CN108865976B - 一种离散汲取收集外泌体(exosome)的方法及试剂 - Google Patents

一种离散汲取收集外泌体(exosome)的方法及试剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种离散汲取收集外泌体的方法及试剂，所述试剂包括PBS缓冲液、固定液及原水，所述方法包括：首先用一种抗凝溶剂将外泌体与DNA/RNA的大分子团分离，然后分级离心，除去DNA/RNA等大分子团，留存纯度较高的外泌体。其优点在于：(1)本发明提取外泌体的试剂可高效提取外泌体，收率高、纯度高。(2)本发明操作简单，成本低，对实验操作人员技术、实验设备要求低，有很好的应用前景，拓展了外泌体研究领域，对于外泌体的研究有重大意义。

Description

一种离散汲取收集外泌体(exosome)的方法及试剂
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域，具体地说，是一种离散汲取收集外泌体(exosome)的方法及试剂。
背景技术
1983年，外泌体首次于绵羊网织红细胞中被发现，1987年Johnstone将其命名为“exosome”。现今，其特指直径在40-100nm的盘状囊泡。多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体。其主要来源于细胞内内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中。
外泌体富含胆固醇和鞘磷脂。2007年，Valadi等发现鼠的肥大细胞分泌的exosome可以被人的肥大细胞捕获，并且其携带的mRNA成分可以进入细胞浆中可以被翻译成蛋白质，不仅仅是mRNA，exosomes所转移的microRNA同样具有生物活性，在进入靶细胞后可以靶向调节细胞中mRNA的水平。这一发现使得研究人员对exosome的研究热情激增，截止目前已经通过286项研究发现了41860种蛋白质、2838种microRNA、3408种mRNA。
为研究外泌体(exosome)人们探索了多种提取外泌体(exosome)的方法。
外泌体的提取主要包括以下几种方式：
一是超速离心法，这是目前外泌体提取最常用的方法,此种方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
二是过滤离心，这种操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。
三是密度梯度离心法，用此种方法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
四是免疫磁珠法，这种方法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验。
五是PS亲和法，该方法将PS(磷脂酰丝氨酸)与磁珠结合，利用亲和原理捕获外泌体囊泡外的PS。该方法与免疫磁珠法相似，获得的外泌体形态完整，纯度最高。由于不使用变性剂，不影响外泌体的生物活性，外泌体可用于细胞共培养和体内注射。2016.9《ScientificReports》杂志发表了该方法最新数据，表明PS法可提取相当高纯度的外泌体。
六是色谱法，这种方法分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
中国专利申请：CN108251373A公开了一种小鼠脑片外泌体的提取方法，本方法是通过对小鼠脑片进行培养，对培养基中的外泌体进行收集提取，从而获得保证后续实验的外泌体样品。此方法提供了一种目前新的外泌体收集方法，并结合外泌体提取试剂盒，优化了目前外泌体的提取方法，使脑组织中外泌体得以提取，填补了技术空白。
中国专利申请：CN107525818A公开了从一种从尿液中分离外泌体的方法及试剂。本发明提供如下试剂：聚乙二醇与三(2-羧乙基)膦(TCEP)混合溶液。本发明的实验方法依次包括：先将尿液进行离心处理；再将本发明试剂按照一定的配比混匀；之后将混合的试剂按照一定的比例加入到尿液中，混匀；4℃，静置过夜；次日，离心处理后，弃上清，所得沉淀即为外泌体，但该发明只针对尿液中的外泌体。关于本发明一种离散汲取收集外泌体(exosome)的方法及试剂目前还未见报道。
发明内容
本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供一种离散汲取收集外泌体的试剂。
本发明的第二个的目的是针对现有技术的不足，提供一种离散汲取收集外泌体的试剂的用途。
本发明的第三个的目的是针对现有技术的不足，提供一种离散汲取收集外泌体的试剂的使用方法。
为实现上述第一个目的，本发明采取的技术方案是：
一种离散汲取收集外泌体的试剂，所述试剂包括PBS缓冲液、固定液及原水组成的试剂。
作为本发明的一个优选实施方案，所述试剂是水溶液。
作为本发明的一个优选实施方案，所述PBS缓冲液中含有2/10的肝素钠。
作为本发明的一个优选实施方案，所述固定液是浓度为2.5％的戊二醛固定液。
为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是：
如上任一所述试剂在提取外泌体中的应用。
作为本发明的一个优选实施方案，所述外泌体为尿液、眼睛房水、血液、唾液、腹水以及细胞培养液中的外泌体。
为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是：
一种离散汲取收集外泌体的试剂的使用方法，包括以下步骤：
(1)取装有待检样品的培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(2)使用如上所述试剂，按照待检样品与PBS缓冲液体积比为1:1量取PBS缓冲液，将PBS缓冲液加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s-20s；
(3)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于4℃，800转工艺参数下离心5min；
(4)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入100ul固定液，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(5)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀即可，若无白色沉淀，则再于12000转离心10min；
(6)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液，再加入200ul固定液，混匀后震荡10s；
(7)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定30min；
(8)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000或2500转的离心机中离心10min；
(9)将1mlPBS缓冲液加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(10)将步骤(9)制备的溶液在2000/2500转的离心离心机中离心10min；
(11)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，即可完成标本外泌体提取。
作为本发明的一个优选实施方案，所述固定液终浓度在整个液体体积比为0.5％，固定液固定时间为30分钟。
在细胞培养过程中，是静置在培养箱里面的，在静置的环境下任何只需有自身有微重力的物体，被地球引力影响都会下沉至载体物上面。然而由于外泌体的质体近于零重力，所以只需要轻微晃动，外泌体(exosome)即会在培养液中悬浮，又由于外泌体(exosome)依附与(DNA/RNA)的大分子团的作用，与之同步沉淀。所以，在收集外泌体(exosome) 时必须要轻摇晃动培养液。
由于细胞在培养过程中分泌出外泌体(exosome)的同时还会有其他蛋白产生，包括培养液里原有的血清蛋白，混合产生很多带有黏附的杂物、外泌体(exosome)粘附的(DNA/RNA) 等，为了使外泌体(exosome)能够形成独立单位，必须对外泌体(exosome)进行漂洗，如果用单纯的PBS缓冲液来漂洗，很难在短时间里溶解蛋白胞浆的粘稠度。所以，我们选用医用肝素钠注射液(安*瓶装，2ml：12500单位)稀释混合在PBS缓冲液里，以帮助PBS 缓冲液在漂洗过程中起到抗凝作用，加之用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡漂洗，能够成功的分离外泌体(exosome)与(DNA/RNA)等胞浆的粘连，使外泌体(exosome)的独立单位形成。
选用800转，5min离心的目的是需要在尽可能的短时间里面除去杂质，保留外泌体(exosome)结构的完整，时间过长会影响外泌体(exosome)自溶。
取上清置换新的离心管里的目的是去除沉淀杂质，以免外泌体(exosome)在电镜制样过程中，含带有除外泌体(exosome)以外的杂样结构，加入100ul以内的2.5％浓度戊二醛固定液，及时进行预固定。
加入固定液固定，但是固定液对组织有一定的收缩率，所以我们的实验证明，固定液终浓度在整个液体体积比为0.5％，固定时间以30分钟为佳。
固定到时间后，以2000或2500转离心10min，常温，除尽上清，加1mlPBS缓冲液重悬，此步骤有2个目的：(1)漂洗组织的同时含有渗透压的缓冲液可以保护外泌体(exosome)减少自溶；(2)为组织制备电镜观察前过度到纯净水做准备。
本发明优点在于：
1、本发明提取外泌体的试剂可高效提取外泌体，收率高、纯度高。
2、为了解决如何从组织液中分离提取得到较多且纯度较高的分泌体，本发明对传统的方法进行了优化和创新，本发明操作简单，成本低，对实验操作人员技术、实验设备要求低，有很好的应用前景，拓展了外泌体研究领域，对于外泌体的研究有重大意义。
附图说明
附图1是从人体尿液中提取外泌体的扫描电镜图。
附图2是从人体眼睛房水中提取外泌体的扫描电镜图。
附图3是从人体眼睛房水中提取外泌体的扫描电镜图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1一种离散汲取收集外泌体(exosome)的试剂的使用方法
一种离散汲取收集外泌体的试剂的使用方法，包括以下步骤：
(1)取装有20ml待检样品的培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(2)将20mlPBS缓冲液加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s-20s；
(3)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于4℃，800转工艺参数下离心5min；
(4)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入100ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(5)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀出现；
(6)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液，再加入200ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，混匀后震荡10s；
(7)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定30min；
(8)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000转的离心机中离心10min；
(9)将1mlPBS缓冲液加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(10)将步骤(9)制备的溶液在2000转的离心离心机中离心10min；
(11)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，即完成标本外泌体提取。
实施例2人体尿液中离散汲取收集外泌体(exosome)
一、实验方法：
(1)取冻存尿液样本，37℃水浴解冻放置于培养皿中；
(2)取装有20ml待检样品的培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(3)将20mlPBS缓冲液加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s—20s；
(4)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于4℃，800转工艺参数下离心5min；
(5)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入100ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(6)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀出现；
(7)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液，再加入200ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，混匀后震荡10s；
(8)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定30min；
(9)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000转的离心机中离心10min；
(10)将1mlPBS缓冲液加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(11)将步骤(9)制备的溶液在2000转的离心离心机中离心10min；
(12)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，完成标本外泌体提取。
二、电镜检测
(1)首先吸取样品10ul滴加于铜网上沉淀1min；
(2)滤纸吸去浮液；
(3)吸取醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min；
(4)滤纸吸去浮液；
(5)常温干燥数分钟，上机；
(6)80kv-120kv成像。
三、实验结果
由图1电镜图结果显示：镜下可看到直径20-50nm的囊泡，粒子浓度约为2.35*1010/ml。通过本发明的方法及试剂可高效从人体尿液中提取外泌体，且提取到的外泌体纯度高。
实施例3人体眼睛房水中离散汲取收集外泌体(exosome)
一、实验方法：
(1)取冻存眼睛房水样本，37℃水浴解冻放置于培养皿中；
(2)取装有20ml待检样品的培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(2)将20mlPBS缓冲液加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s—20s；
(3)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于4℃，800转工艺参数下离心5min；
(4)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入100ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(5)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀出现；
(6)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液，再加入200ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，混匀后震荡10s；
(7)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定30min；
(8)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000转的离心机中离心10min；
(9)将1mlPBS缓冲液加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(10)将步骤(9)制备的溶液在2000转的离心离心机中离心10min；
(11)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，完成标本外泌体提取。
二、电镜检测
(1)首先吸取样品10ul滴加于铜网上沉淀1min；
(2)滤纸吸去浮液；
(3)吸取醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min；
(4)滤纸吸去浮液；
(5)常温干燥数分钟，上机；
(6)80kv-120kv成像。
三、实验结果
由图2、图3电镜图结果显示：镜下可看到直径20-50nm的囊泡，粒子粒子浓度约为1.95*1010/ml，结果表明通过本发明的方法及试剂可高效从人体眼睛房水中提取外泌体，且提取到的外泌体纯度高。
实施例4
一、实验方法
1取样及分组
取冻存尿液样本，37℃水浴解冻；4℃，3000g，离心10分钟，取上清，分装于3个培养皿中，各20mL，编号依次为I，II，III；
2实验方法
编号I组进行如下操作：
(1)将培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(2)将20mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中含有2/10的肝素钠)加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s—20s；
(3)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于4℃，800转工艺参数下离心5min；
(4)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入100ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(5)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀出现；
(6)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中含有2/10的肝素钠)，再加入200ul浓度为2.5％的戊二醛固定液，固定时间为30分钟，混匀后震荡10s；
(7)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定30min；
(8)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000转的离心机中离心10min；
(9)将1mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中含有2/10的肝素钠)加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(10)将步骤(9)制备的溶液在2000转的离心离心机中离心10min；
(11)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，完成标本外泌体提取。
编号II组进行如下操作：
(1)将培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(2)将20mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中含有2/10的肝素钠)加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s—20s；
(3)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于4℃，800转工艺参数下离心5min；
(4)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入100ul浓度为3.5％的聚乙烯固定液，固定时间为30分钟，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(5)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀出现；
(6)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中含有2/10的肝素钠)，再加入200ul浓度为3.5％的聚乙烯固定液，固定时间为40分钟，混匀后震荡10s；
(7)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定40min；
(8)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000转的离心机中离心10min；
(9)将1mlPBS缓冲液加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(10)将步骤(9)制备的溶液在2000转的离心离心机中离心10min；
(11)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，完成标本外泌体提取。
编号III组进行如下操作：
(1)取冻存尿液样本，37℃水浴解冻放置于培养皿中；
(2)取装有20ml待检样品的培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(3)将20mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中不含有肝素钠)加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s—20s；
(4)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于6℃，1000转工艺参数下离心7min；
(5)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入80ul浓度为3.5％的聚乙烯固定液，固定时间为40分钟，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(6)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀出现；
(7)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中不含有肝素钠)，再加入200ul浓度为3.5％的聚乙烯固定液，固定时间为40分钟，混匀后震荡10s；
(8)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定40min；
(9)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000转的离心机中离心10min；
(10)将1mlPBS缓冲液(PBS缓冲液中不含有肝素钠)加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(11)将步骤(9)制备的溶液在3000转的离心离心机中离心13min；
(12)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，完成标本外泌体提取。
二、实验检测
分别取编号I组、编号II组、编号III组所提取到的外泌体进行电镜检测，检测方法如下：
(1)首先吸取样品10ul滴加于铜网上沉淀1min；
(2)滤纸吸去浮液；
(3)吸取醋酸双氧铀10ul滴加于铜网上沉淀1min；
(4)滤纸吸去浮液；
(5)常温干燥数分钟，上机；
(6)80kv-120kv成像。
三、实验结果
提取外泌体的粒子大小及粒子浓度如表1所示：
表1各组粒子大小及粒子浓度
编号 I II III
粒径(nm) 20-50 35-55 55-75
粒子浓度(/ml) 2.35*10<sup>10</sup> 2.01*10<sup>9</sup> 1.96*10<sup>9</sup>
由表1实验结果显示：编号I组粒径最小，为20-50nm，编号II组粒径大于编号I组，小于编号III组；编号I组粒子浓度最大，为2.35*1010/ml，编号II组粒子浓度小于编号 I组，大于编号III组。
结果表明，编号I组使用本发明的试剂对人体尿液进行外泌体的提取，外泌体的含量更高，纯度更高。
需要说明的是，在细胞培养过程中，细胞是静置在培养箱里面的，在静置的环境下任何只需有自身有微重力的物体，被地球引力影响都会下沉至载体物上面，然而由于外泌体的质体近于零重力，所以只需要轻微晃动，外泌体(exosome)即会在培养液中悬浮，又由于外泌体(exosome)依附与(DNA/RNA)的大分子团的作用，与之同步沉淀，所以，在收集外泌体(exosome)时必须要轻摇晃动培养液。
由于细胞在培养过程中分泌出外泌体(exosome)的同时还会有其他蛋白产生，包括培养液里原有的血清蛋白，混合产生很多带有黏附的杂物、外泌体(exosome)粘附的(DNA/RNA) 等，为了使外泌体(exosome)能够形成独立单位，必须对外泌体(exosome)进行漂洗，如果用单纯的PBS来漂洗，很难在短时间里溶解蛋白胞浆的粘稠度。所以，我们选用医用肝素钠注射液(安*瓶装，2ml：12500单位)稀释混合在PBS溶液里，以帮助PBS在漂洗过程中起到抗凝作用，加之用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡漂洗，能够成功的分离外泌体(exosome)与(DNA/RNA)等胞浆的粘连，使外泌体(exosome)的独立单位形成。
选用800转，5min离心的目的是需要在尽可能的短时间里面除去杂质，保留外泌体(exosome)结构的完整，时间过长会影响外泌体(exosome)自溶。
取上清置换新的离心管里的目的是去除沉淀杂质，以免外泌体(exosome)在电镜制样过程中，含带有除外泌体(exosome)以外的杂样结构。加入100ul以内的2.5％浓度戊二醛固定液，及时进行预固定。
固定液终浓度在整个液体体积比为0.5％，固定时间以30分钟为佳。
固定到时间后，以2000或2500转离心10min，常温。除尽上清，加1mlPBS缓冲液重悬，此步骤有2个目的：(1)漂洗组织的同时含有渗透压的缓冲液可以保护外泌体(exosome)减少自溶；(2)为组织制备电镜观察前过度到纯净水做准备。
为了解决如何从组织液中分离提取得到较多且纯度较高的分泌体，本发明对传统的方法进行了优化和创新，本发明操作简单，成本低，对实验操作人员技术、实验设备要求低，有很好的应用前景，拓展了外泌体研究领域，对于外泌体的研究有重大意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (2)

1.一种离散汲取收集外泌体的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取装有待检样品的培养皿左右轻晃摇摆，使沉淀的外泌体(exosome)微囊泡悬浮，倾斜抽取收集适量培养液于离心管中；
(2)按照待检样品与PBS缓冲液体积比为1:1量取PBS缓冲液，将PBS缓冲液加入步骤(1)中的离心管中进行漂洗，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡10s—20s；
(3)取步骤(2)制备得到的溶液在离心机中于4℃，800转工艺参数下离心5min；
(4)取步骤(3)得到的溶液的上清液于新离心管中，加入100ul固定液，用50Hz漩涡混合器，涡旋震荡20s；
(5)将步骤(4)制备得到的溶液在8000转的离心机中，离心10min，见有白色沉淀即可，若无白色沉淀，则再于12000转离心10min；
(6)离心后弃上清，加入1mlPBS缓冲液，再加入200ul固定液，混匀后震荡10s；
(7)将步骤(6)得到的溶液于4℃放置固定30min；
(8)将步骤(7)得到的溶液在常温条件下，2000或2500转的离心机中离心10min；
(9)将1mlPBS缓冲液加入到上述制备的溶液中，混匀，震荡10s，准备送样；
(10)将步骤(9)制备的溶液在2000转的离心机中离心10min；
(11)取步骤(10)得到的溶液弃上清，加入200ul原水，将离心管置于冰盒管架上，冰盒放适量冰块，注意离心管壁不能接触到冰块，即可完成标本外泌体提取；
所述PBS缓冲液中含有2/10的肝素钠；所述固定液是浓度为2.5％的戊二醛固定液。
2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述外泌体为尿液、眼睛房水、血液、唾液、腹水以及细胞培养液中的外泌体。
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