CN113774011B - 一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒及其提取方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒及其提取方法，属于外泌体分离技术领域，一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒，包括以下组分：采集管、离心管、滤器、Solution 0、SolutionⅠ、蛋白A琼脂糖纯化珠、抗体混合物、清洗液以及洗脱液，利用亲和捕获技术，为血管内皮细胞来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，利用本试剂盒获取的血管内皮细胞来源外泌体可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析，尤其是血管疾病新机制的探讨和关键分子筛选。

Description

一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒及其提取方法
技术领域
本发明涉及外泌体分离技术领域，更具体地说，涉及一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒及其提取方法。
背景技术
外泌体是细胞分泌的直径约30-150 nm的细胞外囊泡，广泛存在于血液、唾液、尿液、乳汁等体液中，它们包裹着核酸、蛋白、氨基酸、脂类等生物大分子，被受体细胞内吞后，可以释放上述效应物分子，参于调节细胞的生物学活动。
探讨外泌体内生物大分子的组成，改造外泌体使其成为药物载体，已经成为当前生命科学重要的研究课题。外泌体提取是上述研究的关键环节，而基因组学的研究对外泌体的获取提出了更高的要求，如何获取高纯度外泌体并满足基因组学的研究变得尤为重要。
血管内皮细胞是血管功能的重要组成细胞，广泛存在于血管内壁，执行吞噬细胞的功能，吞噬并清除血管中的异物、坏死组织、细菌等。除此之外，血管内皮细胞在血管收缩/舒张、凝血、动脉硬化、炎症等病理、生理活动中扮演了重要角色。许多疾病的发生、发展与血管内皮细胞的功能障碍密切相关，如原发性高血压、动脉粥样硬化、系统性血管炎等。
目前常用的外泌体提取方法如：差速离心法、密度梯度离心法、超滤膜离心分离法、色谱法、聚合物沉淀法等均无法获得某种细胞特异性外泌体，而免疫亲和法是获得组织细胞特异性外泌体的主要方法。
发明内容
1．要解决的技术问题
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒及其提取方法，它利用亲和捕获技术（免疫亲和法），为血管内皮细胞来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案。利用本试剂盒获取的血管内皮细胞来源外泌体可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析，尤其是血管疾病新机制的探讨和关键分子筛选。
2．技术方案
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案。
一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒，包括以下组分：采集管、离心管、滤器、Solution 0、SolutionⅠ、蛋白A琼脂糖纯化珠、抗体混合物、清洗液以及洗脱液；
所述Solution 0为150μL的血液促凝剂；
所述SolutionⅠ为2mL的PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液，pH值为7.4；
所述抗体混合物为4μL的Anti-VE-cadherin和Anti-CD31抗体混合物，其中两种抗体含量各2μL；
所述清洗液为22mL的含牛血清蛋白的PBS缓冲液，牛血清蛋白浓度0.5-2%，pH值为7.4
所述洗脱液为5mL的pH值为2.8-3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度为0.1-0.2mol/L；
所述采集管和离心管均包括管体以及螺纹连接在管体上端的气压盖，所述气压盖上端固定连接有外凸囊片，所述气压盖内底端连接有底塑板，所述气压盖中心处开凿有气孔，所述气孔连通底塑板和外凸囊片，且外凸囊片内饱和填充有惰性气体，所述底塑板包括位于气压盖下方的底板、连接在底板与气压盖之间的多个定位杆以及两个分别与气压盖下端以及底板上端连接的连接层，两个所述连接层之间固定连接有气推压球，所述气推压球位于底塑板内，所述气推压球朝向外的一端固定连接有外凸压环，且外凸压环延伸至底塑板外，所述外凸压环内固定镶嵌有抑菌导线。
进一步的，所述气推压球包括外压层以及与两个连接层固定连接的定型层，所述外压层和定型层连接处连接有内压隔层，所述外压层和内压隔层之间填充有压缩倍数为1.5-2倍的惰性气体，所述抑菌导线端部延伸至定型层和内压隔层之间，在进行颠倒或者震荡操作时，离心管或者采集管内的液体处于不稳定的震荡状态，在该操作时，按压外凸囊片时，内部惰性气体转移并对气推压球产生挤压力，使管体内壁与之间形成的密封层，可有效避免不稳定的样本外溢，使管体与气压盖之间的密封效果更好。
进一步的，所述内压隔层中心处以及定型层均为硬质结构，且内压隔层的硬质部分正对抑菌导线，所述内压隔层硬质中心处固定连接有外收环，所述外收环口部的截面跨度大于抑菌导线端部的跨度，所述外凸压环、外压层和内压隔层外边缘均为弹性结构，在受到外凸囊片内转移的惰性气体的挤压力时，外压层形变，从而使内压隔层受到压缩的惰性气体的挤压，朝向抑菌导线，直至外收环覆盖其端部并与定型层挤压，此时抑菌导线端部受到挤压力，破裂，抑菌消毒液溢出，外收环有效拦截溢出的抑菌消毒液快速下落，使破裂后吸液丝能够与其接触，从而运输抑菌消毒液进入到外凸压环表面，从而有效拦截外界的细菌进入到管体内，使内部盛放的物质不易受到细菌的污染，提高本内皮细胞来源外泌体的提取成功率以及提取效率。
进一步的，所述抑菌导线包括贯穿外凸压环和定型层的吸液丝以及连接在吸液丝朝向内压隔层的端部的储液膜片，且吸液丝与储液膜片连接的端部为硬质结构，所述储液膜片内填充有抑菌消毒液，所述吸液丝另一个端部与外凸压环表面平齐，且该端部为柔性结构，在形成密封层时，外凸压环形变与管体内壁接触面积较大，此时该接触部分可以覆盖吸液丝，使管体内盛放的液体不易与抑菌消毒液接触。
一种内皮细胞来源外泌体的提取方法，包括以下步骤：
S1、样本准备：将准备好的样本放置在离心管备用，并检测样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备：
S21、取出蛋白A琼脂糖纯化珠，放置室温，轻微涡旋瓶底使其混匀；
S22、取80μL蛋白A琼脂糖纯化珠置于离心管中，加入叠氮化钠0.1μg，加SolutionⅠ定容至200μL，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加入1mL SolutionⅠ，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加40μL SolutionⅠ至沉淀中，轻微震荡混匀，此时液体总体积约80μL，备用；
S3、亲和捕获：
S31、将上述准备好的蛋白A琼脂糖纯化珠涡旋混匀，吸取30μL，加入1mL待测血清/细胞上清中，4℃孵育30min，3000g离心3min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，沉淀丢弃；
S32、取抗体混合物4μL添加到上述获得的1mL上清中，混匀后，室温孵育30min，得到抗体-血清混合液；
S33、将剩下的约50μL蛋白A琼脂糖纯化珠溶液混匀，添加到上述抗体-血清混合液中，4℃孵育12h，即为蛋白A-抗体-血清混合，孵育过程中持续匀速缓慢颠倒混匀；
S34、将上述蛋白A-抗体-血清混合液于4℃，3000g离心3min，弃上清，加入1mL清洗液，颠倒混匀后4℃，3000g离心3min，弃上清，再次用1mL清洗液洗涤一次，弃上清，获得清蛋白A-抗体-外泌体复合物；
S35、将上述复合物与400μL洗脱液混合，室温震荡30min，3000g离心3min，取上清，即为高纯度外泌体。
进一步的，所述步骤S1中样本为全血样本时，其准备步骤为：
A1、采集管预先加入适量Solution 0，将3 mL新鲜全血注入采集管中，轻微颠倒混匀，静置30 min至血液凝固；
A2、4℃，3000g，5分钟离心，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
A3、注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
进一步的，所述步骤S1中样本为血浆样本时，其准备步骤为：
B1、新鲜血浆，置于采集管中，按每5mL血浆加20 μL的比例加入Solution 0，轻微颠倒混匀，静置30 min。
B2、4℃，3000g，5分钟离心，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
B3、注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
进一步的，所述步骤S1中样本为细胞上清或其它体液样本时，其准备步骤为：
C1、将细胞上清或其它体液置于采集管中，4℃，3000 g，5分钟离心，取上清置于离心管中，重复离心一次；
C2、注射器吸取上述离心后的液体，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
进一步的，所述颠倒和震荡的操作中，均需手动或者通过外力对外凸囊片施力，使外凸囊片贴附在气压盖表面，外凸囊片内气体通过气孔转移至底塑板内并向外对气推压球产生挤压力，使外凸压环与管体内壁挤压接触，在内部产生一层密封层，有效避免震荡或者颠倒操作时，内部液体外溢，同时抑菌导线引导抑菌消毒液至密封层与管体的接触部位，从而在密封层内形成一层抑菌消毒层，有效拦截外界细菌向管体内蔓延，使内部盛放的物质不易受到细菌的污染，提高本内皮细胞来源外泌体的提取成功率以及提取效率。
3．有益效果
相比于现有技术，本发明的优点在于：
（1）本方案利用亲和捕获技术，为血管内皮细胞来源外泌体的高纯度提取提供了稳定、有效的方案，利用本试剂盒获取的血管内皮细胞来源外泌体可用于RNASeq、质谱检测等对外泌体纯度要求高的下游分析，尤其是血管疾病新机制的探讨和关键分子筛选。
在颠倒和震荡的操作中，手动或者通过外力对外凸囊片施力，此时惰性气体转移，外压层形变，从而使内压隔层受到压缩的惰性气体的挤压，朝向抑菌导线，直至外收环覆盖其端部并与定型层挤压，此时抑菌导线端部受到挤压力，破裂，抑菌消毒液溢出，外收环有效拦截溢出的抑菌消毒液快速下落，使破裂后吸液丝能够与其接触，从而运输抑菌消毒液进入到外凸压环表面，从而有效拦截外界的细菌进入到管体内，使内部盛放的物质不易受到细菌的污染，提高本内皮细胞来源外泌体的提取成功率以及提取效率。
附图说明
图1为本发明的试剂盒组成的示意图；
图2为本发明的采集管或离心管的结构示意图；
图3为本发明的气压盖立体的结构示意图；
图4为本发明的气压盖截面的结构示意图；
图5为图4中A处的结构示意图；
图6为本发明的底塑板部分的结构示意图；
图7为本发明的在按压气压盖后气推压球的结构示意图；
图8为本发明的气推压球与管体内壁挤压接触时的结构示意图。
图中标号说明：
1管体、2气压盖、3外凸囊片、4气孔、5底塑板、51底板、52连接层、6定位杆、7气推压球、71外压层、72内压隔层、73定型层、8外凸压环、81吸液丝、82储液膜片、9外收环。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图；对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述；显然；所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例；而不是全部的实施例，基于本发明中的实施例；本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例；都属于本发明保护的范围。
在本发明的描述中，需要说明的是，术语“上”、“下”、“内”、“外”、“顶/底端”等指示的方位或位置关系为基于附图所示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性。
在本发明的描述中，需要说明的是，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置有”、“套设/接”、“连接”等，应做广义理解，例如“连接”，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
实施例1：
请参阅图1，一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒，包括以下组分：采集管、离心管、滤器、Solution 0、SolutionⅠ、蛋白A琼脂糖纯化珠、抗体混合物、清洗液以及洗脱液；
所述Solution 0为150μL的血液促凝剂；
所述SolutionⅠ为2mL的PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液，pH值为7.4；
所述抗体混合物为4μL的Anti-VE-cadherin和Anti-CD31抗体混合物，其中两种抗体含量各2μL；
所述清洗液为22mL的含牛血清蛋白的PBS缓冲液，牛血清蛋白浓度0.5-2%，pH值为7.4
所述洗脱液为5mL的pH值为2.8-3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度为0.1-0.2mol/L；
请参阅图2-4，采集管和离心管均包括管体1以及螺纹连接在管体1上端的气压盖2，气压盖2上端固定连接有外凸囊片3，气压盖2内底端连接有底塑板5，气压盖2中心处开凿有气孔4，气孔4连通底塑板5和外凸囊片3，且外凸囊片3内饱和填充有惰性气体，底塑板5包括位于气压盖2下方的底板51、连接在底板51与气压盖2之间的多个定位杆6以及两个分别与气压盖2下端以及底板51上端连接的连接层52，两个连接层52之间固定连接有气推压球7。
请参阅图5-6，气推压球7位于底塑板5内，气推压球7朝向外的一端固定连接有外凸压环8，且外凸压环8延伸至底塑板5外，外凸压环8内固定镶嵌有抑菌导线，如图7，抑菌导线包括贯穿外凸压环8和定型层73的吸液丝81以及连接在吸液丝81朝向内压隔层72的端部的储液膜片82，吸液丝81延伸至定型层73外，且该部分为硬质结构，储液膜片82内填充有抑菌消毒液，吸液丝81另一个端部与外凸压环8表面平齐，吸液丝81位于外凸压环8和定型层73内的部分为柔性结构，在形成密封层时，外凸压环8形变与管体1内壁接触面积较大，此时该接触部分可以覆盖吸液丝81，使管体1内盛放的液体不易与抑菌消毒液接触。
如图7，气推压球7包括外压层71以及与两个连接层52固定连接的定型层73，外压层71和定型层73连接处连接有内压隔层72，外压层71和内压隔层72之间填充有压缩倍数为1.5-2倍的惰性气体，抑菌导线端部延伸至定型层73和内压隔层72之间，在进行颠倒或者震荡操作时，离心管或者采集管内的液体处于不稳定的震荡状态，在该操作时，按压外凸囊片3时，内部惰性气体转移并对气推压球7产生挤压力，使管体1内壁与之间形成的密封层，可有效避免不稳定的样本外溢，使管体1与气压盖2之间的密封效果更好。
内压隔层72中心处以及定型层73均为硬质结构，且内压隔层72的硬质部分正对抑菌导线，内压隔层72硬质中心处固定连接有外收环9，外收环9口部的截面跨度大于抑菌导线端部的跨度，外凸压环8、外压层71和内压隔层72外边缘均为弹性结构，如图7，在受到外凸囊片3内转移的惰性气体的挤压力时，外压层71形变，从而使内压隔层72受到压缩的惰性气体的挤压，朝向抑菌导线，直至外收环9覆盖其端部并与定型层73挤压，如图8，此时抑菌导线端部受到挤压力，破裂，抑菌消毒液溢出，外收环9有效拦截溢出的抑菌消毒液快速下落，使破裂后吸液丝81能够与其接触，从而运输抑菌消毒液进入到外凸压环8表面，从而有效拦截外界的细菌进入到管体1内，使内部盛放的物质不易受到细菌的污染，提高本内皮细胞来源外泌体的提取成功率以及提取效率。
一种内皮细胞来源外泌体的提取方法，包括以下步骤：
S1、样本准备：将准备好的样本放置在离心管备用，并检测样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备：
S21、取出蛋白A琼脂糖纯化珠，放置室温，轻微涡旋瓶底使其混匀；
S22、取80μL蛋白A琼脂糖纯化珠置于离心管中，加入叠氮化钠0.1μg，加SolutionⅠ定容至200μL，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加入1mL SolutionⅠ，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加40μL SolutionⅠ至沉淀中，轻微震荡混匀，此时液体总体积约80μL，备用；
S3、亲和捕获：
S31、将上述准备好的蛋白A琼脂糖纯化珠涡旋混匀，吸取30μL，加入1mL待测血清/细胞上清中，4℃孵育30min，3000g离心3min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，沉淀丢弃；
S32、取抗体混合物4μL添加到上述获得的1mL上清中，混匀后，室温孵育30min，得到抗体-血清混合液；
S33、将剩下的约50μL蛋白A琼脂糖纯化珠溶液混匀，添加到上述抗体-血清混合液中，4℃孵育12h，即为蛋白A-抗体-血清混合，孵育过程中持续匀速缓慢颠倒混匀；
S34、将上述蛋白A-抗体-血清混合液于4℃，3000g离心3min，弃上清，加入1mL清洗液，颠倒混匀后4℃，3000g离心3min，弃上清，再次用1mL清洗液洗涤一次，弃上清，获得清蛋白A-抗体-外泌体复合物；
S35、将上述复合物与400μL洗脱液混合，室温震荡30min，3000g离心3min，取上清，即为高纯度外泌体。
进一步的，步骤S1中样本为全血样本时，其准备步骤为：
A1、采集管预先加入适量Solution 0按每5mL全血加20 μL的比例，将3 mL新鲜全血注入采集管中，轻微颠倒混匀，静置30 min至血液凝固；
A2、4℃，3000g，5分钟离心，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
A3、注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
进一步的，步骤S1中样本为血浆样本时，其准备步骤为：
B1、新鲜血浆，置于采集管中，按每5mL血浆加20 μL的比例加入Solution 0，轻微颠倒混匀，静置30 min。
B2、4℃，3000g，5分钟离心，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
B3、注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
进一步的，步骤S1中样本为细胞上清或其它体液样本时，其准备步骤为：
C1、将细胞上清或其它体液置于采集管中，4℃，3000 g，5分钟离心，取上清置于离心管中，重复离心一次；
C2、注射器吸取上述离心后的液体，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
颠倒和震荡的操作中，均需手动或者通过外力对外凸囊片3施力，使外凸囊片3贴附在气压盖2表面，外凸囊片3内气体通过气孔4转移至底塑板5内并向外对气推压球7产生挤压力，使外凸压环8与管体1内壁挤压接触，在内部产生一层密封层，有效避免震荡或者颠倒操作时，内部液体外溢，同时抑菌导线引导抑菌消毒液至密封层与管体1的接触部位，从而在密封层内形成一层抑菌消毒层，有效拦截外界细菌向管体1内蔓延，使内部盛放的物质不易受到细菌的污染，提高本内皮细胞来源外泌体的提取成功率以及提取效率。
以上所述；仅为本发明较佳的具体实施方式；但本发明的保护范围并不局限于此；任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内；根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变；都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (7)

1.一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒，其特征在于：包括以下组分：采集管、离心管、滤器、Solution 0、SolutionⅠ、蛋白A琼脂糖纯化珠、抗体混合物、清洗液以及洗脱液；
所述Solution 0为150μL的血液促凝剂；
所述SolutionⅠ为2mL的PBS缓冲液，即磷酸盐缓冲液，pH值为7.4；
所述抗体混合物为45μL的Anti-VE-cadherin和Anti-CD31抗体混合物；
所述清洗液为22mL的含牛血清蛋白的PBS缓冲液，牛血清蛋白浓度0.5-2%，pH值为7.4；
所述洗脱液为5mL的pH值为2.8-3.5的甘氨酸溶液，甘氨酸浓度为0.1-0.2mol/L；
所述采集管和离心管均包括管体（1）以及螺纹连接在管体（1）上端的气压盖（2），所述气压盖（2）上端固定连接有外凸囊片（3），所述气压盖（2）内底端连接有底塑板（5），所述气压盖（2）中心处开凿有气孔（4），所述气孔（4）连通底塑板（5）和外凸囊片（3），且外凸囊片（3）内饱和填充有惰性气体，所述底塑板（5）包括位于气压盖（2）下方的底板（51）、连接在底板（51）与气压盖（2）之间的多个定位杆（6）以及两个分别与气压盖（2）下端以及底板（51）上端连接的连接层（52），两个所述连接层（52）之间固定连接有气推压球（7），所述气推压球（7）位于底塑板（5）内，所述气推压球（7）朝向外的一端固定连接有外凸压环（8），且外凸压环（8）延伸至底塑板（5）外，所述外凸压环（8）内固定镶嵌有抑菌导线；
所述气推压球（7）包括外压层（71）以及与两个连接层（52）固定连接的定型层（73），所述外压层（71）和定型层（73）连接处连接有内压隔层（72），所述外压层（71）和内压隔层（72）之间填充有压缩倍数为1.5-2倍的惰性气体，所述抑菌导线端部延伸至定型层（73）和内压隔层（72）之间，所述内压隔层（72）中心处以及定型层（73）均为硬质结构，且内压隔层（72）的硬质部分正对抑菌导线，所述内压隔层（72）硬质中心处固定连接有外收环（9），所述外收环（9）口部的截面跨度大于抑菌导线端部的跨度，所述外凸压环（8）、外压层（71）和内压隔层（72）外边缘均为弹性结构，所述抑菌导线包括贯穿外凸压环（8）和定型层（73）的吸液丝（81）以及连接在吸液丝（81）朝向内压隔层（72）的端部的储液膜片（82），所述储液膜片（82）内填充有抑菌消毒液，所述吸液丝（81）另一个端部与外凸压环（8）表面平齐。
2.根据权利要求1所述的一种内皮细胞来源外泌体提取试剂盒，其特征在于：所述吸液丝（81）位于外凸压环（8）和定型层（73）内的部分为柔性结构，所述吸液丝（81）延伸至定型层（73）外，且该部分为硬质结构。
3.一种根据权利要求1所述的试剂盒提取内皮细胞来源外泌体的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1、样本准备：将准备好的样本放置在离心管备用，并检测样本液pH值，使用HCl或NaOH调整pH值至7.2-7.4；
S2、蛋白A琼脂糖纯化珠的准备：
S21、取出蛋白A琼脂糖纯化珠，放置室温，轻微涡旋瓶底使其混匀；
S22、取80μL蛋白A琼脂糖纯化珠置于离心管中，加入叠氮化钠0.1μg，加SolutionⅠ定容至200μL，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加入1mL SolutionⅠ，轻微震荡混匀，1000g离心30s，弃上清；加40μL SolutionⅠ至沉淀中，轻微震荡混匀，此时液体总体积约80μL，备用；
S3、亲和捕获：
S31、将上述准备好的蛋白A琼脂糖纯化珠涡旋混匀，吸取30μL，加入1mL待测血清/细胞上清中，4℃孵育30min，3000g离心3min，将上清转移到新的1.5mL离心管中，沉淀丢弃；
S32、取抗体混合物4μL添加到上述获得的1mL上清中，其中两种抗体含量各2μL，混匀后，室温孵育30min，得到抗体-血清混合液；
S33、将剩下的约50μL蛋白A琼脂糖纯化珠溶液混匀，添加到上述抗体-血清混合液中，4℃孵育12h，即为蛋白A-抗体-血清混合，孵育过程中持续匀速缓慢颠倒混匀；
S34、将上述蛋白A-抗体-血清混合液于4℃，3000g离心3min，弃上清，加入1mL清洗液，颠倒混匀后4℃，3000g离心3min，弃上清，再次用1mL清洗液洗涤一次，弃上清，获得清蛋白A-抗体-外泌体复合物；
S35、将上述复合物与400μL洗脱液混合，室温震荡30min，3000g离心3min，取上清，即为高纯度外泌体。
4.根据权利要求3所述的一种内皮细胞来源外泌体提取方法，其特征在于：所述步骤S1中样本为全血样本时，其准备步骤为：
A1、采集管预先加入适量Solution 0，将3 mL新鲜全血注入采集管中，轻微颠倒混匀，静置30 min至血液凝固；
A2、4℃，3000g，5分钟离心，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
A3、注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
5.根据权利要求3所述的一种内皮细胞来源外泌体提取方法，其特征在于：所述步骤S1中样本为血浆样本时，其准备步骤为：
B1、新鲜血浆，置于采集管中，按每5mL血浆加20 μL的比例加入Solution 0，轻微颠倒混匀，静置30 min；
B2、4℃，3000g，5分钟离心，取上清即为血清，置于1.5mL离心管中；重复离心1次，吸取上清；
B3、注射器吸取上述离心后的血清，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
6.根据权利要求3所述的一种内皮细胞来源外泌体提取方法，其特征在于：所述步骤S1中样本为细胞上清时，其准备步骤为：
C1、将细胞上清置于采集管中，4℃，3000 g，5分钟离心，取上清置于离心管中，重复离心一次；
C2、注射器吸取上述离心后的液体，滤器过滤后，转移至新的离心管备用。
7.根据权利要求4所述的一种内皮细胞来源外泌体提取方法，其特征在于：所述颠倒和震荡的操作中，均需手动或者通过外力对外凸囊片（3）施力，使外凸囊片（3）贴附在气压盖（2）表面，外凸囊片（3）内气体通过气孔（4）转移至底塑板（5）内并向外对气推压球（7）产生挤压力，使外凸压环（8）与管体（1）内壁挤压接触，在内部产生一层密封层，同时抑菌导线引导抑菌消毒液至密封层与管体（1）的接触部位。
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