CN112574940A - 一种用于分离外泌体的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于分离外泌体的方法，S1：材料准备；S2：混合，把聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液和无机盐溶液倒入准备好的试剂盒中；S3：静置沉淀，混匀后把混合液静置，温度为0‑4℃、时间为1‑30h；S4：沉淀分离；S5：稀释杂质，使用磁力搅拌器搅拌混匀，稀释沉淀物；S6：外泌体过滤；S7：外泌体收集。本发明通过聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液、无机盐溶液和磷酸缓冲盐溶液的配合作用，实现了沉淀和过滤相组合的方式对外泌体进行分离，有效提高了外泌体磁分离效率，同时避免了传统沉淀方法造成分离后的外泌体纯度低、杂质多的问题，并且分离得到的外泌体结构完整，能大程度地排除非外泌体杂质，外泌体的得率更高，操作简单。

Description

一种用于分离外泌体的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于分离外泌体的方法。
背景技术
外泌体是一种直径为30-200nm的具有双层脂质分子的包裹的囊性小泡，是由活细胞选择性包装并释放，在人体液中含量丰富，外泌体内含有种类不同的脂质、核酸以及蛋白质等，相关的研究也已经表明，外泌体在细胞间通讯以及生理和病理过程中均发挥着巨大的作用；目前，外泌体的分离方法，主要是沉淀法，沉淀法有典型的不足之处，结构复杂成本高，外泌体纯度低，杂质较多，得率太低，很难分析实验。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于分离外泌体的方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于分离外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
S1：材料准备，生物体液30-100ml、试剂盒、磁力搅拌器、低速离心机、无菌过滤器、储罐、聚乙二醇亲水聚合物试剂20-80ml、水溶液30-90ml、无机盐溶液30-95ml、磷酸缓冲盐溶液50-100ml；
S2：混合，把聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液和无机盐溶液倒入准备好的试剂盒中，使用磁力搅拌器搅拌1-5秒混匀，然后把生物液体倒入试剂盒中，再使用磁力搅拌器对混合液搅拌1-4分钟，混匀后试剂盒中的聚乙二醇亲水聚合物试剂在混合液中的浓度达到20mg/ml-350mg/ml工作浓度；
S3：静置沉淀，混匀后把混合液静置，温度为0-4℃、时间为1-30h，然后外泌体从生物体液中脱离出、沉淀；
S4：沉淀分离，对沉淀样品使用低速离心机进行低速离心处理，进行进一步沉淀，温度1-4℃、低速离心4-8分钟，离心力为200xg-2490xg，分离出外泌体；
S5：稀释杂质，采用含0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器搅拌混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤3-6次，稀释悬液杂质；
S6：外泌体过滤，使用无菌过滤器对悬液杂质进行反复过滤3-5次，过滤杂质物；
S7：外泌体收集，最后把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存。
优选的，步骤S1中，聚乙二醇亲水聚合物试剂选用PEG8000，工作时的浓度为50mg/ml。
优选的，步骤S5中，0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液是由磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温－20、加水，然后加入浓盐酸调pH至7.4制备而成。
优选的，步骤S6中,无菌过滤器的规格为0.55μm。
本发明的技术效果和优点：本发明通过聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液、无机盐溶液和磷酸缓冲盐溶液的配合作用，实现了沉淀和过滤相组合的方式对外泌体进行分离，有效提高了外泌体磁分离效率，同时避免了传统沉淀方法造成分离后的外泌体纯度低、杂质多的问题，并且分离得到的外泌体结构完整，能大程度地排除非外泌体杂质，外泌体的得率更高，操作简单、成本低、得率高，同时可以保证较高的纯度、降低实验成本。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
一种用于分离外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
S1：材料准备，生物体液30ml、试剂盒、磁力搅拌器、低速离心机、无菌过滤器、储罐、聚乙二醇亲水聚合物试剂20ml、水溶液30ml、无机盐溶液30ml、磷酸缓冲盐溶液50ml，聚乙二醇亲水聚合物试剂选用PEG8000，工作时的浓度为50mg/ml；有效的保证外泌体分离工作的效率，操作简单，成本低；
S2：混合，把聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液和无机盐溶液倒入准备好的试剂盒中，使用磁力搅拌器搅拌2秒混匀，然后把生物液体倒入试剂盒中，再使用磁力搅拌器对混合液搅拌1分钟，混匀后试剂盒中的聚乙二醇亲水聚合物试剂在混合液中的浓度达到20mg/ml工作浓度；便于有效的增强外泌体沉淀分离效率和速度，得率高；
S3：静置沉淀，混匀后把混合液静置，温度为2℃、时间为1h，然后外泌体从生物体液中脱离出、沉淀；
S4：沉淀分离，对沉淀样品使用低速离心机进行低速离心处理，进行进一步沉淀，温度1℃、低速离心4分钟，离心力为200xg，分离出外泌体；
S5：稀释杂质，采用含0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器搅拌混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤3次，稀释悬液杂质，0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液是由磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温－20、加水，然后加入浓盐酸调pH至7.4制备而成；便于有效的排出非外泌体杂质，显著提高外泌体的纯度；
S6：外泌体过滤，使用无菌过滤器对悬液杂质进行反复过滤3-5次，过滤杂质物，无菌过滤器的规格为0.55μm；
S7：外泌体收集，最后把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存。
实施例2
一种用于分离外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
S1：材料准备，生物体液40ml、试剂盒、磁力搅拌器、低速离心机、无菌过滤器、储罐、聚乙二醇亲水聚合物试剂50ml、水溶液50ml、无机盐溶液45ml、磷酸缓冲盐溶液70ml，聚乙二醇亲水聚合物试剂选用PEG8000，工作时的浓度为50mg/ml；有效的保证外泌体分离工作的效率，操作简单，成本低；
S2：混合，把聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液和无机盐溶液倒入准备好的试剂盒中，使用磁力搅拌器搅拌3秒混匀，然后把生物液体倒入试剂盒中，再使用磁力搅拌器对混合液搅拌2分钟，混匀后试剂盒中的聚乙二醇亲水聚合物试剂在混合液中的浓度达到280mg/ml工作浓度；便于有效的增强外泌体沉淀分离效率和速度，得率高；
S3：静置沉淀，混匀后把混合液静置，温度为3℃、时间为5h，然后外泌体从生物体液中脱离出、沉淀；
S4：沉淀分离，对沉淀样品使用低速离心机进行低速离心处理，进行进一步沉淀，温度2℃、低速离心6分钟，离心力为1000xg，分离出外泌体；
S5：稀释杂质，采用含0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器搅拌混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤4次，稀释悬液杂质，0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液是由磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温－20、加水，然后加入浓盐酸调pH至7.4制备而成；便于有效的排出非外泌体杂质，显著提高外泌体的纯度；
S6：外泌体过滤，使用无菌过滤器对悬液杂质进行反复过滤3-5次，过滤杂质物，无菌过滤器的规格为0.55μm；
S7：外泌体收集，最后把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存。
实施例3
一种用于分离外泌体的方法，具体按照如下操作步骤：
S1：材料准备，生物体液100ml、试剂盒、磁力搅拌器、低速离心机、无菌过滤器、储罐、聚乙二醇亲水聚合物试剂80ml、水溶液90ml、无机盐溶液95ml、磷酸缓冲盐溶液100ml，聚乙二醇亲水聚合物试剂选用PEG8000，工作时的浓度为50mg/ml；有效的保证外泌体分离工作的效率，操作简单，成本低；
S2：混合，把聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液和无机盐溶液倒入准备好的试剂盒中，使用磁力搅拌器搅拌5秒混匀，然后把生物液体倒入试剂盒中，再使用磁力搅拌器对混合液搅拌4分钟，混匀后试剂盒中的聚乙二醇亲水聚合物试剂在混合液中的浓度达到350mg/ml工作浓度；便于有效的增强外泌体沉淀分离效率和速度，得率高；
S3：静置沉淀，混匀后把混合液静置，温度为4℃、时间为30h，然后外泌体从生物体液中脱离出、沉淀；
S4：沉淀分离，对沉淀样品使用低速离心机进行低速离心处理，进行进一步沉淀，温度4℃、低速离心8分钟，离心力为2490xg，分离出外泌体；
S5：稀释杂质，采用含0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器搅拌混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤6次，稀释悬液杂质，0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液是由磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温－20、加水，然后加入浓盐酸调pH至7.4制备而成；便于有效的排出非外泌体杂质，显著提高外泌体的纯度；
S6：外泌体过滤，使用无菌过滤器对悬液杂质进行反复过滤3-5次，过滤杂质物，无菌过滤器的规格为0.55μm；
S7：外泌体收集，最后把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存。
本发明通过聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液、无机盐溶液和磷酸缓冲盐溶液的配合作用，实现了沉淀和过滤相组合的方式对外泌体进行分离，有效提高了外泌体磁分离效率，同时避免了传统沉淀方法造成分离后的外泌体纯度低、杂质多的问题，并且分离得到的外泌体结构完整，能大程度地排除非外泌体杂质，外泌体的得率更高，操作简单、成本低、得率高，同时可以保证较高的纯度、降低实验成本。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (4)

1.一种用于分离外泌体的方法，其特征在于：具体按照如下操作步骤：
S1：材料准备，生物体液30-100ml、试剂盒、磁力搅拌器、低速离心机、无菌过滤器、储罐、聚乙二醇亲水聚合物试剂20-80ml、水溶液30-90ml、无机盐溶液30-95ml、磷酸缓冲盐溶液50-100ml；
S2：混合，把聚乙二醇亲水聚合物试剂、水溶液和无机盐溶液倒入准备好的试剂盒中，使用磁力搅拌器搅拌1-5秒混匀，然后把生物液体倒入试剂盒中，再使用磁力搅拌器对混合液搅拌1-4分钟，混匀后试剂盒中的聚乙二醇亲水聚合物试剂在混合液中的浓度达到20mg/ml-350mg/ml工作浓度；
S3：静置沉淀，混匀后把混合液静置，温度为0-4℃、时间为1-30h，然后外泌体从生物体液中脱离出、沉淀；
S4：沉淀分离，对沉淀样品使用低速离心机进行低速离心处理，进行进一步沉淀，温度1-4℃、低速离心4-8分钟，离心力为200xg-2490xg，分离出外泌体；
S5：稀释杂质，采用含0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液加入沉淀的外泌体混合液中，使用磁力搅拌器搅拌混匀，稀释沉淀物，并重复使用磷酸缓冲盐溶液洗涤3-6次，稀释悬液杂质；
S6：外泌体过滤，使用无菌过滤器对悬液杂质进行反复过滤3-5次，过滤杂质物；
S7：外泌体收集，最后把最终所得的外泌体置入储罐中进行放置，温度条件为-80℃低温保存。
2.根据权利要求1所述的一种用于分离外泌体的方法，其特征在于：步骤S1中，聚乙二醇亲水聚合物试剂选用PEG8000，工作时的浓度为50mg/ml。
3.根据权利要求1所述的一种用于分离外泌体的方法，其特征在于：步骤S5中，0.05％吐温－20的pH7.4的磷酸缓冲盐溶液是由磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾、吐温－20、加水，然后加入浓盐酸调pH至7.4制备而成。
4.根据权利要求1所述的一种用于分离外泌体的方法，其特征在于：步骤S6中,无菌过滤器的规格为0.55μm。
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