，“治疗”依次包括可导致欲求的药学和/或生理效果的预防性、治愈性或缓和性的处置。
靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质用于干扰或降低HERV-H的表达水平
本发明中靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质用于干扰或降低 HERV-H的表达水平，可以是完全抑制，也可以是部分抑制HERV-H的表达。用于干扰或降低HERV-H表达的物质可以是各种能够起到上述功能的物质。
例如靶向HERV-Hgag、pro和pol的物质可以选自基于RNA干扰技术敲低HERV-H的表达的双链RNA。
更具体地，敲低HERV-H的表达水平的双链RNA为siRNA或shRNA。
上述siRNA包括siHERVH#1和siHERVH#2；siHERVH#1的正向序列为GGCUACCCACUCCACAUUATT(SEQ ID NO.18)，反向序列为 UAAUGUGGAGUGGGUAGCCUC(SEQ IDNO.19)；siHERVH#2的正向序列为AACUCGUCCCAAAUCUUCCTT(SEQ ID NO.20)，反向序列为GGAAGAUUUGGGACGAGUUGC(SEQ ID NO.21)。
shRNA包括shHERVH#1和shHERVH#2；shHERVH#1正向序列为 CCGGGAGGCTACCCACTCCACATTACTCGAGTAATGTGGAGTGGGT AGCCTCTTTTTG(SEQ ID NO.10)，反向序列为 AATTCAAAAAGAGGCTACCCACTCCACATTACTCGAGTAATGTGGA GTGGGTAGCCTC(SEQ ID NO.11)；shHERVH#2正向序列为 CCGGGCAACTCGTCCCAAATCTTCCCTCGAGGGAAGATTTGGGACG AGTTGCTTTTTG(SEQ IDNO.12)，反向序列为 AATTCAAAAAGCAACTCGTCCCAAATCTTCCCTCGAGGGAAGATTT GGGACGAGTTGC(SEQ ID NO.13)；
在下述实施例中：在体外慢病毒介导的shRNA敲低HERV-H显著抑制肿瘤细胞增殖，在体内HERV-H敲低抑制裸鼠异种移植瘤的生长；
在体外用siRNA靶向干扰HERV-H后显著抑制肿瘤细胞生长。
另一方面，HERV-H gag原位杂交探针具体表现为其在利用原位杂交方法检测肿瘤细胞和组织中HERV-H的表达中的应用。
HERV-H gag原位杂交探针的具有SEQ ID NO.22-65中任意一个序列。本申请根据HERV-H的序列SEQ ID NO.7一共合成了44个HERV-H gag 原位杂交探针。用HERV-H gag的原位杂交探针，靶向检测HERV-H的表达量。
本申请中运用TCGA(The Cancer Genome Atlas，肿瘤基因组数据图谱计划)和CGP(Cancer Genome Project，癌症基因组计划)数据库中的多个癌种的癌旁组织和癌症组织样本进行分析，根据多个癌种的癌旁组织和癌症组织样本的差异分析结果，发现HERV-H在正常的成体细胞中表达水平较低，但是在在胃癌(STAD)、膀胱尿路上皮癌(BLCA)、结肠癌(COAD)、肺鳞癌(LUSC)、头颈鳞状细胞癌(HNSC)和肝细胞肝癌(LIHC)等多类肿瘤中表达异常高，具体分析结果如图3所示。由图3的数据可知，HERV-H来源的非编码RNA可能参与多类肿瘤的发生，说明HERV-H有望为结直肠癌等肿瘤的新的治疗靶点。
下面通过实施例对本申请的发明予以进一步说明，但并不因此而限制本申请的范围。
除非另有说明，本发明中所公开的试验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域的分子生物学、生物化学、分析化学、细胞培养、重组DNA技术等相关领域的常规技术。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无具体实施例描述部分：特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
通过本实施例可知：结直肠癌细胞中HERV-Hgag的表达量高于 HERV-K，说明HERV-Hgag的表达在结直肠细胞中可能发挥更为重要的作用。
(1)材料和试剂：
本实施例所用的材料与试剂如表2所示。本实施例中采用如下表所示的基础培养基和血清，按照体积比10％FBS比例配制，用于培养HCT116 等细胞。
表2实施例2所用材料及试剂
Figure GDA0003952700200000091
(2)实验步骤及结论
1)提取RNA
第1步：收集各细胞，以6孔板的1个孔中长满的细胞为例，用缓冲液DPBS漂洗3遍后，加入1ml RNAiso plus后，颠倒混匀让细胞充分裂解；
第2步：静置5分钟后，将6孔板中的细胞液转移至1.5ml的无RNA 酶的离心管中，加入200ul的氯仿，震荡混匀后静置8-10分钟，管中液体分为3层，底层为粉色有机溶剂，中层为白色DNA和蛋白质混合物，上层为近透明的RNA层；
第3步：将上述含有氯仿和细胞裂解液的离心管在4摄氏度的离心机中以13000rpm的转速离心15-20分钟后，取上层的RNA上清至新的 1.5ml离心管中，加入500ul～1000uml的异丙醇，涡旋后静置10分钟；
第4步：将上述含有RNA溶解液的离心管，在4摄氏度的离心机中以13000rpm的转速离心10-15分钟，弃除上清液，保留沉淀；
第5步：在上述含有RNA沉淀的离心管中加入适量1ml的75％乙醇清洗沉淀，离心后弃除上清液保留沉淀；
第6步：重复第5步；
第7步：干燥，加入30ml无RNA酶的水溶解RNA；
第8步：测试RNA浓度，RNA浓度在100ng/ul以上，说明提取的 RNA质量较好。
2)逆转录
在PCR管中按照表3所示的体系加入各试剂，涡旋混匀后离心，在 PCR仪上，运行程序，将RNA逆转录为cDNA，其中，PCR仪中的反应条件为：37℃15分钟，85℃5秒，12℃1小时。
表3PCR管中试剂或材料的比例
试剂或材料 体积或重量
PrimeScriptTM RT reagent Kit中的5Xbuffer 4ul
PrimeScriptTM RT reagent Kit中的primer RT enzyme 1ul
PrimeScriptTM RT reagent Kit中的oligo dT primer 1ul
PrimeScriptTM RT reagent Kit中的random primer 1ul
RNA 1ug
ddH<sub>2</sub>O 补足至20ul
3)荧光定量PCR
在96孔板中配置好荧光定量PCR的混合液，混合液体系如表4所示。
荧光定量PCR中所用的内参actin的正向引物为 TCCCTGGAGAAGAGCTACGA(SEQ IDNO.1)，反向引物 AGCACTGTGTTGGCGTACAG(SEQ ID NO.2)。
所用的引物包括HERVH-gag和HERV-K 108gag-pro-pol；HERVH-gag 的正向引物为ACGCTTTACAGCCCTAGACC(SEQ ID NO.3)，反向引物为GTCGGGAGCAGATTGGGTAA(SEQ IDNO.4)；HERV-K 108gag-pro-pol 的正向引物为CCCACAGTTGAGGCCAGATA(SEQ ID NO.5)，反向引物为TGAGAGGGTGAGAGAGACGA(SEQ ID NO.6)。
表4PCR的混合液体系
试剂或材料 体积
SYBR Green qPCR Master Mix 5ul
正向引物 0.5ul
反向引物 0.5ul
cDNA 4ul
将上述配置好的混合液在Thermo Fisher Scientific appliedbiosystemsQuantStudio 3上循环扩增，运行程序的参数如表5所示。
表5荧光定量PCR的运行参数
Figure GDA0003952700200000111
检测LS174T等各细胞中actin、HERVH-gag(用于检测HERV-H) 和HERV-K 108gag-pro-pol(用于检测HERV-K)的Ct值(Cycle Threshold，扩增循环数)，再利用如下步骤通过2-δCt的相对定量算法分析检测结果。
第1步：Ct目的靶点-Ctactin＝δCt；第2步：表达量＝2-δCt
对收集的K-ras突变或野生型、微卫星稳定或高度不稳定等不同遗传背景的结直肠癌细胞系LS174T、HCT116、DLD1、SW620、HT29、HCT8、 SW480和RKO，按照上述实验步骤提取RNA、逆转录，利用HERV-K 和HERV-H特异的引物检测后，进行荧光定量PCR实验，其中HERV-K特异的引物的正向引物序列如SEQ ID NO.5所示，反向引物序列如SEQ ID NO.6所示；HERV-H特异的引物的正向引物序列如SEQ ID NO.3所示，反向引物序列如SEQ ID NO.4所示。
如图4所示，通过荧光定量PCR发现，在LS174T、HCT116、DLD1、 SW620、HT29、HCT8、SW480和RKO等大部分肿瘤细胞中HERV-Hgag 的表达量高于HERV-K，由此可知HERV-Hgag的表达在结直肠癌细胞中发挥更为重要的作用。
实施例2
本实施例中：在多个不同的结直肠癌细胞系中，比较对照组和实验组干扰HERV-Hgag、pro和pol组的细胞的增殖能力差异，发现敲低 HERV-H gag、pro和pol可抑制肿瘤细胞生长，证明HERV-H gag、pro 和pol高表达对维持结直肠癌细胞生长是必需的。
(1)材料和试剂：
收集表6所示的质粒，基于载体pLKO.1-TRC构建干扰GFP的质粒 pLKO-shGFP和HERV-H的质粒pLKO-shHERV-H#1及 pLKO-shHERV-H#2，再与慢病毒包装质粒psPX2和pMD2.G共同转染，以获得包装了质粒的病毒颗粒。
本实施例所用的试剂如表7所示，用DMEM和胎牛血清配置含有体积百分比10％FBS的完全培养基，用于培养293T细胞。
表6实施例3的材料
材料 用途 来源
psPAX2 第二代慢病毒包装质粒 中南大学湘雅医院
pMD2.G 第二代慢病毒包装质粒 中南大学湘雅医院
pLKO.1-TRC shRNA克隆载体 中南大学湘雅医院
表7实施例3的试剂
Figure GDA0003952700200000121
Figure GDA0003952700200000131
Figure GDA0003952700200000141
(2)实验步骤
1)构建干扰GFP、HERV-Hgag、pro和pol的质粒
第1步：由图3可知，HERV-H gag和pro有部分重叠，分别根据 GFP和HERV-H gag，pro和pol的序列，从长沙擎科公司合成了表9所示的干扰GFP的shRNA和两组干扰HERV-H的shRNA序列；其中， HERV-H的序列如SEQ ID NO.7所示。HERV-Hgag、pro和pol合成shRNA 的示意图如图5所示。
干扰GFP的shRNA的序列为shGFP，两组干扰HERV-H的shRNA 序列分别为shHERVH#1和shHERVH#2，具体如表8所示。
表8shRNA的正向序列及反向序列
Figure GDA0003952700200000142
第2步:分别将shGFP、shHERVH#1和shHERVH#2的正反向序列按照如下表9的体系混合后，涡旋混匀，短暂离心，放在沸水中，自然冷却至室温，以退火得到双链。
表9
Figure GDA0003952700200000143
Figure GDA0003952700200000151
第3步：按照如下表10的体系，酶切载体pLKO.1-TRC，涡旋后混匀，短暂离心，37摄氏度孵育4小时或室温过夜。
表10
pLKO.1-TRC克隆载体 6ug
AgeI-HF 2ul
EcoRI-HF 2ul
10x CutSmart Buffer 5ul
ddH<sub>2</sub>O 补足至50ul
第4步：跑琼脂糖凝胶后切胶，用胶回收试剂盒回收pLKO.1载体片段。
第5步：按照表11的体系配置反应液体后，分别将shGFP、 shHERVH#1和shHERVH#2寡核苷酸短链和pLKO.1载体片段连接，室温静置2小时以上，构建pLKO-shGFP，pLKO-shHERVH#1和 pLKO-shHERVH#2干扰质粒。加入50ul感受态细胞，进行转化，用质粒小抽试剂盒(kit)抽提质粒，测序鉴定正确后，转染到细胞中包装病毒颗粒。
表11
退火的shRNA 3ul
pLKO.1载体 150ng
NEB T4 DNA Ligase 0.5ul
10x NEB T4 DNA Ligase buffer 1ul
ddH<sub>2</sub>O 补足至10ul
2)利用293T细胞，将质粒包装在慢病毒颗粒中
第1步：接种HEK293T细胞于10cm细胞培养皿中，待细胞密度约为70％时，10cm培养皿中转染总质粒为12ug，按照表12体系转染质粒。
表12
慢病毒包装质粒pMD2.G 2ug
慢病毒包装质粒psPAX2 4ug
干扰GFP或HERV-H的目的质粒 6ug
第2步：配置如下转染体系：
A管：加入600ul Optim-MEM，然后加入2ug的pMD2.G，4ug的psPAX2，以及6ug的目的质粒pLKO-shGFP或者pLKO-shHERVH#1。
B管：加入600ul Optim-MEM，30ul LipofectamineTM 2000 TransfectionReagent。
将A管和B管各自混匀后，室温静置5分钟，再将A管中的混合物加入B管，混匀，静置20分钟，均匀加入细胞培养皿中。
第3步：12-16小时后更换10cm细胞培养皿中的培养基为新鲜培养基；转染48小时后收集细胞培养液于4摄氏度冰箱，然后添加新鲜培养基；转染72小时后，再收集细胞培养液，如果细胞状态较好，再添加新鲜培养基，收集96小时后的细胞培养液。
第4步：将收集的细胞培养液以1000rpm转速离心5分钟，去掉底部细胞碎片，收集含有病毒的上清液。
3)用荧光定量PCR实验证实慢病毒颗粒特异有效降低HERV-Hgag 和pol的表达水平
第1步：按照病毒上清液：细胞培养皿所需培养液＝1：1的体积比感染细胞，以用10cm培养皿培养结直肠癌细胞LS174T为例，在对照组和实验组中，分别加入10ml含有shGFP或shHERVH#1的病毒上清液；在含有10ml 培养液的10cm培养皿中加入2.5ul浓度为8mg/ml的Polybrene，使得 Polybrene的终浓度是2ug/ml。
第2步：细胞感染病毒24小时后，吸干培养基，10cm培养皿中加入 2mlDPBS，充分晃匀后吸干DPBS，加入1ml胰酶消化，传代。
第3步：细胞感染病毒72小时后，收集对照组shGFP和实验组 shHERVH#1的细胞。
第4步：按照实施例2中的方法抽提RNA、逆转录，再利用检测内参 actin以及HERV-H的引物HERVH-pol和HERVH-gag，进行荧光定量PCR 实验，检测敲低效率。HERVH-pol引物包括正向引物HERVH-pol-F： CGCCCTTCTTCCCAATCCAA(SEQ ID NO.14)和反向引物HERVH-pol-R： GCCAAGGAGGGAGTAGAGGT(SEQ ID NO.15)；HERVH-gag的正向引物和反向引物如SEQ IDNO.3及SEQ ID NO.4所示；内参actin的正向引物和反向引物如SEQ ID NO.1及SEQ ID NO.2所示。
如图6所示，发现在结直肠癌细胞LS174T中用shRNA干扰HERV-H 后，与对照组shGFP相比较，HERVH-pol和HERVH-gag均下调表达，证实慢病毒颗粒滴度较高，即能特异有效降低HERV-H的表达水平。
4)用MTT实验检测细胞活力
第1步：以10cm培养皿为例，用1ml胰酶消化对数期细胞，终止消化后离心收集，制成细胞悬液，计数后，按照每个孔的细胞量是1000～10000 个，计算后取适量细胞铺板于96孔板中，边缘孔用无菌PBS填充。
第2步：将上述含有细胞的96孔板置于培养箱中培养至细胞单层铺满孔底，贴壁后按照6孔板的每个孔需要200ul的培养液，在对照组和实验组中分别加入200ul包含shGFP或shHERVH病毒的上清液，继续培养1天、2 天、3天、4天、5天、6天和7天。
第3步：每个孔加入20ul MTT溶液(5mg/ml，即0.5％MTT)，继续培养4h后终止培养。
第4步：小心地吸走孔内培养液，每个孔加入150ul三联溶解液，放入培养箱孵育。
第5步：用酶标仪检测，病毒感染细胞1天后、2天后、3天后、4天后、 5天后、6天后和7天后，对照组(shGFP组)和实验组(shHERVH#1组) 细胞，在490nm波长各个孔的吸光度值，记录结果，以时间为横坐标，将各天的吸光度值除以加入病毒之前细胞的吸光度值后，计算细胞活力值，细胞活力值为纵坐标绘制细胞生长曲线，如图7a所示。
5)用克隆形成实验检测细胞接种存活率
第1步：以10cm培养皿为例，将对数生长期的对照组(shGFP组)和实验组(shHERVH#1组)细胞，各自用1ml胰酶消化后，终止消化后离心收集，制成细胞悬液并计数。
第2步：按照6孔培养板中每个孔的细胞量为700个，计算后取适量体积的shGFP细胞和shHERVH#1细胞，接种于6孔板中，轻柔晃动后，使细胞均匀分散，静置于培养箱中培养2-3周。
第3步：观察shGFP组和shHERVH#1组的培养皿中出现克隆后，终止培养，弃上清液，用2ml的缓冲液DPBS清洗后，按照表13体系配置4％多聚甲醛后，在每个孔中用1ml的4％多聚甲醛固定15-30分钟，然后去掉固定液。
表13
Formaldehyde solution 37％甲醛溶液 6ml
DPBS 54ml
第4步：每个孔加入1ml的结晶紫染色液染10～30分钟后，去掉染色液，加入2mlDPBS漂洗后，室温放置。
第5步：对整个六孔板，用数码相机拍照，如图7b所示，并比较shGFP 组和shHERVH#1组的克隆数差异。
(3)测试结果和结论：
对K-ras突变或野生型、微卫星稳定或高度不稳定等不同遗传背景的结直肠癌细胞系LS174T、HCT116、DLD1、SW620、HT29、HCT8、SW480 和RKO，用特异靶向HERV-H的shRNA降低HERV-H的转录水平后，通过MTT和克隆形成实验，如图7所示，敲低HERV-H后，肿瘤细胞增殖受到显著抑制。图7a中上方的折线表示shHERVH#1,下方的折线表示 shGFP，用t检验比较差异，***表示p<0.001。图7b说明对照组(shGFP) 中细胞克隆数比干扰HERVH组的多。实验组与对照组相比可知，敲低 HERV-H后结直肠癌细胞的生长受到显著抑制，细胞的克隆数目较少，说明HERV-H的高表达对维持结直肠癌细胞的生长是必需的。
实施例3
(1)材料和试剂
根据靶向HERV-H的shRNA序列shHERVH#1及shHERVH#2，从吉玛基因公司合成如下表所示的用于对照组的siRNA non-target(siNT)，以及两对靶向干扰HERV-H gag、pro和pol的siRNA(siHERVH#1和 siHERVH#2)双链的正向序列和反向序列，siRNA的序列如表14所示。
表14靶向干扰HERV-H的siRNA序列及对照组的siRNA的序列
Figure GDA0003952700200000191
(2)实验步骤
1)用RNA测序技术(RNA-sequencing,RNA-seq)检测
第1步：结直肠癌细胞HCT116 ARID1A(AT-Rich Interaction Domain 1A，AT丰富结合域1A)基因KO的细胞，转染之前的18-24个小时，在6孔板中每个孔的2ml培养液中，接种1X10^6个细胞，确保转染时细胞密度在30-50％。
第2步：转染，在6孔板中的每个孔中，对照组中加入100pmol的 siNT，实验组中加入100pmol的siHERVH#1和siHERVH#2，再加入5ul 转染试剂lipofectamine。
第3步：转染72小时后，按照实施例2的中的方法提取细胞RNA，收集对照组和实验组的RNA样品，送样到北京诺禾致源公司进行 RNA-seq后得到原始测序读段。
第4步：在服务器上，将测序读段比对到人类参考基因组后，定量，将来源自HERVH-int(HERV-H internal region，HERV-H中间区域)的测序读段总数除以测序深度完成标准化后，计算得到HERVH-int的表达量(counts per million,每百万个读段中的数目，简写为CPM)，将CPM 作为纵坐标的值，如下图8所示，比较对照组和实验组的HERVH表达量差异，发现用siHERVH#1和siHERVH#2干扰HERV-H后，HERV-H的表达量下降，证明siHERVH#1和siHERVH#2是有效的。
2)在HCT116细胞中，用siHERVH#1干扰HERVH后，观察存活的细胞数量。
第1步：以24孔板为例，在转染实验前的18-24个小时，在每个孔的500ul培养基中加入1.5-3.5X10^4个HCT116细胞，确保转染时细胞密度在30-50％。
第2步：取出24孔板，在对照组中加入20pmol的siNT，在实验组中加入20pmol的siHERVH#1。对照组与实验组中分别加入1ul的转染试剂lipofectamine。
第3步：转染72小时后，用数码LED倒置荧光显微镜和明美显微数码测量分析系统，对24孔板中的细胞取多个不同视野进行拍照，如图7 所示，比较对照组siNT和实验组siHERVH#1的细胞数量差异。
(3)测试结果和结论
在结直肠癌细胞HCT116中，如下图9所示，与上方的对照组(siNT) 细胞相比，下方的干扰HERV-H后的细胞数量减少。证实HERV-H的表达对维持结直肠癌细胞的生长是必需的，特异靶向干扰HERV-H的表达可抑制肿瘤细胞生长，具有很高的临床转化前景，本发明提出的沉默 HERV-H的siRNA在治疗结直肠癌等肿瘤中有很好的应用价值。
实施例4
本实施例证实干扰HERV-H gag、pro和pol后，可有效抑制结直肠癌细胞异种移植瘤的生长。
(1)材料：从湖南斯莱克景达实验动物有限公司购买了20只4周龄的BALB/c-nu裸鼠，饲养两周后进行实验。本实施用到的试剂如表15 所示。
表15实施例4的试剂
Figure GDA0003952700200000211
(2)实验步骤及结论
第1步：消化收集HCT116细胞，细胞计数后，按每3×106细胞接种于10cm培养皿中培养24小时后，更换为含有8μg/ml polybrene新鲜培养基，每皿加入300μl预先包装好的pLKO.1-shGFP或者 pLKO.1-shHERVH慢病毒，37℃5％CO2培养箱中培养24小时。
第2步：消化收集shGFP组和shHERVH组的HCT116细胞，计数后用DPBS重悬细胞，并调整细胞浓度为3×107/ml，随后用胰岛素针吸取100μl3×106细胞接种于裸鼠皮下。
第3步：接种一个星期之后，每隔一天测量肿瘤体积并绘制生长曲线，验证干扰HERVH后对肿瘤生长的影响。
分别接种干扰GFP和干扰HERV-H的HCT116细胞，经过裸鼠皮下成瘤实验，如图10所示，与对照组相比，干扰HERV-H的HCT116细胞的肿瘤体积较小，说明干扰HERV-H后，结直肠癌细胞HCT116的成瘤能力显著降低，这是在体外水平的基础上，从体内水平进一步证明了干扰HERV-H有望作为治疗结直肠癌的有效靶点。
实施例5
本实施例证实干扰HERV-H gag、pro和pol可抑制结直肠癌类器官的生长。
(1)材料和试剂：从中南大学湘雅三医院的结直肠癌病人的活检样本中获取新鲜的肿瘤组织。购买抗体CST Ki-67(8D5)mouse mAb(货号： 9449S)、CST E-Cadherin(24E10)Rabbit mAb(货号：3195S)。本实施例中所用到的试剂如表16所示。
表16实施例5的试剂
Figure GDA0003952700200000221
Figure GDA0003952700200000231
(2)实验步骤
1)构建结直肠癌类器官模型
收集新鲜的结直肠癌样本，肿瘤组织比例50％以上。采集后置于类器官保存液中，带回细胞间，立即开始处理，以保证组织新鲜。将新鲜的结直肠癌组织经过清洗、剪切成1mm3/块后，以200g的速度离心5min，去掉上清液。加入提前预热的胶原酶IV重悬并于37℃进行组织消化，每隔5分钟左右吹打几次，并于显微镜下观察消化程度，有单个细胞或者几个细胞团块出现可加入10ml Advanced DMEM/F-12(含10μM Y-27632)终止消化，随后通过60μm 滤网过筛，去掉一些大块组织和杂质。200g离心5min。用Advanced DMEM/F-12将基质胶稀释成70％，并重悬结直肠癌细胞，随后接种于提前一天预热的24孔板内，放入37℃5％CO2中让基质胶凝固，30分钟之后加入结直肠癌类器官培养基。
2)结直肠癌类器官传代
7-14天左右，器官长至直径100μM以上，此时按1：2-1：3的比例传代，加入TrypLE(含10μM Y-27632)37℃消化5分钟左右，并吹打类器官使其解离，加入10ml AdvancedDMEM/F-12(含10μM Y-27632)终止消化。4℃时200g离心5min。用70％基质胶重悬并接种至提前一天预热的24孔板内，放入37℃5％CO2中让基质胶凝固，30分钟之后加入结直肠癌类器官培养基。
3)结直肠癌类器官中敲低HERV-H
用含有10μM Y-27632的TrypLE对类器官进行消化，37℃孵育5分钟左右。随后用低吸附的枪头吹打类器官使其解离，加入10ml Advanced DMEM/F-12(含10μM Y-27632)终止消化。4℃时200g离心5min。吸取结直肠癌类器官培养基重悬细胞，接种于低吸附24孔培养板中，每孔加入终浓度为8μg/ml的polybrene，混匀。设置两个组，一组加入50μl含有shGFP的慢病毒，另一组加入含有50μl含有shHERVH的慢病毒。2000 rpm离心感染1小时后，放入37℃5％CO2的培养箱中孵育4小时。用 Advanced DMEM/F-12(含10μM Y-27632)重悬细胞，200g离心5min 后，用70％基质胶重悬并接种至提前一天预热的24孔板内。随后每隔一天拍摄并记录类器官生长情况，拍摄的图片,如图11的A-H所示。
4)结直肠癌类器官RNA原位杂交实验
首先去掉24孔板内类器官培养基，并用DPBS清洗一遍。每孔加入 500μl冷的细胞回收液，并将其置于4℃摇床，转速为60rpm，30-60分钟之后，基质胶溶解。用AdvancedDMEM/F-12(含10μM Y-27632)重悬细胞，200g离心5min。50μl Advanced DMEM/F-12(含10μMY-27632) 重悬类器官，并将类器官滴在预先用100μg/ml多聚赖氨酸处理的载玻片上。30min之后小心吸掉多余的液体，画上类器官的疏水圈。随后加入 200μl 4％多聚甲醛4℃固定45分钟。无RNA酶的DPBS清洗3次，0.5％ Triton X-100孵育10min。无RNA酶的DPBS清洗2次，Wash buffer A孵育5min。去掉Wash buffer A。加入50μl含有HERV-Hgag原位杂交探针探针的杂交缓冲液，盖上封口膜，并置于湿盒中，37℃孵育16小时。探针孵育完成后，去掉探针，加入200μl Wash buffer A 37℃孵育30min。随后DAPI染色30min，Wash buffer B清洗30min。清洗完之后进行封片。HERV-Hgag原位杂交探针为表17所示的序列。
表17HERV-H gag原位杂交探针
Probe Sequence(5'-3') ID
gggaaacaggcccttgaaaa SEQ ID NO.22
gtgtgagttgaagaggtttt SEQ ID NO.23
aagcatttaggttttaggtc SEQ ID NO.24
caagcggcattgcagaagaa SEQ ID NO.25
actgtcgagtttgtattggg SEQ ID NO.26
aaagtgccattttctggcta SEQ ID NO.27
tttagatcttgcaggatgga SEQ ID NO.28
ccatttgcctattttacgac SEQ ID NO.29
aaagaatgcctggacgtcag SEQ ID NO.30
gcacagagactaggaaggga SEQ ID NO.31
agatttgggacgagttgcac SEQ ID NO.32
gacaggtgggagggaaagaa SEQ ID NO.33
aagactaagcgacgcttggg SEQ ID NO.34
gatgggtctgtagaaatgga SEQ ID NO.35
cttgggaggaagggagaggt SEQ ID NO.36
aagaattgggacctagctcg SEQ ID NO.37
atagggtggagaagcagagg SEQ ID NO.38
gtgaggaggggaggtgataa SEQ ID NO.39
gggctagtcacggaacgaaa SEQ ID NO.40
aagagtaagttgctgggcag SEQ ID NO.41
cattaaccttgactatgcct SEQ ID NO.42
gagcctaaatgcttctgatt SEQ ID NO.43
catgaactgggctggatttt SEQ ID NO.44
taaagcatctcagggttgct SEQ ID NO.45
agaccttttagggtctaggg SEQ ID NO.46
tattgagaataagacggcct SEQ ID NO.47
taatgtcgggagcagattgg SEQ ID NO.48
ccagattccaattttcggag SEQ ID NO.49
taagtcctgttgtggggatt SEQ ID NO.50
gtacaccttgaagatgaggt SEQ ID NO.51
ggcaaggaattgcaactttt SEQ ID NO.52
ctggggtttgtctcagagtg SEQ ID NO.53
agttcttgtgtgctggagat SEQ ID NO.54
tgctgtggttcaggcatttg SEQ ID NO.55
gaggaggttctggaggaaag SEQ ID NO.56
cagatttccggcacatgtag SEQ ID NO.57
ttaggaggaatcctgggctg SEQ ID NO.58
aacagtccgattttcagtgg SEQ ID NO.59
gaaggagtcagtcagagagc SEQ ID NO.60
ccgctaagccaagaagatct SEQ ID NO.61
atcgggtagtgtcagtcttc SEQ ID NO.62
actctgagagttaccggaag SEQ ID NO.63
tgattaagaaggggacgggc SEQ ID NO.64
aggtaatgtggagtgggtag SEQ ID NO.65
鉴于HERV-H在人类基因组中有9866个拷贝，在进化过程中，由于突变、插入缺失等原因，每个拷贝的序列在长度、碱基序列组成等方面存在差异，为了精确检测其中高表达发挥主要作用的HERV-H，根据 RNA-seq，选择了结直肠癌细胞HCT116中高表达的拷贝chr1-HERVH-gag，根据SEQ ID NO.7所示的序列合成了表17中的HERV-Hgag原位杂交探针，合成的HERV-Hgag探针用于上述结直肠癌类器官RNA原位杂交实验。
5)结直肠癌类器官免疫荧光
首先去掉24孔板内类器官培养基，并用DPBS清洗一遍。每孔加入 500μl冷的细胞回收液，并将其置于4℃摇床，转速为60rpm，30-60分钟之后，基质胶溶解。随后经过4％多聚甲醛4℃固定45分钟；0.2％BSA 4℃封闭15分钟；一抗孵育过夜；4℃摇床清洗3次，2h/次；二抗封闭过夜，4℃摇床清洗1次清，2h/次；DAPI染色半小时，4℃摇床清洗2 次，2h/次；随后70g 4℃离心2分钟，甘油果糖重悬类器官，然后滴入提前两头用胶带垫高的载玻片上，胶带层数和类器官大小匹配，3层约60μM 左右，封片。最后用激光共聚焦显微镜拍图，如图11 F-H所示。
(3)结果和结论
图11A为培养结直肠癌病人来源的结直肠癌类器官的过程，本实施中取得肿瘤组织后，如图11A所示，经过消化后接种到基质胶中，培育出与体内肿瘤组织相似的保留了不同细胞异质性的三维组织结构，再分别干扰GFP和HERV-H后，测量体积，并进行固定染色比较对照组与处理组的差异。利用靶向HERV-H的特异探针进行荧光原位杂交后，如图 11B所示，荧光原位杂交实验检测shHERVH能有效减少HERV-Hgag的 RNA表达量；与对照组相比，如图11C-E所示，干扰HERV-H后，结直肠癌类器官的体积、数量都显著减少。如图11F-H所示，HERV-Hgag表达量降低后，使得结直肠癌类器官体积缩小的原因是抑制结直肠癌细胞增殖。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 中南大学湘雅医院
<120> 靶向HERV-H的物质在肿瘤疾病中的应用
<160> 65
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tccctggaga agagctacga 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
agcactgtgt tggcgtacag 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgctttaca gccctagacc 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtcgggagca gattgggtaa 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cccacagttg aggccagata 20
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tgagagggtg agagagacga 20
<210> 7
<211> 1332
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tgttctcaaa aacttaaaac ctcttcaact cacacctgac ctaaaaccta aatgcttatt 60
ttcttctgca atgccgcttg accccaatac aaactcgaca gtagttccaa atagccagaa 120
aatggcactt tgaatttttc catcctgcaa gatctaaata attcttgtcg taaaataggc 180
aaatggtctg aggtgcctga cgtccaggca ttcttttaca catcagtccc ttcctagtct 240
ctgtgcccag tgcaactcgt cccaaatctt ccttctttcc ctcccacctg tcccctcagt 300
accaacccca agcgtcgctt agtctttcta atcttccatt tctacagacc catctgacct 360
ctcccttcct cccaaggctg ctcctctccg ggccgagcta ggtcccaatt cttcctcagc 420
ctctgcttct ccaccctata atctttttat cacctcccct cctcacacct ggtccggctt 480
acagtttcgt tccgtgacta gccctccccg acctgcccag caacttactc ttaaaaaggt 540
ggctggagcc aaaggcatag tcaaggttaa tgctcctttt tctttatccc aaatcagaag 600
catttaggct ctttttcatc aaatataaaa atccagccca gttcatggct cgtttggcag 660
caaccctgag atgctttaca gccctagacc ctaaaaggtc taaaggccgt cttattctca 720
atatacattt tattacccaa tctgctcccg acattaaata aaactccgaa aattggaatc 780
tggccctcaa tccccacaac aggacttaat taacctcatc ttcaaggtgt acaataacag 840
aaaaaagttg caattccttg cctccactct gagacaaacc ccagccacat ctccagcaca 900
caagaacttc caaatgcctg aaccacagca gccaggcttt cctccagaac ctcctccccc 960
aggagcttgc tacatgtgcc ggaaatctgg ccactgggcc aaggaatgcc cgcagcccag 1020
gattcctcct aagccgcgtc ccatctgtgt gggaccccac tgaaaatcgg actgttcatc 1080
tcacctggca gccactccca gagcccctgg acctctggcc caaggctctc tgactgactc 1140
cttcccagat cttcttggct tagcggctga agactgacac tacccgatcg cctcggaagc 1200
cccctggacc atcacggatg ccgagcttcc ggtaactctc agagtggaag gtaagcccgt 1260
ccccttctta atcaatatgg aggctaccca ctccacatta ccttcttttc aagggcctgt 1320
ttcccttgcc tc 1332
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggtacaac agccacaacg tctatctcga gatagacgtt gtggctgttg tatttttg 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aattcaaaaa tacaacagcc acaacgtcta tctcgagata gacgttgtgg ctgttgta 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgggaggct acccactcca cattactcga gtaatgtgga gtgggtagcc tctttttg 58
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aattcaaaaa gaggctaccc actccacatt actcgagtaa tgtggagtgg gtagcctc 58
<210> 12
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccgggcaact cgtcccaaat cttccctcga gggaagattt gggacgagtt gctttttg 58
<210> 13
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aattcaaaaa gcaactcgtc ccaaatcttc cctcgaggga agatttggga cgagttgc 58
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cgcccttctt cccaatccaa 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
gccaaggagg gagtagaggt 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
uucuccgaac gugucacgut t 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
acgugacacg uucggagaat t 21
<210> 18
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
ggcuacccac uccacauuat t 21
<210> 19
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
uaauguggag uggguagccu c 21
<210> 20
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
aacucguccc aaaucuucct t 21
<210> 21
<211> 21
<212> DNA/RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
ggaagauuug ggacgaguug c 21
<210> 22
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
gggaaacagg cccttgaaaa 20
<210> 23
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
gtgtgagttg aagaggtttt 20
<210> 24
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
aagcatttag gttttaggtc 20
<210> 25
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
caagcggcat tgcagaagaa 20
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
actgtcgagt ttgtattggg 20
<210> 27
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
aaagtgccat tttctggcta 20
<210> 28
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
tttagatctt gcaggatgga 20
<210> 29
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 29
ccatttgcct attttacgac 20
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 30
aaagaatgcc tggacgtcag 20
<210> 31
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 31
gcacagagac taggaaggga 20
<210> 32
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
agatttggga cgagttgcac 20
<210> 33
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
gacaggtggg agggaaagaa 20
<210> 34
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
aagactaagc gacgcttggg 20
<210> 35
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
gatgggtctg tagaaatgga 20
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
cttgggagga agggagaggt 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
aagaattggg acctagctcg 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
atagggtgga gaagcagagg 20
<210> 39
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
gtgaggaggg gaggtgataa 20
<210> 40
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
gggctagtca cggaacgaaa 20
<210> 41
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
aagagtaagt tgctgggcag 20
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
cattaacctt gactatgcct 20
<210> 43
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 43
gagcctaaat gcttctgatt 20
<210> 44
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 44
catgaactgg gctggatttt 20
<210> 45
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 45
taaagcatct cagggttgct 20
<210> 46
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 46
agacctttta gggtctaggg 20
<210> 47
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 47
tattgagaat aagacggcct 20
<210> 48
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 48
taatgtcggg agcagattgg 20
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 49
ccagattcca attttcggag 20
<210> 50
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 50
taagtcctgt tgtggggatt 20
<210> 51
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 51
gtacaccttg aagatgaggt 20
<210> 52
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 52
ggcaaggaat tgcaactttt 20
<210> 53
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 53
ctggggtttg tctcagagtg 20
<210> 54
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 54
agttcttgtg tgctggagat 20
<210> 55
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 55
tgctgtggtt caggcatttg 20
<210> 56
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 56
gaggaggttc tggaggaaag 20
<210> 57
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 57
cagatttccg gcacatgtag 20
<210> 58
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 58
ttaggaggaa tcctgggctg 20
<210> 59
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 59
aacagtccga ttttcagtgg 20
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 60
gaaggagtca gtcagagagc 20
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 61
ccgctaagcc aagaagatct 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 62
atcgggtagt gtcagtcttc 20
<210> 63
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 63
actctgagag ttaccggaag 20
<210> 64
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 64
tgattaagaa ggggacgggc 20
<210> 65
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 65
aggtaatgtg gagtgggtag 20

Claims (5)

1.靶向HERV-Hgag和pro的物质在制备治疗肿瘤的药物中的用途；
所述的靶向HERV-H gag和pro的物质选自基于RNA干扰技术敲低HERV-H的表达的双链RNA；
所述的敲低HERV-H的表达水平的双链RNA为siRNA或shRNA；
所述肿瘤为结直肠癌。
2.如权利要求1所述的靶向HERV-H gag和pro的物质在制备治疗肿瘤的药物中的用途，其特征在于：所述靶向HERV-Hgag、pro的物质用于干扰或降低HERV-H的表达水平。
3.如权利要求1所述的靶向HERV-H gag和pro的物质在制备治疗肿瘤的药物中的用途，其特征在于：所述的siRNA包括siHERVH#1和siHERVH#2；所述siHERVH#1的正向序列如SEQID NO.18所示，反向序列如SEQ ID NO.19所示；
所述siHERVH#2的正向序列如SEQ ID NO.20所示，反向序列如SEQ ID NO.21所示。
4.如权利要求1所述的靶向HERV-H gag和pro的物质在制备治疗肿瘤的药物中的用途，其特征在于：所述的shRNA包括shHERVH#1和shHERVH#2；所述shHERVH#1的正向序列如SEQID NO.10所示，所述shHERVH#1的反向序列如SEQ ID NO.11所示；
所述shHERVH#2的正向序列如SEQ ID NO.12所示，所述shHERVH#2的反向序列如SEQ IDNO.13所示。
5.一种肿瘤药物的筛选方法，其特征是筛选抑制或降低HERV-H gag和pro靶点表达的物质；
所述抑制或降低HERV-H gag和pro靶点表达的物质选自基于RNA干扰技术敲低HERV-H的表达的双链RNA；
所述的敲低HERV-H的表达水平的双链RNA为siRNA或shRNA；
所述肿瘤为结直肠癌。
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Expression of young HERV-H loci in the course of colorectal carcinoma and correlation with molecular subtypes carcinoma and correlation with molecular subtypes;Philippe Pérot等;《Oncotarget》;20151023;第1-10页 *

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