CN110411816B - 一种外泌体的富集方法 - Google Patents
一种外泌体的富集方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN110411816B CN110411816B CN201810402324.6A CN201810402324A CN110411816B CN 110411816 B CN110411816 B CN 110411816B CN 201810402324 A CN201810402324 A CN 201810402324A CN 110411816 B CN110411816 B CN 110411816B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- solution
- process according
- sample
- enrichment process
- biological sample
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/40—Concentrating samples
Landscapes
- Physics & Mathematics (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及一种外泌体富集方法及其在生物样品中外泌体快速富集中的应用。首先对生物样品差速离心处理或超滤处理，去除样品中的细胞类干扰；向上清液中加入PEG溶液，在低温下静置一段时间；将样品放置合适温度使成均匀溶液，在低速下离心，所得沉淀即为外泌体。
Description
技术领域
本发明涉及一种外泌体富集方法及其在生物样品中外泌体的快速富集的应用。具体地说是一种基于低温条件下，PEG聚合物捕获外泌体，进而在低速离心条件下富集外泌体的方法。
背景技术
在十九世纪六七十年代，研究人员在细胞外，如软骨、血和细胞培养液中，发现了许多膜包被的囊泡小体(J.Cell Biol.1969,41,59-72.)。起初，人们发现其中的某些囊泡是通过细胞质膜向外出芽的方式进行释放。直到80年代，人们又发现了一种更为复杂的囊泡分泌方式。细胞内的核内体先形成多泡小体，并通过质膜融合的方式将其中包含的小囊泡释放到细胞外(J.Biol.Chem.1987,262,9412-9420)。人们详细地研究了这类囊泡的分泌形式，并首次将这一类囊泡命名为外泌体(exosomes)。后续的研究表明，包括Exosome在内，所有的外泌体都包含有蛋白质、核酸物质、脂质物质。这些物质赋予了外泌体很多功能功能，翻开了外泌体研究新的篇章(Stem Cells 2015,33,1200-1212)。
当前的外泌体富集方法中，是超速离心和密度梯度离心法是公认的金标准，但是对设备的依赖性限制了他们的广泛使用。基于高分子聚合物的沉淀富集方法因其操作简单而被广泛采用。但是该方法通常需要过夜孵育处理才能实现较高的回收效率。我们在研究中发现，合适浓度的PEG可以实现外泌体的高回收率提取。在低温环境下，将PEG加入到生物样品溶液中，通过短时间的静置后，在合适的温度下溶解，通过低速离心可以获得外泌体成分。因此，选择合适的PEG沉淀溶液，通过低温处理，可以在短时间内实现外泌体成分的富集，对于分析生物样本，尤其是大样本量的临床体液样本，具有较大意义。
参考文献：
1.Anderson,H C,Vesicles associated with calcification in the matrixof epiphyseal cartilage[J].J.Cell Biol.1969,41(1):59-72.
2.Johnstone,R M；Adam,M；Hammond,J；Orr,L；Turbide,C,Vesicle formationduring reticulocyte maturation.Association of plasma membrane activities withreleased vesicles(exosomes)[J].J.Biol.Chem.1987,262(19):9412-9420.
3.Vaidyanathan,R；Naghibosadat,M；Rauf,S；Korbie,D；Carrascosa,L G；Shiddiky,M J；Trau,M,Detecting exosomes specifically:a multiplexed devicebased on alternating current electrohydrodynamic induced nanoshearing[J].Anal.Chem.2014,86(22):11125-11132.
发明内容
本发明的目的在于提供一种外泌体富集方法，可以实现生物样品中外泌体的快速富集。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
取1μL-100mL生物样品，例如细胞培养液，菌株培养液，组织培养液，及各种体液样本及临床检测用液体检材，如血液、尿液，唾液，精液，胆汁，脑脊液，呼吸道清洗液，等等。进行预处理，首先在200g-500g条件下离心3-15分钟，然后吸取上清液，在2000g-5000g条件下离心10-30分钟，最后在10000g-20000g条件下离心0.5-3h。最后一步离心操作可以改为经过0.1-0.3微米的滤膜进行过滤。使用pH值为6-8的水、细胞培养用PBS缓冲液或磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液配置分子量为2000-50000Da的PEG母液，配制的质量浓度为30-80％的PEG溶液作为母液加入到生物样品中，使终浓度达到2-10％。向生物样品中加入DMSO，丙酮，丁醇中的一种或几种有机溶剂，使其终浓度范围为0-80％。向生物样品中加如盐溶液，可以为氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钠等的一种或几种，使其终浓度范围为0-300mM。将加入各种添加物的混合液混匀后，放置于-200℃至+10℃环境中，静置1min-60min。然后将样品置于0℃-37℃进行温度平衡，至样品呈均匀溶液。将样品在500g-5000g条件下进行离心5min-30min，得到沉淀为外泌体。将外泌体，溶解在PBS中，再进行一次沉淀操作，获得进一步纯化的外泌体。
所得的外泌体可用于临床生物化学检测、基因组学、代谢组学、蛋白质组学分析及活性研究。
本发明的优点为：低温处理可以明显减少处理时间，适用于生物样品中外泌体的快速处理。
附图说明
图1多次重复试验显示处理方法具有较高的重现性；
结果显示：6次处理方法得到的蛋白质组学结果具有较好的重现性。
图2富集外泌体蛋白质组学结果用于疾病的分型分析；
结果显示：通过对富集得到外泌体进行分析，可以对32例病人样本进行初步疾病分型分析。
具体实施方式
实施例1
将10mL人尿液置于200g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG10000的PBS溶液，使PEG终质量浓度为8％，加入氯化钠使终浓度为150mM，加入DMSO使终体积浓度为5％，将样品置于-20℃，静置时间30min后，将样品置于4℃进行融化。将融化后的样品在500g条件下进行离心，时间30min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示样品该处理流程得到的技术重现性较高(附图1)。
实施例2
将10mL HELA细胞培养液置于500g条件下离心5分钟，将上清液置于4000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG水溶液使PEG20000终质量浓度为8％，加入DMSO使终体积浓度为10％，将样品置于-80℃，静置时间10min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在5000g条件下进行离心，时间5min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示具有较多外泌体蛋白质。
实施例3
将0.2mL人血浆，用PBS稀释至10mL，500g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心20分钟，10000g条件下离心1h。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG2000的PBS溶液使PEG终质量浓度为12％，加入氯化钠使终浓度为50mM，加入丁醇使终体积浓度为5％，将样品置于-60℃，静置时间20min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在4000g条件下进行离心，时间20min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示多数蛋白归属于Exocart数据库。
实施例4
将0.2mL人血浆，用PBS稀释至10mL，1000g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在4000g条件下离心20分钟，上清20000g条件下离心2h。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG20000的磷酸缓冲液(50mM)使PEG终质量浓度为10％，加入氯化钠使终浓度为200mM，将样品置于-80℃，静置时间30min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在4000g条件下进行离心，时间20min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果中的鉴定到了80个Exocarta数据库中前鉴定频率最高的前100位的蛋白质
实施例5
将8mL人尿液置于500g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在4000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG8000的PBS溶液，使PEG终质量浓度为10％，加入氯化钠使终浓度为20mM，将样品置于-80℃，静置时间20min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在3000g条件下进行离心，时间15min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。对病人及患者的尿液外泌体进行蛋白质组学分析，可进行肾脏疾病的分型分析(附图2)。
实施例6
将8mLHELA细胞培养液置于250g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在4000g条件下离心20分钟，上清15000g条件下离心1h。向上清液中加入质量浓度为50％的PEG 2000水溶液，使PEG终质量浓度为8％，加入DMSO使终体积浓度为10％。将样品置于-20℃，静置时间40min后，将样品置于4℃进行融化。将融化后的样品在1500g条件下进行离心，时间25min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。Westen-bloting结果显示鉴定到外泌体标志物CD9。
实施例7
将2mL人尿液于4000g条件下离心20分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG 10000水溶液，使PEG终质量浓度为10％，加入氯化钠使终浓度为150mM。将样品置于-186℃，静置时间10min后，将样品置于4℃进行融化。将融化后的样品在2000g条件下进行离心，时间10min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示具有较多外泌体蛋白质。
实施例8
将2mL HELA细胞培养液置于500g条件下离心5分钟，将上清液置于新离心管中，在2000g条件下离心5分钟，经过0.22微米的滤膜过滤。向滤过液中加入质量浓度为50％的PEG8000的水溶液，使PEG终质量浓度为15％，将样品置于-20℃，静置时间20min后，将样品置于37℃进行融化。将融化后的样品在5000g条件下进行离心，时间15min。离心后所得沉淀为外泌体样品。NTA分析和电镜结果显示富集到的外泌体。蛋白质组学结果显示具有较多外泌体蛋白质。
Claims (13)
1.一种外泌体的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
1) 将生物样品进行预处理；
2) 向步骤1）所得的生物样品中加入PEG溶液，以及加入或不加入有机试剂和/或盐溶液；
3) 将步骤2）所得的溶液混合均匀，放置低温环境下静置冻结，然后将样品放置一定温度下融化使成均匀溶液；步骤3）所得的溶液混合均匀，放置低温环境下静置冻结所放置的温度为-200℃至-10℃；
4) 将步骤3）所得的溶液将样品于低速下离心，所得沉淀即为外泌体，步骤4）形成均匀溶液的样本，在500g-5000g条件下进行离心。
2.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
生物样品为细胞培养液，菌株培养液，组织培养液。
3.按照权利要求2所述的富集方法，其特征在于：
生物样品为血液、尿液、唾液、精液、胆汁、脑脊液、呼吸道清洗液中的一种或二种以上。
4.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
生物样品的体积为1µL-100mL。
5.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：生物样品进行预处理方法为：
首先在200g-500g条件下离心3-15分钟，然后吸取上清液A；
上清液A在2000g-5000g条件下离心10-30分钟，然后吸取上清液B；
最后上清液B在10000g-20000g条件下离心0.5-3h或经过0.1-0.3微米的滤膜进行过滤，得所需要液体。
6.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
所使用的PEG的分子量为2000-50000 Da，使其于体系中加入的终质量浓度为2-10%。
7.按照权利要求1或6所述的富集方法，其特征在于：
配制的质量浓度为30-80%的PEG溶液作为母液加入到生物样品中，所选溶液体系为下列溶剂中的一种，纯水，细胞培养常用PBS缓冲液，磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲溶液碱性溶剂，pH值为6-8。
8.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：所述的有机溶液为DMSO，丙酮，丁醇，异丙醇，DMF中的一种或两种以上，使其在体系中最终体积浓度范围为5-80%；
加入的盐溶液中的盐为氯化钠、氯化钾、氯化钙、磷酸二氢钠的一种或两种以上，使其在体系中最终浓度范围为10-300mM。
9.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
步骤3）所得的溶液混合均匀，放置低温环境下静置冻结静置于低温环境下的时间为1min - 60min。
10.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
步骤3）生物样品低温静置后，置于0℃-37℃进行温度平衡融化，至样品呈均匀溶液。
11.按照权利要求1或10所述的富集方法，其特征在于：
形成均匀溶液的样本，离心时间5min-30min，形成的沉淀为外泌体。
12.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：
所获得的外泌体，溶解在PBS中，再进行一次沉淀操作，获得进一步纯化的外泌体。
13.按照权利要求1所述的富集方法，其特征在于：所述的富集方法能用于临床生物化学检测、基因组学、代谢组学或蛋白质组学分析或活性研究。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810402324.6A CN110411816B (zh) | 2018-04-28 | 2018-04-28 | 一种外泌体的富集方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201810402324.6A CN110411816B (zh) | 2018-04-28 | 2018-04-28 | 一种外泌体的富集方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN110411816A CN110411816A (zh) | 2019-11-05 |
| CN110411816B true CN110411816B (zh) | 2021-08-31 |
Family
ID=68357345
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201810402324.6A Active CN110411816B (zh) | 2018-04-28 | 2018-04-28 | 一种外泌体的富集方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN110411816B (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2021114160A1 (zh) * | 2019-12-12 | 2021-06-17 | 中国科学院深圳先进技术研究院 | 一种微囊泡的生产方法、基于该微囊泡的生产方法得到的微囊泡及其应用 |
| CN113215075A (zh) * | 2020-01-21 | 2021-08-06 | 武汉生之源生物科技股份有限公司 | 一种从细胞上清液中分离外泌体的试剂盒及其使用方法 |
| CN111378713A (zh) * | 2020-04-01 | 2020-07-07 | 上海中科新生命生物科技有限公司 | 基于差速超离富集细胞上清外泌体的蛋白质组分析方法 |
| CN113025480B (zh) * | 2021-03-05 | 2022-02-11 | 北京凯祥弘康生物科技有限公司 | 一种有效富集血液中神经源性外泌体的自动化设备 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9005888B2 (en) * | 2012-06-14 | 2015-04-14 | System Biosciences, Llc | Methods for microvesicle isolation and selective removal |
| CN106282107A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-01-04 | 章毅 | 人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法及其应用 |
| CN107525818A (zh) * | 2017-09-29 | 2017-12-29 | 上海华盈生物医药科技有限公司 | 一种从尿液中提取外泌体的方法及试剂 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20130273544A1 (en) * | 2012-04-17 | 2013-10-17 | Life Technologies Corporation | Methods and compositions for exosome isolation |
-
2018
- 2018-04-28 CN CN201810402324.6A patent/CN110411816B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9005888B2 (en) * | 2012-06-14 | 2015-04-14 | System Biosciences, Llc | Methods for microvesicle isolation and selective removal |
| CN106282107A (zh) * | 2016-08-30 | 2017-01-04 | 章毅 | 人胎盘间充质干细胞源分离外泌体的方法及其应用 |
| CN107525818A (zh) * | 2017-09-29 | 2017-12-29 | 上海华盈生物医药科技有限公司 | 一种从尿液中提取外泌体的方法及试剂 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN110411816A (zh) | 2019-11-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN110411816B (zh) | 一种外泌体的富集方法 | |
| US4290774A (en) | Purification of lipoprotein cholesterol for use as a cholesterol reference material | |
| EP2848935A1 (en) | Process for removing red blood cells and centrifugal tube for blood collection | |
| CN110231207B (zh) | 一种分离外泌体的方法 | |
| Borsook et al. | Studies on erythropoiesis II. A method of segregating immature from mature adult rabbit erythroblasts | |
| Hoagland et al. | CONSTITUENTS OF ELEMENTARY BODIES OF VACCINIA: IV. Demonstration of Copper in the Purified Virus | |
| Bassiouni | The estimation of heparin and similar substances in human blood and tissues using a combined biological and colorimetric method with paper electrophoretic studies | |
| CN111257361A (zh) | 一种以纳米颗粒作为参照物质的病毒颗粒的电镜定量检测方法 | |
| JP2002533168A (ja) | 血液に関連する透析および処理 | |
| SU1767433A1 (ru) | Способ определени инсулинорезистентности имунного генеза у больных сахарным диабетом I типа | |
| CN113101737A (zh) | 一种亲和切向流过滤系统及其构建方法和外泌体提取方法及应用 | |
| CN112852725A (zh) | 利用蛋白交联纳米亲和微球提取纯化干细胞外泌体制备方法及应用 | |
| CN111413176A (zh) | 一种尿液有形成分分析用红细胞和白细胞质控物质及其制备方法 | |
| CN106754692B (zh) | 一种红细胞膜及其制备方法和应用 | |
| DeBari et al. | Cyclic GMP in the human erythrocyte. Intracellular levels and transport in normal subjects and chronic hemodialysis patients | |
| CN113813454B (zh) | 一种采集器官捐献供体血液的方法 | |
| CN109507127A (zh) | 一种用于检测人类血液中lbp含量的试剂盒 | |
| CN108548921A (zh) | 一种间接抗人球蛋白加速配血的试验方法 | |
| Wiltbank et al. | Filtration plasmapheresis in vivo | |
| CN109142761B (zh) | 网织红细胞模拟物及其制备方法与应用 | |
| Schiebout-Clark et al. | Filtration of platelet-poor plasma specimens yields platelet-free plasma: application for batch analysis of beta-thromboglobulin and platelet factor 4 | |
| CN112574940A (zh) | 一种用于分离外泌体的方法 | |
| Sheehan et al. | Mucin biosynthesis and macromolecular assembly | |
| CN108865976B (zh) | 一种离散汲取收集外泌体(exosome)的方法及试剂 | |
| Ohnishi | Isolation and characterization of an actin‐like protein from membranes of human red cells |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |