CN107267440A - 适用于外泌体提取的提取试剂及应用及其提取方法 - Google Patents

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
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    • C12N5/0602—Vertebrate cells
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Abstract

本发明公开了一种适用于外泌体提取的提取试剂，所述提取试剂包括如下配方：二硫苏糖醇、氯化钾、柠檬酸钾、甲酸钠、血清白蛋白、甘氨酸、硫氰酸胍；以上配方配制成的提取试剂的pH值为3.0‑5.5；提取方法，包括以下步骤：a、将体液样品通过离心机离心，取其上清液；b、将提取试剂加入步骤a所得到的上清液中，反应2小时后，再通过离心机离心；c、取步骤b得到的外泌体沉降物，然后用PBS进行外泌体沉降物悬浮重溶解得到外泌体。本发明提取外泌体的操作简单，耗时短，简化操作规程，节约成本，使体液活检的临床常规化成为可能。

Description

适用于外泌体提取的提取试剂及应用及其提取方法
技术领域
本发明涉及临床医学领域，尤其涉及到一种适用于外泌体提取的提取试剂及应用及其提取方法。
背景技术
外泌体(Exosome)是从体液(尿液、血液、唾液、腹水、胸腹水等)和细胞液中快速提取的，其是活细胞分泌到胞外的囊泡样小体，含有多种蛋白和核酸分子(DNA、RNA、以及miRNA)，在体内细胞间物质和信号转导中起到重要作用。由于这些核酸被囊膜包裹而被保护，稳定性高，不易降解，是一种用于肿瘤诊断和预后监测的非常理想的新型生物标记物癌症的早期诊断、用药监控、预后判断。
近年来，随着人们对外泌体的研究和认识加深，外泌体检测作为一种新型的液体活检热点技术已被许多临床科研机构广泛地应用于肿瘤和疾病的无创诊断、治疗和监测；如何高效地提取外泌体是实现这项新兴液体活检技术临床常规化应用的关键。
目前外泌体提取的标准依然是超速离心法；方法十分复杂繁琐,耗时长，以提取尿液中的外泌体为例，每次至少需要200毫升的尿液量，并通过超速离心(120000g/分钟)20小时以上才能获得足够的外泌体量，同时对超速离心机的设备要求以及操作程序的培训大大提高了提取成本，无法实现临床的常规化应用。由于国内有关外泌体提取试剂的缺乏，我国对外泌体的研究还基本依赖于过程繁琐的超速离心和进口提取试剂盒，因此也严重阻碍了我国在外泌体的研究和临床应用上的发展。
专利申请号为201610597323.2，名称为一种人体体液中外泌体的提取方法，包括以下步骤：体液样本制备：首先在无菌条件下提取人体体液，并用PBS缓冲液进行稀释，然后通过离心筛选初步去除体液中的细胞成分和细胞碎片，制成体液样本备用；体液样本纯化：通过过滤膜对上述体液样本进行过滤，进一步去除体液中的细胞残片及其他杂质，静置10～15分钟，留取沉淀物备用；外泌体提取：将上述沉淀物用PBS缓冲液进行悬浮，使外泌体悬浮于液体上层，然后用无菌针管吸取上层含有外泌体的液体，置于80℃储存备用。此提取方法条件复杂，成本高，上述专利申请利用静置不太可能把外泌体沉降下来；本申请是根据外泌体表面的特异生物化学特性通过提取试剂的特异配方把外泌体从水相中沉降下来。
专利申请号为201610022096.0，名称为一种人尿液来源细胞的外泌体的获取方法，是首先分离培养人尿液来源细胞并收集培养基，将人尿液来源细胞的培养基通过0.22微米滤膜过滤，以去除大的细胞残片以及其它杂质；然后离心除去细胞器，留取上清；再使用可截留100KD分子量的膜，通过离心截留上清中的外泌体，截留完成后，使用PBS对膜进行洗脱即得到外泌体浓缩液；上述专利申请利用分离培养人尿液来源细胞并收集培养基来进行体外培养，而本申请是直接把外泌体从尿液中沉降下来，无须分离培养人尿液来源细胞并收集培养基。
专利申请号为201610021424.5，名称为一种血清外泌体中RNA的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：1)提取血清中的外泌体；2)在超声的作用下使用RNA提取试剂裂解步骤1)中提取的外泌体；3)使用氯仿分离步骤2)中裂解后的外泌体的RNA至水相；4)使用异丙醇沉淀步骤3)得到的水相中的RNA；5)使用乙醇洗涤步骤4)中沉淀的RNA，之后再次溶解RNA，即得所述血清外泌体中的RNA。上述专利申请利是有关从外泌体中提取RNA；本申请是从各种体液包括血液中直接分离外泌体，不涉及外泌体中RNA的提取。
发明内容
本发明的目的在于克服上述现有技术中的不足之处而提供一种成本低、操作方便的适用于外泌体提取的提取试剂及其提取方法。
本发明是通过如下方式实现的：
适用于外泌体提取的提取试剂，其特征在于：所述提取试剂包括如下配方：0.01-0.5mM的二硫苏糖醇、10-50mM的氯化钾、0.05-0.5mM的柠檬酸钾、0.1-1M的甲酸钠、0.15uM-3uM的血清白蛋白、0.01-1mM的甘氨酸、0.4mM-2.5mM的硫氰酸胍，以上配方配制成的提取试剂的pH值为3.0-5.5。
一种适用于外泌体提取的提取试剂的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：a、将体液样品通过离心机离心5-15分钟，取其上清液；b、将提取试剂加入步骤a所得到的上清液中，反应2小时后，再通过离心机离心5-10分钟，所述提取试剂与上清液的体积比为1：2-20；c、取步骤b得到的外泌体沉降物，然后用PBS进行外泌体沉降物悬浮重溶解得到外泌体。
进一步地，提取试剂在尿液、血液、唾液、腹水、胸腹水以及细胞培养液中外泌体的应用。
本发明的有益效果在于：每次只需要通过普通离心2小时就可以完成外泌体提取过程,同时由于无需超速离心机，每次可以同时提取6个以上样品，大大简化操作规程,节约成本,使体液活检的临床常规化体成为可能，提取的外泌体保持其本身生物学活性。
附图说明
图1本发明流程示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施例，并结合附图，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施方式并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
实施例：
一种适用于外泌体提取的提取试剂，其特征在于：所述提取试剂包括如下配方：0.01-0.5mM的二硫苏糖醇、10-50mM的氯化钾、0.05-0.5mM的柠檬酸钾、0.1-1M的甲酸钠、0.15uM-3uM的血清白蛋白、0.01-1mM的甘氨酸、0.4mM-2.5mM的硫氰酸胍，以上配方配制成的提取试剂的pH值为3.0-5.5。
如图1所示，一种适用于外泌体提取的提取试剂的提取方法，包括以下步骤：a、将体液样品通过离心机离心5-15分钟，取其上清液；b、将提取试剂加入步骤a所得到的上清液中，反应2小时后，再通过离心机离心5-10分钟，所述提取试剂与上清液的体积比为1：2-20；
c、取步骤b得到的外泌体沉降物，然后用PBS进行外泌体沉降物悬浮重溶解得到外泌体，即可进行相关的研究。
本发明的提取试剂在各种体液(尿液、血液、唾液、腹水、胸腹水等)以及细胞培养液中外泌体的应用
本发明通过简单的常规离心条件(10000g/分钟)把体液中的外泌体从水溶液中分离出来，并保持生物学活性。
传统超速离心法与本提取方法的对比情况如下表：
通过对比可以得知：本提取方法每次只需要通过普通离心2小时就可以完成外泌体提取过程,同时由于无需超速离心机，每次可以同时提取6个以上样品，大大简化操作规程,节约成本,使体液活检的临床常规化体成为可能，提取的外泌体保持其本身生物学活性。
以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (3)

1.适用于外泌体提取的提取试剂，其特征在于：所述提取试剂包括如下配方：0.01-0.5mM的二硫苏糖醇、10-50mM的氯化钾、0.05-0.5mM的柠檬酸钾、0.1-1M的甲酸钠、0.15uM-3uM的血清白蛋白、0.01-1mM的甘氨酸、0.4mM-2.5mM的硫氰酸胍，以上配方配制成的提取试剂的pH值为3.0-5.5。
2.一种如权利要求1所述的适用于外泌体提取的提取试剂的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：a、将体液样品通过离心机离心5-15分钟，取其上清液；
b、将提取试剂加入步骤a所得到的上清液中，反应2小时后，再通过离心机离心5-10分钟，所述提取试剂与上清液的体积比为1：2-20；
c、取步骤b得到的外泌体沉降物，然后用PBS进行外泌体沉降物悬浮重溶解得到外泌体。
3.根据权利要求1所述的提取试剂在尿液、血液、唾液、腹水、胸腹水以及细胞培养液中外泌体的应用。
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