CN113215075A - 一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；所述试剂A为浓度为35‑45g/mL的PEG 6000和/或PEG 8000水溶液；所述试剂B为浓度为1‑10％的磁性微粒溶液；所述试剂C为浓度为20‑100μg/mL的抗体溶液，其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种以上；所述试剂D为浓度为0.05‑1％Tween 20的磷酸盐缓冲液。本发明所述试剂盒、使用方法及应用可以高效地获得高纯度的外泌体，排除了杂蛋白等物质的影响，具有简便、稳定、纯度高、易操作、分析蛋白质成分的可靠性强等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法。
背景技术
外泌体(exosomes)是一种由多种细胞所分泌的、直径为30-140nm的亚细胞囊泡结构，电子显微镜下呈球状或杯状。外泌体源于细胞内的早期胞内体(early endosome)，胞内体向内出芽形成多囊泡胞内体(mμltivesicμlar endosome)，后者与细胞膜融合从而将小囊泡释放到细胞外，形成外泌体。外泌体的组分分析表明，外泌体中包含大量的蛋白质、核酸和脂质等，其中一部分是所有外泌体所共有的普遍性成分，其余则是因外泌体来源组织不同而特有的组分。无论是哪种组分，在外泌体介导的细胞间物质、信息交流的过程中均起到关键作用。研究发现，外泌体内含有与细胞来源相关的蛋白质、RNA和mRNA，并且外泌体能够通过生物屏障，在细胞间传递功能性核酸分子，从而发挥各种生物学功能，故外泌体有望成为一种新型给药途径及基因治疗载体。目前，外泌体在临床医学中有着十分光明的应用前景，因为它们含有丰富的生物标志物，可用于监测临床状态、诊断疾病、治疗反应、疾病进展等。
目前外泌体提取试剂盒的产品，主要存在的问题包括纯度低、耗时长、样本耗用量大等缺陷。外泌体纯化手段通常为超速离心法和密度梯度离心法，这两种方式因所提取的囊泡数量较多而广受欢迎，但其提取过程比较费时，对仪器设备要求高(需要超速离心机)且回收率不稳定，纯度也得不到保证。而色谱法则是利用根据凝胶孔隙的孔径大小与样品分子尺寸的相对关系而对溶质进行分离的分析方法。但是考虑到所需使用设备的特殊性，无法实现广泛地应用。
发明内容
鉴于上述问题，本发明提供一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法。本发明所述试剂盒包括所述提取试剂，其中应用多聚物盐溶液沉淀法提取细胞上清中的外泌体。本发明所述试剂盒、使用方法及应用可以高效地获得高纯度的外泌体，排除了杂蛋白等物质的影响，具有简便、稳定、纯度高、易操作、分析蛋白质成分的可靠性强等特点。
用于实现上述目的的技术方案如下：
本发明提供一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A为浓度为35-45g/mL的PEG 6000和/或PEG 8000水溶液；
所述试剂B为浓度为1-10％的磁性微粒溶液；
所述试剂C为浓度为20-100μg/mL的抗体溶液，其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种以上；
所述试剂D为浓度为0.05-1％Tween 20的磷酸盐缓冲液。
在一个实施方案中，本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒还包括试剂E和试剂F；
其中，所述试剂E选自甘氨酸溶液、冰乙酸溶液和柠檬酸溶液中的一种或两种以上；所述试剂F为Tris溶液和/或柠檬酸溶液。
在一个实施方案中，本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水与PEG 6000和/或PEG 8000混合，使所述试剂A的浓度为35-45g/mL，然后进行除菌处理；优选地，所述试剂A的浓度为40g/mL；
优选地，所述磁性微粒溶液为Protein A/G磁性微粒溶液；
优选地，所述试剂C的配制步骤为：将去离子水和抗体混合，使所得到的抗体溶液浓度为20-100μg/mL，然后进行除菌处理；其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种；
优选地，所述试剂D的配制步骤为：将PBS和Tween 20混合，至Tween 20的终浓度为0.05-1％；其中所述PBS的制备方法为：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；优选地，所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
优选地，所述试剂E选自浓度为0.1-1mol/L的甘氨酸溶液、浓度为0.2-1.8mol/L的冰乙酸溶液和浓度为0.05-1mol/L的柠檬酸溶液中的一种或两种以上；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液和/或0.05-1mol/L柠檬酸溶液；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液。
在一个实施方案中，本发明还提供一种根据本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基来培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液20-30mL在温度为3-5℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为3-5℃下静置1-3h，后在温度为3-5℃、离心力为8000-12000g下离心25-35min，取沉淀物；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS0.5-2ml进行重悬；
(6)取所述试剂B10-50μl，分离2-3min，得到第一沉淀物；将该第一与所述步骤(1)得到的PBS 0.5-1.5ml混合均匀，分离2-3min，得到第二沉淀物；将该第二沉淀物与所述步骤(1)得到的PBS 0.5-1.5ml混合均匀，分离2-3min，得到沉淀物，于3-5℃下保存；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂C 500-1000μl混合，在室温下保持1.5-2.5h，分离，得到第三沉淀物；将该第三沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(5)得到的重悬液与所述步骤(7)得到的沉淀物旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(9)将所述步骤(8)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，得到沉淀物；
(10)将所述步骤(9)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，该方法还包括步骤(11)：将所述步骤(10)得到的所述外泌体与所述试剂E45-55μl旋转混合5-15min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7-8μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(10)得到的所述外泌体的提取效果验证。
在一个实施方案中，本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；其中所述胎牛血清不含所述外泌体；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液25mL在温度为4℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为4℃下静置2h，后在温度为4℃、离心力为10000g下离心30min，取沉淀物；其中所述滤膜为0.22μm或0.45μm；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS0.5-2ml进行重悬；
(6)取所述试剂B10-50μl，分离2-3min，得到第一沉淀物；将该第一与所述步骤(1)得到的PBS 1ml混合均匀，分离2-3min，得到第二沉淀物；将该第二沉淀物与所述步骤(1)得到的PBS 1ml混合均匀，分离2-3min，得到沉淀物，于4℃下保存；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂C 500-1000μl混合，在室温下保持2h，分离，得到第三沉淀物；将该第三沉淀物与所述试剂D500μl旋转混合5min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(5)得到的重悬液与所述步骤(7)得到的沉淀物旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(9)将所述步骤(8)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，得到沉淀物；
(10)将所述步骤(9)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，该方法还包括步骤(11)：将所述步骤(10)得到的所述外泌体与所述试剂E50μl旋转混合10min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7.5μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(10)得到的所述外泌体的提取效果验证。
在一个实施方案中，本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法中，所述步骤(2)中，当所述细胞生长至密度大于1×104-1×106/mL时，使用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基稀释所述细胞至密度为1×104-1×106/mL；优选地，所述步骤(2)中，所述胎牛血清不含所述外泌体。
在一个实施方案中，本发明又提供一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂D和试剂G；
其中，所述试剂A为浓度为35-45g/mL的PEG 6000和/或PEG 8000水溶液；
所述试剂D为浓度为0.05-1％Tween 20的磷酸盐缓冲液；
所述试剂G为浓度为0.5-10％的包被有抗体的磁性微粒溶液，其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种以上；优选地，所述磁性微粒为Protein A/G磁性微粒；
优选地，所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，其中所述试剂E选自甘氨酸溶液、冰乙酸溶液和柠檬酸溶液中的一种或两种以上；所述试剂F为Tris溶液和/或柠檬酸溶液。
在一个实施方案中，本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水与PEG 6000和/或PEG 8000混合，使所述试剂A的浓度为35-45g/mL，然后进行除菌处理；优选地，所述试剂A的浓度为40g/mL；
优选地，所述试剂D的配制步骤为：将PBS和Tween 20混合，至Tween 20的终浓度为0.05-1％；其中所述PBS的制备方法为：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；优选地，所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
优选地，所述试剂E选自浓度为0.1-1mol/L的甘氨酸溶液、浓度为0.2-1.8mol/L的冰乙酸溶液和浓度为0.05-1mol/L的柠檬酸溶液中的一种或两种以上；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液和/或0.05-1mol/L柠檬酸溶液；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液；
优选地，所述试剂G的配制步骤为：取浓度为1-10％的磁性微粒溶液10-50μl，分离2-3min，弃上清液，得到第一溶液；将所述第一溶液和1mL PBS混合，分离2-3min，弃上清，得到第二溶液；将所述第二溶液和1mL PBS混合，分离2-3min，弃上清，得到第三溶液；将所述第三溶液与500-1000μl抗体溶液混合，反应1-3h，分离，弃上清，得到试剂G；
其中，所述抗体溶液的配制步骤为：将去离子水和抗体混合，使所得到的抗体溶液浓度为20-100μg/mL，然后进行除菌处理；其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种以上；
所述PBS的制备方法为：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1gKH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；优选地，所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L。
在一个实施方案中，本发明又提供一种根据本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基来培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液20-30mL在温度为3-5℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为3-5℃下静置1-3h，后在温度为3-5℃、离心力为8000-12000g下离心25-35min，取沉淀物；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS0.5-2ml进行重悬；
(6)将步骤(5)得到的重悬液与所述试剂G 0.5-2ml旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(7)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，该方法还包括步骤(9)：将所述步骤(8)得到的所述外泌体与所述试剂E45-55μl旋转混合5-15min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7-8μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(8)得到的所述外泌体的提取效果验证。
在一个实施方案中，本发明所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基来培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；其中所述胎牛血清不含所述外泌体；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液25mL在温度为4℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为4℃下静置2h，后在温度为4℃、离心力为10000g下离心30min，取沉淀物；其中所述滤膜为0.22μm或0.45μm；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS0.5-2ml进行重悬；
(6)将步骤(5)得到的重悬液与所述试剂G 0.5-2ml旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(7)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，该方法还包括步骤(9)：将所述步骤(8)得到的所述外泌体与所述试剂E50μl旋转混合10min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7.5μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(8)得到的所述外泌体的提取效果验证；
优选地，所述步骤(2)中，当所述细胞生长至密度大于1×104-1×106/mL时，使用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基稀释所述细胞至密度为1×104-1×106/mL；优选地，所述步骤(2)中，所述胎牛血清不含所述外泌体。
本发明还提供一种本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒以及本发明所述试剂盒的使用方法在从细胞上清液中分离所述外泌体中的应用。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法的有益效果：本发明所述试剂盒包括所述提取试剂，应用多聚物盐溶液沉淀法提取细胞上清中的外泌体，所述该试剂盒无需超速离心，4-5个小时即可完成从细胞培养上清中提取高纯度的外泌体，并排除了杂蛋白等物质的影响，具有简便、稳定、纯度高、易操作、分析蛋白质成分的可靠性强等特点。
附图说明
以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1示出了在本发明实施例13中使用标志物CD9单抗和GAPDH单抗对本发明提取的外泌体进行Wb验证的结果；
图2示出了在本发明实施例13中对本发明提取的外泌体进行电镜验证所得到的电镜图；
图3示出了在本发明实施例13中对本发明提取的外泌体进行NTA验证所得到的颗粒直径分布图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等，如无特殊说明，均为市售购买产品。
实施例1：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水和PEG 6000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为35g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水和抗体CD63混合，使所得到的抗体CD63溶液的浓度为20μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将PBS和0.05％Tween 20混合；其中所述PBS的制备方法为：将7g NaCl、0.1g KCl、1g Na2HPO4和0.2g KH2PO4混合，加水至0.7L；
本发明所述试剂盒还可以包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为0.1mol/L Tris溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将7g NaCl、0.1g KCl、1g Na2HPO4和0.2g KH2PO4混合，加水至0.7L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；
(3)收集步骤(2)得到的细胞液20mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于3℃下1000g离心10min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为5％，然后于3℃下静置1h，然后于3℃下8000g离心25min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干5min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS0.5ml进行重悬；
(7)将所述试剂B10μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 0.5ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 0.5ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，于3℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C 500μl，在室温下保持反应1.5h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 450μl，然后用旋转混合仪混合4min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育1h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 450μl，然后用旋转混合仪混合4min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 450μl，然后用旋转混合仪混合4min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 45μl，然后用旋转混合仪混合5min，然后添加所述试剂F 7μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例2：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂D和试剂G；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水和PEG 6000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为35g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将PBS和0.05％Tween 20混合；其中所述PBS的制备方法为：将7g NaCl、0.1g KCl、1g Na2HPO4和0.2g KH2PO4混合，加水至0.7L；
所述试剂G为浓度为0.5-10％的包被有CD63的磁性微粒溶液，该试剂G的配制步骤为：取浓度为1％的磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液10μl，分离2min，弃上清液，得到第一溶液；将所述第一溶液和1mL PBS混合，分离2min，弃上清，得到第二溶液；将所述第二溶液和1mL PBS混合，分离2min，弃上清，得到第三溶液；将所述第三溶液与500μl CD63溶液混合，反应1h，分离，弃上清，得到所述试剂G；
其中，所述抗体溶液的配制步骤为：将去离子水和CD63混合，使所得到的CD63溶液浓度为20μg/mL，然后进行除菌处理；
所述PBS的制备方法为：将7g NaCl、0.1g KCl、1g Na2HPO4和0.2g KH2PO4混合，加水至0.7L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为0.1mol/L Tris溶液；
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将7g NaCl、0.1g KCl、1g Na2HPO4和0.2g KH2PO4混合，加水至0.7L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；
(3)收集步骤(2)得到的细胞液20mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于3℃下1000g离心10min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为5％，然后于3℃下静置1h，然后于3℃下8000g离心25min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干5min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS0.5ml进行重悬；
(7)将步骤(6)得到的重悬液与所述试剂G 0.5ml旋转混合，并于温度为37℃下温育1h，分离，得到沉淀物；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂D 450μl，然后用旋转混合仪混合4min，磁性分离，取沉淀物；
(9)向所述步骤(8)得到的沉淀物中添加所述试剂D 450μl，然后用旋转混合仪混合4min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(10)向所述步骤(9)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 45μl，然后用旋转混合仪混合5min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(9)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例3：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水和PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为45g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水和抗体CD81混合，使所得到的抗体CD81溶液的浓度为100μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将PBS和1％Tween 20混合；其中所述PBS的制备方法为：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
本发明所述试剂盒还可以包括试剂E和试剂F，所述试剂E为1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为1mol/L Tris溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有20％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液30mL添加至45mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于5℃下1000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.45μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为20％，然后于5℃下静置3h，然后于5℃下12000g离心35min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS2ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至5mL的离心管中，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1.5ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1.5ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于5℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2.5h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 550μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 550μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 550μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 55μl，然后用旋转混合仪混合15min，然后添加所述试剂F 8μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例4：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂D和试剂G；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水和PEG 6000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为45g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将PBS和1％Tween 20混合；其中所述PBS的制备方法为：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
所述试剂G为浓度为0.5-10％的包被有CD81的磁性微粒溶液，该试剂G的配制步骤为：取浓度为10％的磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液50μl，分离3min，弃上清液，得到第一溶液；将所述第一溶液和1mL PBS混合，分离3min，弃上清，得到第二溶液；将所述第二溶液和1mL PBS混合，分离3min，弃上清，得到第三溶液；将所述第三溶液与1000μl CD81溶液混合，反应3h，分离，弃上清，得到所述试剂G；
其中，所述抗体溶液的配制步骤为：将去离子水和CD81混合，使所得到的CD81溶液浓度为100μg/mL，然后进行除菌处理；
所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
本发明所述试剂盒还可以包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为0.1mol/L Tris溶液；
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
(2)用含有20％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；
(3)收集步骤(2)得到的细胞液30mL添加至45mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于5℃下1000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.45μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为20％，然后于5℃下静置3h，然后于5℃下12000g离心35min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS2ml进行重悬；
(7)将步骤(6)得到的重悬液与所述试剂G 2ml旋转混合，并于温度为37℃下温育12h，分离，得到沉淀物；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂D 550μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)向所述步骤(8)得到的沉淀物中添加所述试剂D 550μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(10)向所述步骤(9)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 55μl，然后用旋转混合仪混合15min，然后添加所述试剂F 8μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(9)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例5：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水、PEG 6000和PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水、抗体CD81和抗体CD9混合，使所得到的抗体溶液的浓度为80μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
本发明所述试剂盒还可以包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.2mol/L冰乙酸溶液；所述试剂F为1mol/L柠檬酸溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下2000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为15％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS1ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于4℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，然后添加所述试剂F 7.5μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例6：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂D和试剂G；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水和PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将PBS和1％Tween 20混合；其中所述PBS的制备方法为：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
所述试剂G为浓度为0.5-10％的包被有CD9的磁性微粒溶液，该试剂G的配制步骤为：取浓度为10％的磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液50μl，分离3min，弃上清液，得到第一溶液；将所述第一溶液和1mL PBS混合，分离3min，弃上清，得到第二溶液；将所述第二溶液和1mL PBS混合，分离3min，弃上清，得到第三溶液；将所述第三溶液与1000μl CD9溶液混合，反应3h，分离，弃上清，得到所述试剂G；
其中，所述抗体溶液的配制步骤为：将去离子水和CD9混合，使所得到的CD9溶液浓度为100μg/mL，然后进行除菌处理；
所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.2mol/L的冰乙酸溶液；所述试剂F为1mol/L Tris溶液；
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
(2)用含有20％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至40mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下1000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.45μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为20％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS2ml进行重悬；
(7)将步骤(6)得到的重悬液与所述试剂G 2ml旋转混合，并于温度为37℃下温育12h，分离，得到沉淀物；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(9)向所述步骤(8)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(10)向所述步骤(9)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 8μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(9)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例7：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水、PEG 6000和PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水和抗体CD9混合，使所得到的抗体溶液的浓度为100μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.2mol/L冰乙酸溶液；所述试剂F为0.05mol/L柠檬酸溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下2000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为15％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS1ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于4℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，然后添加所述试剂F 7.5μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例8：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C、试剂D、试剂E和试剂F；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水、PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水、抗体CD63和抗体CD9混合，使所得到的抗体溶液的浓度为80μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.2mol/L冰乙酸溶液；所述试剂F为0.1mol/L Tris溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下2000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为15％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS1ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于4℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，然后添加所述试剂F 7.5μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例9：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水、PEG 6000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水和抗体CD9混合，使所得到的抗体溶液的浓度为80μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为0.05mol/L柠檬酸溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下2000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为15％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS1ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于4℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，然后添加所述试剂F 7.5μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例10：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水、PEG 6000和PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水、抗体CD63和抗体CD9混合，使所得到的抗体溶液的浓度为80μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为1.8mol/L冰乙酸溶液和0.1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为0.05mol/L Tris溶液和1mol/L柠檬酸溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下2000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为15％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS1ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于4℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，然后添加所述试剂F 7.5μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例11：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水、PEG 6000和PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水、抗体CD81和抗体CD9混合，使所得到的抗体溶液的浓度为80μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为1.8mol/L冰乙酸溶液和0.1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为0.05mol/L Tris溶液和1mol/L柠檬酸溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下2000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为15％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS1ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于4℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，然后添加所述试剂F 7.5μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例12：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法
本发明所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水和PEG 8000(蛋白沉淀剂)混合，使所述试剂A的浓度为40g/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂B为磁性微粒Protein A/G(BeaverBeadsTM，编号为22202-100)溶液；
所述试剂C的配制步骤为：将去离子水、抗体CD63和抗体CD81混合，使所得到的抗体溶液的浓度为80μg/mL，然后进行除菌处理；
所述试剂D的配制步骤为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，所述试剂E为0.2mol/L冰乙酸溶液和1mol/L甘氨酸溶液；所述试剂F为1mol/L Tris溶液和0.05mol/L柠檬酸溶液。
本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将9g NaCl、0.3g KCl、2g Na2HPO4和1g KH2PO4混合，加水至1.5L；
(2)用含有10％胎牛血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL；其中，为了避免DMEM培养基中的胎牛血清中自带外泌体的干扰，优选所使用的DMEM培养基中的胎牛血清不含外泌体，或者优选所使用的DMEM培养基中不含血清。
(3)收集步骤(2)得到的细胞液25mL添加至50mL的离心管(或者使用其他规格的离心管)中；
(4)于4℃下2000g离心20min，丢弃沉淀物，取上清液；
(5)将步骤(4)得到的上清液经0.22μm滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至终浓度为15％，然后于4℃下静置2h，然后于4℃下10000g离心30min，取沉淀物；
(6)将所述步骤(5)得到的沉淀物风干10min，然后使用所述步骤(1)得到的PBS1ml进行重悬；
(7)将所述试剂B 50μl添加至4mL的离心管中，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物，然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离2min，丢弃上清液，取沉淀物；然后向该沉淀物中添加所述步骤(1)得到的PBS 1ml，轻轻振摇混合均匀，磁性分离3min，丢弃上清液，取沉淀物，于4℃下保存备用；
(8)向所述步骤(7)得到的沉淀物中添加所述试剂C1000μl，在室温下保持反应2h，磁性分离后取沉淀物，向该沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合6min，磁性分离，取沉淀物；
(9)将所述步骤(6)得到的重悬液添加至所述步骤(8)得到的沉淀物中，用旋转混合仪混合，并于温度为37℃下温育2h，磁性分离，取沉淀物；
(10)向所述步骤(9)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物；
(11)向所述步骤(10)得到的沉淀物中添加所述试剂D 500μl，然后用旋转混合仪混合5min，磁性分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
(12)向所述步骤(11)得到的所述外泌体中添加所述试剂E 50μl，然后用旋转混合仪混合10min，然后添加所述试剂F 7.5μl，磁性分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(11)得到的所述外泌体的提取效果的WB试验、电镜试验、NTA或RNA的验证。
实施例13：本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法的效果
验证试验
一、通过WB试验来验证本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的效果
1、试剂准备
试剂：RIPA强蛋白裂解液(购自碧云天生物技术研究所)、蛋白酶抑制剂PMSF(购自碧云天生物技术研究所)，Marker(够自thermo Fisher)，WB实验所需试剂耗材(均购自碧云天生物技术研究所)。
2、外泌体样本处理
将样品(10μL)和2×上样缓冲液(20μL)混合，得到混合物，将该混合物经沸水煮5min，用移液枪慢慢将20μL该混合物加至样品槽中，然后添加预染的标准蛋白10μL。
3、WB实验的验证结果
Hela细胞培养基提取外泌体样本后进行WB验证检测结果
附图1中所示的上样量说明：从左到右第一条带，上样量为2μg，第二条带上样量为4μg；
为了验证本发明所述从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒是否提取到所述外泌体，使用标志物CD9单抗(抗体使用比例1:2000)和GAPDH(抗体使用比例1:10000)单抗进行WB验证，结果显示：使用CD9抗体在24KD位置出现目的带，使用GAPDH抗体在36KD位置出现目的带，这代表提取物中含有囊泡标志物CD9蛋白。
二、Hela细胞培养基提取外泌体样本后进行电镜和NTA的验证结果
验证结果说明：a、本发明所述外泌体一般指30-150nm的细胞外囊泡，请参考附图2中的标尺；b、附图2中的所述外泌体，具有明显的立体膜结构，呈现茶托样则表明效果很好；
附图3中横坐标为粒径大小(nm)，纵坐标为浓度(个/ml)，(E7代表107个/ml)；
上述验证结果说明：D10:61.5nm、D50:100.7nm、D90:146.7nm分别表示Hela细胞培养基提取的外泌体样本中囊泡粒径范围在61.5nm、100.7nm、146.7nm以下的分别为10％、50％、90％；浓度为2.74*109个/ml。
结论：如附图2所示，经过本发明所述试剂盒提取外泌体，可以快速获得粒径为30-150nm的外泌体，便于下游的蛋白质成分的分析。
三、本发明所述试剂盒提取的外泌体的提取效果的RNA验证
1、RNA提取步骤
1)所述外泌体使用1mL TRIzol吹打均匀(100μl外泌体对应1ml TRIZOL)；
2)向步骤(1)得到的混合物中添加200μl氯仿，剧烈震荡，静置10min；
3)将步骤(2)得到的混合物在10000rpm、4℃下离心10min，吸取上层水相；
4)向步骤(3)得到的分离的水相中加入等体积的异丙醇，静置20min；
5)将步骤(4)得到的混合物在10000rpm、4℃下离心10min，移去液体，保留沉淀物；
6)向步骤(5)得到的沉淀物中添加1mL预冷的75％乙醇，轻弹离心管底部；
7)将步骤(6)得到的混合物在10000rpm、4℃下离心10min移去液体，保留沉淀物；
8)将步骤(7)得到的沉淀物风干5-10min；
9)将步骤(8)中风干后的沉淀物中添加10μl RNase-free ddH2O；
10)用NanoDrop检测步骤(8)中得到的RNA的浓度。
2、反转录步骤：参考TOYOBO公司的FSQ-101试剂盒方法；
3、qPCR步骤：参考TaKaRa公司的TB GreenTM Premix Ex TaqII(Tli RNaseHplus)；
4、反转录以及qPCR引物
表1：
(1)经Hela细胞培养基提取的外泌体样本后进行qPCR验证结果
表2
上述验证结果说明：为了验证本发明所述试剂盒的提取方法对外泌体RNA中含有的miRNA情况，使用不同的miRNA引物进行qPCR检测。结果如表1和表2所示，本发明所述试剂盒的提取物中含有多种miRNA，且不同的miRNA含量是在外泌体里面是有差异的。说明采用本发明的试剂盒可以很好地从细胞培养物中提取外泌体组分，用于后续的科学研究。
总之，以上对本发明具体实施方式的描述并不限制本发明，本领域技术人员可以根据本发明作出各种改变或变形，只要不脱离本发明的精神，均应属于本发明所附权利要求的范围。
Claims (11)
1.一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、试剂C和试剂D；
其中，所述试剂A为浓度为35-45g/mL的PEG 6000和/或PEG 8000水溶液；
所述试剂B为浓度为1-10％的磁性微粒溶液；
所述试剂C为浓度为20-100μg/mL的抗体溶液，其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种以上；
所述试剂D为浓度为0.05-1％Tween 20的磷酸盐缓冲液。
2.根据权利要求1所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括试剂E和试剂F；
其中，所述试剂E选自甘氨酸溶液、冰乙酸溶液和柠檬酸溶液中的一种或两种以上；所述试剂F为Tris溶液和/或柠檬酸溶液。
3.根据权利要求1或2所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，其特征在于，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水与PEG 6000和/或PEG 8000混合，使所述试剂A的浓度为35-45g/mL，然后进行除菌处理；优选地，所述试剂A的浓度为40g/mL；
优选地，所述磁性微粒溶液为Protein A/G磁性微粒溶液；
优选地，所述试剂C的配制步骤为：将去离子水和抗体混合，使所得到的抗体溶液浓度为20-100μg/mL，然后进行除菌处理；其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种；
优选地，所述试剂D的配制步骤为：将PBS和Tween 20混合，至Tween 20的终浓度为0.05-1％；其中所述PBS的制备方法为：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；优选地，所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
优选地，所述试剂E选自浓度为0.1-1mol/L的甘氨酸溶液、浓度为0.2-1.8mol/L的冰乙酸溶液和浓度为0.05-1mol/L的柠檬酸溶液中的一种或两种以上；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液和/或0.05-1mol/L柠檬酸溶液；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液。
4.一种根据权利要求1至3中任一项所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基来培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液20-30mL在温度为3-5℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为3-5℃下静置1-3h，后在温度为3-5℃、离心力为8000-12000g下离心25-35min，取沉淀物；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS 0.5-2ml进行重悬；
(6)取所述试剂B10-50μl，分离2-3min，得到第一沉淀物；将该第一与所述步骤(1)得到的PBS 0.5-1.5ml混合均匀，分离2-3min，得到第二沉淀物；将该第二沉淀物与所述步骤(1)得到的PBS 0.5-1.5ml混合均匀，分离2-3min，得到沉淀物，于3-5℃下保存；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂C 500-1000μl混合，在室温下保持1.5-2.5h，分离，得到第三沉淀物；将该第三沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(5)得到的重悬液与所述步骤(7)得到的沉淀物旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(9)将所述步骤(8)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，得到沉淀物；
(10)将所述步骤(9)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，该方法还包括步骤(11)：将所述步骤(10)得到的所述外泌体与所述试剂E 45-55μl旋转混合5-15min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7-8μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(10)得到的所述外泌体的提取效果验证。
5.根据权利要求4所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；其中所述胎牛血清不含所述外泌体；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液25mL在温度为4℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为4℃下静置2h，后在温度为4℃、离心力为10000g下离心30min，取沉淀物；其中所述滤膜为0.22μm或0.45μm；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS 0.5-2ml进行重悬；
(6)取所述试剂B10-50μl，分离2-3min，得到第一沉淀物；将该第一与所述步骤(1)得到的PBS 1ml混合均匀，分离2-3min，得到第二沉淀物；将该第二沉淀物与所述步骤(1)得到的PBS 1ml混合均匀，分离2-3min，得到沉淀物，于4℃下保存；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂C 500-1000μl混合，在室温下保持2h，分离，得到第三沉淀物；将该第三沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(5)得到的重悬液与所述步骤(7)得到的沉淀物旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(9)将所述步骤(8)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，得到沉淀物；
(10)将所述步骤(9)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，所述方法还包括步骤(11)：将所述步骤(10)得到的所述外泌体与所述试剂E50μl旋转混合10min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7.5μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(10)得到的所述外泌体的提取效果验证。
6.根据权利要求4或5所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述步骤(2)中，当所述细胞生长至密度大于1×104-1×106/mL时，使用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基稀释所述细胞至密度为1×104-1×106/mL；优选地，所述步骤(2)中，所述胎牛血清不含所述外泌体。
7.一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂D和试剂G；
其中，所述试剂A为浓度为35-45g/mL的PEG 6000和/或PEG 8000水溶液；
所述试剂D为浓度为0.05-1％Tween 20的磷酸盐缓冲液；
所述试剂G为浓度为0.5-10％的包被有抗体的磁性微粒溶液，其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种以上；优选地，所述磁性微粒为Protein A/G磁性微粒；
优选地，所述试剂盒还包括试剂E和试剂F，其中，所述试剂E选自甘氨酸溶液、冰乙酸溶液和柠檬酸溶液中的一种或两种以上；所述试剂F为Tris溶液和/或柠檬酸溶液。
8.根据权利要求7所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒，其特征在于，所述试剂A的配制步骤为：将去离子水与PEG 6000和/或PEG 8000混合，使所述试剂A的浓度为35-45g/mL，然后进行除菌处理；优选地，所述试剂A的浓度为40g/mL；
优选地，所述试剂D的配制步骤为：将PBS和Tween 20混合，至Tween 20的终浓度为0.05-1％；其中所述PBS的制备方法为：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；优选地，所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2gKCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
优选地，所述试剂E选自浓度为0.1-1mol/L的甘氨酸溶液、浓度为0.2-1.8mol/L的冰乙酸溶液和浓度为0.05-1mol/L的柠檬酸溶液中的一种或两种以上；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液和/或0.05-1mol/L柠檬酸溶液；
优选地，所述试剂F为0.1-1mol/L Tris溶液；
优选地，所述试剂G的配制步骤为：取浓度为1-10％的磁性微粒溶液10-50μl，分离2-3min，弃上清液，得到第一溶液；将所述第一溶液和1mL PBS混合，分离2-3min，弃上清，得到第二溶液；将所述第二溶液和1mL PBS混合，分离2-3min，弃上清，得到第三溶液；将所述第三溶液与500-1000μl抗体溶液混合，反应1-3h，分离，弃上清，得到试剂G；
其中，所述抗体溶液的配制步骤为：将去离子水和抗体混合，使所得到的抗体溶液浓度为20-100μg/mL，然后进行除菌处理；其中所述抗体选自CD63、CD81和CD9中的一种或两种以上；
所述PBS的制备方法为：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1gKH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；优选地，所述PBS的制备方法为：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44gNa2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L。
9.一种根据权利要求7或8所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法，该方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将7g-9g NaCl、0.1g-0.3g KCl、1g-2g Na2HPO4和0.2g-1g KH2PO4混合，加水至0.7-1.5L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基来培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液20-30mL在温度为3-5℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为3-5℃下静置1-3h，后在温度为3-5℃、离心力为8000-12000g下离心25-35min，取沉淀物；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS 0.5-2ml进行重悬；
(6)将步骤(5)得到的重悬液与所述试剂G 0.5-2ml旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(7)得到的沉淀物与所述试剂D 450-550μl旋转混合4-6min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，所述方法还包括步骤(9)：将所述步骤(8)得到的所述外泌体与所述试剂E 45-55μl旋转混合5-15min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7-8μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(8)得到的所述外泌体的提取效果验证。
10.根据权利要求9所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒的使用方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)制备PBS：将8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4混合，加水至1L；
(2)用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基来培养细胞，使细胞生长至密度为1×104-1×106/mL后收集细胞液；其中所述胎牛血清不含所述外泌体；
(3)将所述步骤(2)得到的细胞液25mL在温度为4℃、离心力为1000-2000g下离心10-20min，取上清液；
(4)将所述步骤(3)得到的上清液经滤膜过滤，收集所得滤液中的上清液，向该上清液中添加所述试剂A至所述试剂A的终浓度为5-20％，在温度为4℃下静置2h，后在温度为4℃、离心力为10000g下离心30min，取沉淀物；其中所述滤膜为0.22μm或0.45μm；
(5)将所述步骤(4)得到的沉淀物风干5-10min，后使用所述步骤(1)得到的PBS 0.5-2ml进行重悬；
(6)将步骤(5)得到的重悬液与所述试剂G 0.5-2ml旋转混合，并于温度为37℃下温育1-2h，分离，得到沉淀物；
(7)将所述步骤(6)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，得到沉淀物；
(8)将所述步骤(7)得到的沉淀物与所述试剂D 500μl旋转混合5min，分离，取沉淀物，即得到所述外泌体；
优选地，该方法还包括步骤(9)：将所述步骤(8)得到的所述外泌体与所述试剂E 50μl旋转混合10min，得到混合物；将该混合物与所述试剂F 7.5μl混合，分离，取沉淀物，将该沉淀物用于所述步骤(8)得到的所述外泌体的提取效果验证；
优选地，所述步骤(2)中，当所述细胞生长至密度大于1×104-1×106/mL时，使用含有10-20％胎牛血清的DMEM培养基或不含血清的DMEM培养基稀释所述细胞至密度为1×104-1×106/mL；优选地，所述步骤(2)中，所述胎牛血清不含所述外泌体。
11.根据权利要求1至3中任一项所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒、根据权利要求7或8所述的从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒以及根据权利要求4至6中任一项所述的试剂盒的使用方法、根据权利要求9或10所述的试剂盒的使用方法在从细胞上清液中分离所述外泌体中的应用。
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