CN102014934A - 间充质干细胞颗粒 - Google Patents

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Abstract

我们描述了一种由间充质干细胞分泌的且包含间充质干细胞的至少一项生物学特性的颗粒。该生物学特性可以包含间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的生物学活性，诸如心脏保护或梗死大小降低。该颗粒可以包含小囊泡或外来体。

Description

间充质干细胞颗粒
发明领域
本发明涉及发育、细胞生物学、分子生物学和遗传学领域。更具体而言，本发明涉及一种自胚胎干细胞衍生间充质干细胞的方法。
发明背景
与已经分化的细胞不同，干细胞具有分裂和自我更新或分化成表型上和功能上不同的子细胞的能力(Keller，Genes Dev.2005；19：1129-1155；Wobus和Boheler，Physiol Rev.2005；85：635-678；Wiles，Methods in Enzymology.1993；225：900-918；Choi等，Methods Mol Med.2005；105：359-368)。
间充质干细胞(MSC)是多能干细胞，其在治疗肌肉骨骼损伤、在心血管疾病中改善心脏功能和改善GVHD的严重程度上具有治疗功效的书面证据(Le Blanc和Pittenger，2005)。受到谱系限制，它们具有有限的但强烈的分化成间充质细胞类型(例如脂肪细胞、软骨细胞和骨细胞)的潜力，而且具有可忽视的畸胎瘤形成风险。移植的MSC的宿主免疫排斥常规地经由自体或同种异基因移植来避开。MSC可以从数种成人组织(包括骨髓(BM)、脂肪组织(ad)、脐带血)分离，并离体扩充。
已经在临床和临床前应用中使用间充质干细胞来治疗广泛的疾病1，2，包括肌肉骨骼组织生物工程3，4和心脏病5，6。MSC在临床和临床前应用中治疗广谱疾病以治疗广泛疾病[A1，A2](例如肌肉骨骼组织生物工程[A3，A4]和心脏病[A5，A6]中的GVHD[A1])的治疗能力已经归因于其分化成许多不同修复细胞类型的潜力。
然而，供它们分离用的组织的可得性仍然是限制性的，而且需要有风险的侵入规程，并且MSC的离体扩充虽然有意义，但是是有限的。然而，移植的MSC在受损伤的组织或器官中和以治疗相关数目分化成功能修复细胞的功效还没有充分地记录或证明。
新近的报告已经提示了这些修复效果的一些可能是由MSC分泌的旁分泌因子介导的7。假定这些因子经由旁分泌机制来促进动脉生成(arteriogenesis)8，在肠中支持干细胞隐窝9，提供保护不受缺血性肾10，11、心肌12-15和肢组织损伤16；支持和维持血细胞生成17，支持巨核细胞和前血小板形成18。
对“现有的”基于MSC的治疗选项(以可承担的成本、具有较好的质量控制和一致性)的需要没有得到满足。这对于针对损伤(诸如急性MI患者中的再灌注损伤)的时间敏感性保护是必要的。
发明概述
依照本发明的第一方面，我们提供了一种由间充质干细胞分泌且包含间充质干细胞的至少一项生物学特性的颗粒。
所述生物学特性可以包含间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的生物学活性。所述生物学活性可以包含心脏保护。所述颗粒可以能够降低梗死大小。
可以在心肌缺血和再灌注损伤的小鼠或猪模型中测定梗死的降低。
所述颗粒可以能够降低氧化应激。可以在过氧化氢(H2O2)诱导的细胞死亡的体外测定法中测定氧化应激的降低。
所述颗粒包含小囊泡。所述颗粒可以包含外来体。
所述颗粒可以含有间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)中的至少70％的蛋白质。所述蛋白质可以选自表D1中所显示的列表或者可以是表D2中所显示的基因的基因产物。
所述颗粒可以包含分子量大于100kDa的复合物。分子量大于100kDa的复合物可以包含小于100kDa的蛋白质。所述颗粒可以包含分子量大于300kDa的复合物。分子量大于100kDa的复合物可以包含小于300kDa的蛋白质。
所述颗粒可以包含分子量大于1000kDa的复合物。所述颗粒可以具有2nm和200nm之间的大小。所述颗粒可以具有50nm和150nm之间的大小。所述颗粒可以具有50nm和100nm之间的大小。
可以通过针对0.2μM滤器过滤和针对具有分子量截留10kDa的膜浓缩来测定颗粒的大小。可以通过电子显微术来测定颗粒的大小。
所述颗粒可以包含100nm以下的流体动力学半径。它可以包含约30nm和约70nm之间的流体动力学半径。它可以在约40nm和约60nm之间，诸如约45nm和约55nm之间。间充质干细胞颗粒可以包含约50nm的流体动力学半径。可以通过激光衍射或动态光散射来测定流体动力学半径。
所述颗粒可以包含选自下组的脂质：磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、神经酰胺、糖脂、脑苷脂、类固醇、胆固醇。胆固醇-磷脂比率可以大于0.3-0.4(mol/mol)。所述颗粒可以包含脂筏。
所述颗粒在非离子型去污剂，优选Triton-X100中可以是不可溶的。所述颗粒可以是这样的，即在用非离子型去污剂处理所述颗粒时，具有所规定的分子量的蛋白质基本上保留在具有所规定的分子量的复合物中。
所述颗粒可以对环糊精，优选20mM环糊精敏感。所述颗粒可以是这样的，即用环糊精处理引起所规定的复合物基本上溶解。
所述颗粒可以包含核糖核酸(RNA)。所述颗粒可以具有1.9的吸光度比率(260∶280nm)。所述颗粒可以包含选自下组的表面抗原：CD9、CD109和thy-1。
依照本发明的第二方面，提供了一种生成依照任一项前述权利要求的颗粒的方法，该方法包括自间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)分离所述颗粒。
所述方法可以包括基于分子量、大小、形状、组成或生物学活性将所述颗粒与其它成分分开。
所述重量可以选自上文所列的重量。所述大小可以选自上文所列的大小。所述组成可以选自上文所列的组成。所述生物学活性可以选自上文所列的生物学活性。
依照本发明的第三方面，提供了一种生成如上文所描述的颗粒的方法。所述方法可以包括获得间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)。它可以包括浓缩所述间充质干细胞条件化培养基。可以通过在大于1000kDa膜上超滤来浓缩间充质干细胞条件化培养基。所述方法可以包括将浓缩的间充质干细胞条件化培养基进行大小排阻层析。可以采用TSK保护柱SWXL，6x 40mm或TSK凝胶G4000SWXL，7.8x300mm柱。所述方法可以包括选择UV吸收级分，例如在220nm处，其展现出动态光散射。可以通过准弹性光散射(QELS)检测器来检测动态光散射。所述方法可以包括收集以11-13分钟，诸如12分钟的保留时间洗脱的级分。
依照本发明的第四方面，我们提供了一种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂、稀释剂或载体一起的如描述的颗粒。
作为本发明的第四方面，提供了所述颗粒或所述药物组合物，用于治疗疾病的方法。
依照本发明的第五方面，我们提供了所述颗粒用于制备药物组合物的用途，所述药物组合物用于治疗疾病。
在第六方面中，本发明提供了所述颗粒在治疗个体中的疾病的方法中的用途。
所述疾病可以选自下组：心力衰竭(cardiac failure)、骨髓疾病(bonemarrow disease)、皮肤病(skin disease)、烧伤(burns)和变性性疾病(degenerativedisease)诸如糖尿病(diabetes)、阿耳茨海默氏病(Alzheimer’s disease)、帕金森氏病(Parkinson’s disease)和癌症。
所述疾病可以选自下组：心肌梗死(myocardial infarction)、皮肤伤口(cutaneous wound)、皮肤病学病症(dermatologic disorder)、皮肤病学损伤(dermatological lesion)、皮炎(dermatitis)、银屑病(psoriasis)、湿疣(condyloma)、疣(verruca)、血管瘤(hemangioma)、瘢痕疙瘩(keloid)、皮肤癌(skin cancer)、特应性皮炎(atopic dermatitis)、贝切特病(Behcet disease)、慢性肉芽肿性疾病(chronic granulomatous disease)、皮肤T细胞淋巴瘤(cutaneous T celllymphoma)、溃疡(ulceration)、以诱导炎症的初始损伤和导致慢性组织重塑的免疫失调为特征的病理学状况(a pathological condition characterised by initialinjury inducing inflammation and immune dysregulation leading to chronic tissueremodeling)包括纤维化(fibrosis)和功能丧失、肾缺血性损伤(renal ischemicinjury)、囊性纤维化病(cystic fibrosis)、鼻窦炎(sinusitis)和鼻炎(rhinitis)或整形外科疾病(orthopaedic disease)。
可以使用所述颗粒来帮助个体中的伤口愈合、瘢痕减少、骨形成、骨移植物或骨髓移植。
可以在下列各项中使用所述颗粒：(i)在选自下列任一项或多项的途径的调节中：由ρGTP酶进行的细胞骨架调节、细胞周期、整联蛋白信号传导途径、由趋化因子和细胞因子信号传导途径介导的炎症、FGF信号传导途径、EGF受体信号传导途径、血管发生、血纤维蛋白溶酶原激活级联、凝血、糖酵解、泛素蛋白酶体途径、从头嘌呤生物合成、TCA循环、苯丙氨酸生物合成、血红素生物合成；(ii)在包括下列任一项或多项的过程的调节中：细胞结构和运动性、细胞结构、细胞通信、细胞运动性、细胞粘着、胞吞、有丝分裂、胞吐、胞质分裂、细胞周期、免疫和防御、细胞因子/趋化因子介导的免疫、巨噬细胞介导的免疫、粒细胞介导的免疫、配体介导的信号传导、细胞因子和趋化因子介导的信号传导途径、信号转导、细胞外基质蛋白介导的信号传导、生长因子稳态、受体蛋白质酪氨酸激酶信号传导途径、细胞粘着介导的信号传导、细胞表面受体介导的信号转导、JAK-STAT级联、抗氧化和自由基去除、稳态、应激响应、血液凝固、发育过程、中胚层发育、骨骼发育、血管发生、肌肉发育、肌肉收缩、蛋白质代谢和修饰、蛋白酶解、蛋白质折叠、蛋白质复合物装配、氨基酸活化、细胞内蛋白质运输、其它蛋白质靶向和定位、氨基酸代谢、蛋白质生物合成、蛋白质二硫化物异构酶反应、碳水化合物代谢、糖酵解、戊糖磷酸支路、其它多糖代谢、嘌呤代谢、磷酸盐代谢的调节、维生素代谢、氨基酸生物合成、前mRNA加工、翻译调节、mRNA剪接；或(iii)在包括下列任一项或多项的功能的供应中：信号传导分子、趋化因子、生长因子、细胞因子、白介素、其它细胞因子、细胞外基质、细胞外基质结构蛋白、其它细胞外基质、细胞外基质糖蛋白、蛋白酶、金属蛋白酶、其它蛋白酶、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、氧化还原酶、脱氢酶、过氧化物酶、蛋白伴侣、陪伴蛋白、Hsp 70家族蛋白伴侣、其它蛋白伴侣、合成酶、合酶和合成酶、选择的钙结合蛋白、氨酰基-tRNA合成酶、裂合酶、异构酶、其它异构酶、ATP合酶、水合酶、转氨酶、其它裂合酶、其它酶调节物、选择的调节分子、肌动蛋白结合细胞骨架蛋白、细胞骨架蛋白、非运动性肌动蛋白结合蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白、膜联蛋白、微管蛋白、细胞粘着分子、肌动蛋白结合动力蛋白、中间丝、核糖核蛋白、核糖体蛋白质、翻译因子、其它RNA结合蛋白、组蛋白、钙调蛋白相关蛋白、小囊泡外壳蛋白。
在本发明的第七方面中，提供了一种用于投递颗粒的投递系统，其包含与可操作用于将所述颗粒投递至目标的分配器一起的颗粒源。
依照本发明的第八方面，我们提供了所述投递系统在将颗粒投递至目标的方法中的用途。
除非另有指明，本发明的实践会采用化学、分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，它们在本领域普通技术人员的能力内。在文献中解释了此类技术。参见例如J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis，1989，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第二版，第1册-第3册，Cold SpringHarbor Laboratory Press；Ausubel，F.M.等(1995和定期增补；CurrentProtocols in Molecular Biology，第9章、第13章、和第16章，John Wiley&Sons，New York，N.Y.)；B.Roe，J.Crabtree和A.Kahn，1996，DNA Isolation andSequencing：Essential Techniques，John Wiley&Sons；J.M.Polak和James O’D.McGee，1990，Oligonucleotide Synthesis：A Practical Approach，Irl Press；D.M.J.Lilley和J.E.Dahlberg，1992，Methods of Enzymology：DNA Structure Part A：Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology，AcademicPress；Using Antibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol NO.I byEdward Harlow，David Lane，Ed Harlow(1999，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，ISBN 0-87969-544-7)；Antibodies：A Laboratory Manual by Ed Harlow(编)，David Lane(编)(1988，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ISBN0-87969-314-2)，1855；及Lab Ref：A Handbook of Recipes，Reagents，and OtherReference Tools for Use at the Bench，Jane Roskams和Linda Rodgers编，2002，Cold Spring Harbor Laboratory，ISBN 0-87969-630-3。通过提及而将这些通用教科书之每篇收入本文。
附图简述
图1。心肌梗死大小。对用非CM(A)、CM(B)或盐水(C)处理的猪的心脏进行伊文思蓝(蓝色)和TTC(红色)染色的代表性图片。图D和图E中分别显示了心肌梗死大小量化为左心室(LV)和危险区(area at risk，AAR)的百分比。非CM，n＝9；CM，n＝9；盐水，n＝8。
图2。局部和全局收缩功能。局部的收缩壁增厚，如通过用非CM、CM或盐水处理的猪中的梗死区的超声波心动描记术(echocardiography)所评估的(A)。图B中显示了全局收缩功能，即超声心动图分数面积缩短(FAS)。非CM，n＝9；CM，n＝9；盐水，n＝8。*p＜0.05对非CM和盐水。
图3。氧化应激。在CM或非CM中且用H2O2处理的CEM细胞的存活。(*p＜0.05，A)。条件化培养基保护细胞免于由H2O2诱导的死亡。为了在体内评估氧化应激，针对8-OHdG(即细胞核氧化应激的一种产物)对来自用非CM(B)、CM(C)、或盐水(D)处理的猪的梗死区切片染色。以200x放大率评估8-OHdG阳性细胞核的量化，并描绘于图E中。还是在体内，CM降低氧化应激。非CM，n＝9；CM，n＝9；盐水，n＝8。
图4。TGF-β信号传导和凋亡。用非CM、CM或盐水处理的猪中的磷酸化SMAD 2(A，B)和活性胱天蛋白酶3(C，D)的Western印迹。β-微管蛋白作为加载对照评估，并且没有在组间的β-微管蛋白表达中找到差异(E)。非CM，n＝9；CM，n＝9；盐水，n＝8。
图5。CM级分的心脏保护特性。用盐水、CM的小于1000kD级分或未分级的CM处理的小鼠中的心肌梗死大小量化。与经盐水处理的动物相比，未分级的条件化培养基显著降低心肌梗死大小。然而，小于1000kDa级分不然，这指明心脏保护因子大于1000kDa。盐水，n＝10；小于1000kD，n＝8；未分级的，n＝12。*p＜0.01对盐水。
图6。将由hESC-MSC HuES9.E1细胞条件化3天的化学成分确定的培养基过滤流过0.22μ滤器。通过过滤流过具有10kD MW截留的膜将条件化培养基(CM)浓缩25倍。然后将浓缩的CM离心流过具有100kD或300kD MW截留的膜，产生4∶1(体积∶体积)滤液比保留物比率。以5∶4∶1的体积比加载未分级的CM、滤液和保留物样品。
图7。在过滤流过具有100kD MW截留的膜后的滤液中的成分的身份。a)滤液中的蛋白质成分对非条件化培养基(NCM)中的蛋白质成分的比较。将条件化培养基(CM)，即CM后的滤液过滤流过具有100kD MW截留的膜(100kD滤液)，并将NCM在SDS-PAGE上分开。用银对凝胶染色以显现蛋白质条带；b)将CM过滤流过100kDMW截留膜以产生4∶1的保留物比滤液体积比。将保留物、滤液、和化学成分确定的培养基中的不同蛋白质补充物，即胰岛素-转铁蛋白-含硒蛋白质、FGF2、EGF和PDGF AB在SDS-PAGE上分开。以4∶1的体积比加载保留物和滤液。
图8。生物学材料的相对大小和膜中的孔大小。从
Figure BPA00001248880800071
实验室翻印。
图9。缺血/再灌注后的小鼠中的相对AAR。通过缝合线结扎30分钟来进行左冠状动脉(LCA)阻塞，从而诱导心肌梗死，并通过除去缝合线来启动再灌注。再灌注前5分钟，通过尾静脉注射20μl未分级的MSC-CM(10-220nm)、20μl小于100或1,000kD级分、4μl大于1000kD保留物或盐水来处理小鼠。24小时后，切出心脏。切出前，通过再结扎LCA，然后经由主动脉灌注伊文思蓝来测定危险区(AAR)。AAR定义为不被染料染色的面积，并且表示为左心室壁面积的百分比。
图10。条件化培养基和分级的条件化培养基对缺血/再灌注后的小鼠中的相对梗死大小的影响。切出心脏后，24小时后使用TTC来评估梗死大小，并表示为AAR的百分比。
图11。使用电子显微术来观察直径在50-100nm之间的物理实体。
图12。用Triton X-100处理后的CM的大小分级，用最终的0.5或1.0％(v/v)TritonX-100处理CM达30分钟，然后通过过滤流过具有MW截留100kD的膜来分级以产生4∶1的滤液∶保留物体积比。
图13。自MS/MS分析找到的蛋白质，其对于来自不同细胞类型的外来体是常见的44。
图14。CM级分的心脏保护特性。用盐水、HEK293条件化培养基、未分级的hESC-CM、用100kDa、300kDa、500kDa、和1000kDa的MWCO过滤的CM或针对具有CM的100kDa级分的MWCO的膜浓缩50倍的CM或未分级的CM处理的小鼠中的心肌梗死大小量化。
图15。免疫沉淀。用抗CD81或小鼠IgG作为阴性对照免疫沉淀的CM。通过使用针对CD9、Alix、Tsp-1、丙酮酸激酶和SOD1的抗体进行的Western印迹杂交来分析免疫沉淀物和上清液。
图16。CM的超速离心。通过过滤流过具有500kDa的MWCO的膜来使CM浓缩5倍。以200,000g将保留物和未过滤的CM超速离心2小时。通过Western印迹对上清液和沉淀物分析CD9的存在。第1道-第3道：不同蛋白质浓度的CM。第4道和第5道：未过滤的CM超速离心后的沉淀物(P)和上清液(S)。第6道：将CM过滤流过具有500kDa的MWCO的膜后的保留物。第7道-第8道：保留物超速离心后的沉淀物(P)和上清液(S)。第9道：将CM过滤流过具有500kDa的MWCO的膜后的滤液。
图17。蔗糖梯度密度上的分级。通过在SW60Ti离心管中使浓度22.8-60％(w/v)的14种蔗糖溶液成层来制备蔗糖密度梯度，其中最浓的溶液在超速离心管的底部。在梯度的顶部加载样品，并以200,000X g，4℃在SW60Ti转子(Beckman Coulter Inc.)中超速离心16.5小时。自蔗糖梯度的顶部至底部收集13种级分。通过称量固定体积的每种级分来计算每种级分的密度。然后通过Western印迹分析来分析级分，并探查丙酮酸激酶、CD9、CD81和SOD1。在相似的梯度上分级蛋白质标准品分子量标志物，并在图的底部指示标志物在蔗糖梯度的不同级分中的分布。a)将CM分级，b)用溶解缓冲液处理CM，之后在蔗糖梯度上分级。
图18。CM的胰蛋白酶处理。用胰蛋白酶对CM消化0、0.5、2、10和20分钟。对经部分消化的CM分析CD9和SOD1的存在。
图19。对CM中RNA的分析。(a，b)自MSC和MSC-CM提取RNA。将纯化的RNA变性，并分别在乙二醛琼脂糖凝胶和尿素-PAGE上分开。(c)用PBS、环糊精、溶解缓冲液或磷脂酶A2处理等体积的CM。对未处理的和经处理的CM提取RNA。将RNA在尿素-PAGE上分开。(d)用RNA酶III处理来自CM的RNA，并将经处理的RNA与未处理的RNA平行地在尿素-PAGE上分开。通过用溴化乙啶染色来显现凝胶中的RNA。
图20。CM中的RNA密度。在蔗糖密度梯度平衡离心上分级CM、用溶解缓冲液预处理的CM和RNA MW标准品后，如图4中所描绘的，对每种级分提取RNA。a)针对级分号将每份样品中的每种级分的相对RNA收率绘图。相对于每个梯度中任意设置为100％的最高RNA浓度来标准化相对浓度。b)将自每种级分提取的RNA在尿素-PAGE上分开。
图21。RNA不在CD81+外来体中。如图2中所描绘的那样实施CD81免疫沉淀，其也沉淀CD9。对免疫沉淀物和上清液提取RNA，并将提取物在尿素-PAGE上分开，并通过溴化乙啶染色来显现。
图22。对CM中的miRNA的微阵列分析。将来自MSC和CM的RNA样品与微阵列芯片杂交，所述微阵列芯片含有Sanger miRBase Release 10.1中所列miRNA转录物的探针。使用每种RNA样品的两个生物学重复来实施杂交。a)在MSC中检测出149种miRNA，而在CM中检测出63种。这些之中，47种在MSC和CM两者中以相似的水平表达。16种在CM中但不在MSC中以可检测的水平表达，而47种在MSC中但不在CM中检出。b)基于微阵列芯片上的杂交信号，指导miRNA对其反指导miRNA的相对表达水平。
图23。CM和NCM的HPLC分级。使用BioSep S4000，7.8mm x 30cm柱在HPLC上分级CM和NCM。用具有150mM NaCl pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液洗脱CM或NCM中的成分。洗脱模式是等度的，并且运行时间是40分钟。用设置于220nm的UV-可见光检测器来监测洗脱液。自UV-可见光检测器积分每个峰的％峰下面积。
发明详述
本发明基于证明了人ESC衍生的间充质干细胞(MSC)经由分泌的直径约50-100nm的大复合物来介导心脏保护效果。因此，此类复合物或颗粒可以替换细胞自身用于治疗手段，包括用于心脏保护。
实施例描述了对这些复合物的蛋白质组分析，揭示了外来体相关蛋白(例如也共免疫沉淀的CD81、CD9和Alix)、和分别展现出与膜结合蛋白和膜包囊蛋白一致的去污剂敏感性蛋白水解的膜和胞质蛋白质的存在。
实施例进一步证明了这些颗粒或复合物的其它特性。我们显示了此类颗粒或复合物的蛋白质具有1.016-1.215g/ml的不依赖于MW的沉降密度，其在用膜溶解缓冲剂处理后回复成MW依赖性密度。分泌物还在富含胆固醇的脂质小囊泡中含有RNA(小于300nt)。HPLC分级和动态光散射研究进一步指明分泌物中在1-1000nm的流体动力学半径(rh)范围内的唯一可检测颗粒具有45-55nm的rh。
与膜脂(例如胆固醇鞘磷脂和磷脂酰胆碱)的存在一起，这些观察结果表明分泌物中的心脏保护性复合物是外来体或分泌性脂质小囊泡。
这些间充质干细胞颗粒、复合物或外来体可以用于多种目的，诸如治疗或预防心脏病(cardiac disease，heart disease)，诸如缺血(ischaemia)、心脏炎症(cardiac inflammation)或心力衰竭(heart failure)。它们也可以用于灌注损伤后的修复。
颗粒
我们描述了一种可衍生自间充质干细胞(MSC)的颗粒。
该颗粒可以通过数种手段之任一种，例如通过自MSC分泌、出芽或分散而可衍生自MSC。例如，可以自MSC生成、渗出、发出或脱落所述颗粒。若MSC在细胞培养中，则可以将颗粒分泌入细胞培养基中。
颗粒可以特别包含小囊泡。颗粒可以包含外来体。本文所描述的颗粒可以包含本文中所描述的外来体的任何一种或多种特性。
颗粒可以包含由脂双层限定的小囊泡或变平的球体。颗粒可以包含40-100nm的直径。可以通过内体膜的向内出芽来形成颗粒。颗粒可以具有约1.13-1.19g/ml的密度，而且可以在蔗糖梯度上漂浮。颗粒可以富含胆固醇和鞘磷脂，和脂筏标志物，诸如GM1、GM3、Flotillin和src蛋白质激酶Lyn。颗粒可以包含间充质干细胞或间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)中存在的一种或多种蛋白质，诸如MSC或MSC-CM特征性或特异性的蛋白质。它们可以包含RNA，例如miRNA。
我们提供了一种颗粒，其包含MSC或通过培养MSC来条件化的培养基中找到的一种或多种基因或基因产物。颗粒可以包含由MSC分泌的分子。为了例如治疗或预防疾病，可以使用此类颗粒及其中包含的任何分子(特别包括蛋白质或多肽)的组合来补充MSC或由MSC条件化的培养基的活性或替换MSC或由MSC条件化的培养基。
颗粒可以包含细胞骨架中找到的胞质蛋白例如微管蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白，胞内膜融合和运输例如膜联蛋白和rab蛋白，信号转导蛋白例如蛋白质激酶、14-3-3和异源三聚体G蛋白，代谢酶例如过氧化物酶、丙酮酸和脂质激酶、和烯醇化酶-1和四次跨膜蛋白(Tetraspanin)家族例如CD9、CD63、CD81和CD82。特别地，颗粒可以包含一种或多种四次跨膜蛋白。颗粒可以包含mRNA和/或微小RNA。
如在本文件中所使用的，术语“颗粒”可以理解为指离散的实体。颗粒可以是自间充质干细胞(MSC)或间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)可分离的某物。颗粒可以至少负责MSC或MSC-CM的一种活性。颗粒可以负责并实施MSC或MSC-CM的基本上大多数或所有功能。例如，颗粒可以是MSC或MSC-CM的替代物(或生物学替代物)。
颗粒可以用于可利用MSC或MSC-CM的任何治疗目的。
优选地，颗粒具有间充质干细胞的至少一项特性。颗粒可以具有生物学特性，诸如生物学活性。颗粒可以具有MSC的任何生物学活性。颗粒可以例如具有MSC的治疗或修复活性。
实施例显示了由MSC条件化的培养基(诸如间充质干细胞条件化培养基或MSC-CM，如下文所描述的)包含MSC的生物学活性，而且能够替换MSC自身。因此，MSC的生物学特性或生物学活性可以对应于间充质干细胞条件化培养基的生物学特性或活性。因而，颗粒可以包含间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的一种或多种生物学特性或活性。
间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)
可以如下获得条件化细胞培养基，诸如间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)，即在细胞培养基中培养间充质干细胞(MSC)、其后代或自其衍生的细胞系；并分离细胞培养基。可以通过包括通过分散胚胎干(ES)细胞集落获得细胞的方法来生成间充质干细胞。可以在包含FGF2的无血清培养基中在没有共培养的情况中增殖细胞或其后代。
间充质干细胞颗粒
可以以许多方式生成或分离颗粒。此类方法可以包括自间充质干细胞(MSC)分离颗粒。此类方法可以包括自间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)分离颗粒。
可以例如通过基于颗粒的任何特性与无关成分分开来分离颗粒。例如，可以基于分子量、大小、形状、组成或生物学活性来分离颗粒。
可以在分离过程中、前或后将条件化培养基过滤和/或浓缩。例如，它可以过滤流过膜，例如具有大小或分子量截留的膜。它可以进行切向力过滤或超滤。
例如，可以使用用具有合适的分子量或大小截留的膜进行的过滤，如本文件中别处的分子量测定法中所描述的。
可以对条件化培养基(任选地进行过滤和/或浓缩)进行进一步的分离手段，诸如柱层析。例如，可以使用用各种柱的高效液相层析(HPLC)。柱可以是大小排阻柱或结合柱。
可以在间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的分级过程中使用颗粒的一种或多种特性或生物学活性来追踪其活性。作为一个例子，可以使用光散射、折射率、动态光散射或UV-可见光检测器来跟随颗粒。例如，可以在分级过程中使用治疗活性，诸如心脏保护活性来追踪活性。
以下段落提供了如何可以获得间充质干细胞颗粒，诸如外来体的具体例子。
可以通过在培养基中培养间充质干细胞以使其条件化来生成间充质干细胞颗粒。间充质干细胞可以包含HuES9.E1细胞。培养基可以包含DMEM。DMEM可以是这样的，即其不包含酚红。培养基可以补充有胰岛素、转铁蛋白、或含硒蛋白质(ITS)，或其任何组合。它可以包含FGF2。它可以包含PDGFAB。FGF2的浓度可以是约5ng/ml FGF2。PDGF AB的浓度可以是约5ng/ml。培养基可以包含谷氨酰胺-青霉素-链霉素或b-巯基乙醇，或其任何组合。
可以将细胞培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更多天，例如3天。可以通过自培养基分离细胞来获得条件化培养基。可以离心条件化培养基，例如以500g。它可以通过过滤流过膜来浓缩。膜可以包含大于1000kDa膜。可以将条件化培养基浓缩约50倍或更多倍。
可以对条件化培养基进行液相层析，诸如HPLC。可以通过大小排阻来将条件化培养基分开。可以使用任何大小排阻基质，诸如Sepharose。作为一个例子，可以采用TSK保护柱SWXL，6x 40mm或TSK凝胶G4000SWXL，7.8x 300mm。洗脱液缓冲剂可以包含任何生理学介质，诸如盐水。它可以包含具有150mM NaCl pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液。可以以0.5ml/min的流速平衡层析系统。洗脱模式可以是等度的(isocratic)。可以使用220nm的UV吸光度来追踪洗脱的行进。可以使用准弹性光散射(QELS)检测器来对各级分检查动态光散射(DLS)。
可以保留发现展现出动态光散射的级分。例如，发现如上文所描述的通过通用方法生成的，且以11-13分钟，诸如12分钟的保留时间洗脱的级分展现出动态光散射。在此峰中的颗粒的rh是约45-55nm。此类级分包含间充质干细胞颗粒，诸如外来体。
颗粒特性
间充质干细胞的特性可以包含由间充质干细胞条件化的培养基(MSC-CM)的特性。生成此类间充质干细胞条件化培养基的方法在本文件中的别处进行了描述，并在例如下文实施例1中例示。
特性可以包含生物学特性，诸如生物学活性。生物学活性的例子包括心脏保护、氧化应激降低和梗死大小降低。
心脏保护
颗粒可以具有间充质干细胞和/或间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的特性，包括心脏保护。心脏保护可以包含在缺血和/或再灌注过程中修复或维持心脏功能。
心脏保护测定法
可以例如使用实施例5、实施例10、实施例14和实施例20中所描述的任何一种或多种方法来测定心脏保护。
氧化应激
颗粒可以具有间充质干细胞和/或间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的特性，包括降低氧化应激的能力(或细胞保护)。
氧化应激测定法
可以例如使用过氧化氢(H2O2)诱导的细胞死亡的体外测定法来测定氧化应激的降低。总之，在人白血病CEM细胞中诱导过氧化氢(H2O2)介导的氧化应激，并通过锥虫蓝排除来监测细胞存活。将人白血病CEM细胞与颗粒、条件化培养基或间充质干细胞(其中盐水作为对照)一起温育，并用50μM H2O2处理以诱导氧化应激。在H2O2处理后12、24、36和48小时时使用锥虫蓝排除来评估细胞存活。
可以使用DNA氧化的体内测定法来进一步测定氧化应激降低。也可以如下测定体内氧化应激。用颗粒、条件化培养基或间充质干细胞(其中盐水作为对照)处理猪。获得猪心脏的组织切片。通过对氧化的DNA的8-OHdG免疫染色来量化经处理的和未处理的猪的组织切片中的细胞核氧化应激。对组织切片测定强烈的细胞核染色，其指明DNA氧化和氧化应激。
梗死大小
颗粒可以具有间充质干细胞和/或间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的特性，包括降低梗死大小的能力。
梗死大小测定法
可以例如使用实施例6和实施例13中所描述的任何一种或多种方法来测定梗死大小。
颗粒分子量
颗粒可以具有大于100kDa的分子量。它可以具有大于500kDa的分子量。例如，它可以具有大于1000kDa的分子量。
可以通过多种手段来测定分子量。原则上，可以通过大小分级和过滤流过具有相关分子量截留的膜来测定分子量。然后可以通过用SDS-PAGE追踪成分蛋白质分离或者通过生物学测定法来测定颗粒大小。
通过SDS-PAGE进行的分子量测定法
颗粒可以具有大于100kDa的分子量。例如，颗粒可以是这样的，即在进行过滤时，具有小于100kDa分子量的颗粒的大多数蛋白质分离入大于100kDa分子量保留物级分中。类似地，在用具有500kDa截留的膜进行过滤时，具有小于500kDa分子量的颗粒的大多数蛋白质可以分离入大于500kDa分子量保留物级分中。这指明颗粒可以具有大于500kDa的分子量。
通过生物学活性进行的分子量测定法
颗粒可以具有大于1000kDa的分子量。例如，颗粒可以是这样的，即在用具有1000kDa的分子量截留的膜进行过滤时，相关生物学活性基本上或主要保留在保留物级分中。或者/另外，滤液级分中可以没有生物学活性。生物学活性可以包含本文件中别处所描述的颗粒的任何生物学活性。
通过梗死大小进行的分子量测定法
例如，生物学活性可以包含梗死大小的降低，如心肌缺血和再灌注损伤的任何合适的模型中所测定的。例如，可以在小鼠或猪模型中测定生物学活性，诸如实施例中所描述的。
总之，通过缝合线结扎进行30分钟左冠状动脉(LCA)阻塞，从而诱导心肌缺血，并且通过除去缝合线来启动再灌注。经由尾静脉用含有颗粒的液体(诸如未分级的MSC-CM)、滤液(诸如小于100或1,000kD级分)、保留物(诸如大于1000kD保留物)或盐水静脉内处理小鼠，5分钟后进行再灌注。24小时后，切出心脏。切出前，通过再结扎LCA，然后经由主动脉灌注伊文思蓝来测定危险区(AAR)。
AAR定义为不被染料染色的面积，并且表示为左心室壁面积的百分比。24小时后使用伊文思蓝和TTC来评估梗死大小。若与盐水相比时相对梗死大小在用间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)和保留物(诸如大于1000kD)级分处理的动物中显著降低，则这指明颗粒具有高于膜相关截留的分子量(例如大于1000kDa)。
颗粒大小
颗粒可以具有大于2nm的大小。颗粒可以具有大于5nm、10nm、20nm、30nm、40nm或50nm的大小。颗粒可以具有大于100nm，诸如大于150nm的大小。颗粒可以具有基本上200nm或更大的大小。
颗粒可以具有一定范围的大小，诸如2nm至20nm、2nm至50nm、2nm至100nm、2nm至150nm或2nm至200nm之间。颗粒可以具有20nm至50nm、20nm至100nm、20nm至150nm或20nm至200nm之间的大小。颗粒可以具有50nm至100nm、50nm至150nm或50nm至200nm之间的大小。颗粒可以具有100nm至150nm或100nm至200nm之间的大小。颗粒可以具有150nm至200nm之间的大小。
可以通过多种手段来测定大小。原则上，可以通过大小分级和过滤流过具有相关大小截留的膜来测定大小。然后可以通过用SDS-PAGE追踪成分蛋白质分离或者通过生物学测定法来测定颗粒大小。
也可以通过电子显微术来测定大小，如实施例21中所描述的。
大小可以包含流体动力学半径。颗粒的流体动力学半径可以在100nm以下。它可以在约30nm和约70nm之间。流体动力学半径可以在约40nm和约60nm之间，诸如在约45nm和约55nm之间。流体动力学半径可以是约50nm。
可以通过任何合适的手段(例如激光衍射或动态光散射)来测定颗粒的流体动力学半径。在下文实施例33中列出了动态光散射方法测定流体动力学半径的例子。
组合物
颗粒可以包含由间充质干细胞分泌的一种或多种蛋白质。颗粒可以包含间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)中存在的一种或多种蛋白质。
例如，颗粒可以包含这些蛋白质的10％或更多、20％或更多、30％或更多、40％或更多、50％或更多、60％或更多或70％或更多。颗粒可以包含这些蛋白质的基本上约75％。可以通过参照蛋白质列表或基因列表的基因产物来限定蛋白质。
蛋白质
蛋白质可以选自下文表D1中所列的那些蛋白质。表D1包含下文各段中编号为1至250的下列蛋白质，以及“具有未鉴定功能的蛋白质”：
1.IPI00021428肌动蛋白，α骨骼肌；2.IPI00414057肌动蛋白α1骨骼肌蛋白质；3.IPI00008603肌动蛋白，主动脉平滑肌；4.IPI00021439肌动蛋白，胞质的1；5.IPI00023006肌动蛋白，α心脏的；6.IPI00021440肌动蛋白，胞质的2；7.IPI00025416肌动蛋白，γ-肠平滑肌；8.IPI00479925聚集蛋白；9.IPI00015102CD166抗原前体；10.IPI00007423酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员B；11.IPI0041333136kDa蛋白；12.IPI0041257734kDa蛋白；13.IPI0041350633kDa蛋白；14.IPI00418169假设的蛋白质DKFZp686P03159；15.IPI00003815ρGDP解离抑制剂1；16.IPI00004656β-2-微球蛋白前体；17.IPI00218042骨形态发生蛋白1前体的剪接同等型BMP1-5；18.IPI00009054骨形态发生蛋白1前体的剪接同等型BMP1-3；19.IPI00014021骨形态发生蛋白1前体的剪接同等型BMP1-1；20.IPI00218040骨形态发生蛋白1前体的剪接同等型BMP1-4；21.IPI00006980蛋白C14orf166；22.IPI00296165补体Clr亚成分前体；23.IPI00152540OTTHUMP00000016748；24.IPI00305064CD44抗原前体的剪接同等型CD44；25.IPI00297160假设的蛋白质DKFZp451K1918；26.IPI00293539钙粘蛋白-11前体的剪接同等型2；27.IPI00304227钙粘蛋白-11前体的剪接同等型1；28.IPI00386476钙粘蛋白11，2型、同等型1前蛋白原；29.IPI00024046钙粘蛋白-13前体；
30.IPI00290085中性钙粘蛋白前体；31.IPI00029739补体因子H前体的剪接同等型1；32.IPI00012011肌动蛋白丝切蛋白，非肌肉同等型；33.IPI00007257Calsyntenin 1同等型2；34.IPI00218539胶原α-1(XI)链前体的剪接同等型B；35.IPI00477350胶原，XI型、α1；36.IPI00329573胶原α-1(XII)链前体的剪接同等型长；37.IPI00221384胶原α-1(XII)链前体的剪接同等型短；38.IPI00400935胶原α-1(XVI)链前体；39.IPI00297646胶原α-1(I)链前体；40.IPI00164755前α2(I)胶原前体原；41.IPI00304962胶原α-2(I)链前体；42.IPI00021033胶原α-1(III)链前体；43.IPI00167087COL3A1蛋白；44.IPI00021034胶原α-1(IV)链前体；45.IPI00479324α2IV型胶原前蛋白原；46.IPI00306322胶原α-2(IV)链前体；47.IPI00303313胶原α-1(V)链前体；48.IPI00477611184kDa蛋白；49.IPI00293881COL5A2蛋白；50.IPI00018279胶原α-3(V)链前体；51.IPI00291136胶原α-1(VI)链前体；52.IPI00304840胶原α-2(VI)链前体的剪接同等型2C2；53.IPI00220613胶原α-2(VI)链前体的剪接同等型2C2A；54.IPI00022200α3VI型胶原同等型1前体；55.IPI00072918α3VI型胶原同等型4前体；56.IPI00220701胶原α-3(VI)链前体的剪接同等型2；57.IPI00072917α3VI型胶原同等型3前体；58.IPI00021828半胱氨酸蛋白酶抑制剂B；59.IPI00007778二N-乙酰基壳二糖前体；60.IPI00295741组织蛋白酶B前体；
61.IPI00299219蛋白CYR61前体；62.IPI0051490042kDa蛋白；63.IPI00333770与胞质分裂蛋白10的贡献者类似；64.IPI00478332与胞质分裂蛋白9的贡献者类似；65.IPI00000875延长因子1-γ；66.IPI00465248α-烯醇化酶；67.IPI00013769α-烯醇化酶，肺特异性的；68.IPI00216171γ-烯醇化酶；69.IPI00218803纤蛋白-1前体的剪接同等型B；70.IPI00296537纤蛋白-1前体的剪接同等型C；71.IPI00328113微纤维蛋白-1前体；72.IPI00019439微纤维蛋白2前体；73.IPI00385645成纤维细胞生长因子17前体的剪接同等型2；74.IPI00216602成纤维细胞生长因子受体2前体的剪接同等型5；75.IPI00216604成纤维细胞生长因子受体2前体的剪接同等型8；76.IPI00034099假设的蛋白质FLJ21918；77.IPI00333541细丝蛋白-A；78.IPI00302592细丝蛋白A，α；79.IPI00339227假设的蛋白质DKFZp686O1166；80.IPI00414283纤连蛋白前体(FN)(冷不溶性球蛋白)(CIG)剪接同等型3；81.IPI00339225纤连蛋白前体的剪接同等型5；82.IPI00339319纤连蛋白前体的剪接同等型11；83.IPI00556632纤连蛋白前体的剪接同等型12；84.IPI00411462假设的蛋白质DKFZp686B18150；85.IPI00029723促滤泡素抑制素相关蛋白1前体；86.IPI00005401多肽N-乙酰半乳糖氨基转移酶5；87.IPI00219025谷氧还蛋白-1；88.IPI00171411高尔基磷蛋白2；89.IPI00026314凝溶胶蛋白前体；
90.IPI00219757谷胱甘肽S-转移酶P；91.IPI00027569异质核内核糖核蛋白C样1；92.IPI00003881HNRPF蛋白；93.IPI00442294Neurotrimin前体的剪接同等型1；94.IPI00003865热休克关联71kDa蛋白的剪接同等型1；95.IPI00037070热休克关联71kDa蛋白的剪接同等型2；96.IPI0022036210kDa热休克蛋白，线粒体的；97.IPI00024284基底膜特异性硫酸乙酰肝素蛋白聚糖核心蛋白前体；98.IPI00297284胰岛素样生长因子结合蛋白2前体；99.IPI00297284胰岛素样生长因子结合蛋白2前体；100.IPI00029236胰岛素样生长因子结合蛋白5前体；101.IPI00029236胰岛素样生长因子结合蛋白5前体；102.IPI00029235胰岛素样生长因子结合蛋白6前体；103.IPI00029235胰岛素样生长因子结合蛋白6前体；104.IPI00016915胰岛素样生长因子结合蛋白7前体；105.IPI00016915胰岛素样生长因子结合蛋白7前体；106.IPI00328163K-α-1蛋白；107.IPI00021396血管内皮生长因子受体2前体；108.IPI00298281层粘连蛋白γ-1链前体；109.IPI00219219半乳凝素-1；110.IPI00023673半乳凝素-3结合蛋白前体；111.IPI00021405核纤层蛋白-A/C的剪接同等型A；112.IPI00216953核纤层蛋白-A/C的剪接同等型Aδ10；113.IPI00180173预测的：与原肌球蛋白4类似；114.IPI00401614预测的：与FKSG30类似；115.IPI00374397预测的：与原肌球蛋白4类似；116.IPI00374732预测的：与PPIA蛋白类似；117.IPI00402104预测的：与肽酰脯氨酰异构酶A同等型1类似；亲环蛋白A；肽酰-pro；118.IPI00455415预测的：与异质核内核糖核蛋白C样dJ845O24.4类似；119.IPI00454722预测的：与磷脂酰乙醇胺结合蛋白类似；120.IPI00454852预测的：与畸胎癌衍生的生长因子1类似；
121.IPI00002802蛋白质-赖氨酸6-氧化酶前体；122.IPI00410152潜伏转化生长因子β结合蛋白1同等型LTBP-1L；123.IPI00220249潜伏转化生长因子β结合蛋白，同等型1L前体；124.IPI00220249潜伏转化生长因子β结合蛋白，同等型1L前体；125.IPI00410152潜伏转化生长因子β结合蛋白1同等型LTBP-1L；126.IPI00020986腔蛋白聚糖前体；127.IPI00291006苹果酸脱氢酶，线粒体的，前体；128.IPI00005707巨噬细胞甘露糖受体2前体；129.IPI00020501肌球蛋白-11；130.IPI00019502肌球蛋白-9；131.IPI00604620核仁素；132.IPI00220740核磷蛋白的剪接同等型2；133.IPI00219446磷脂酰乙醇胺结合蛋白；134.IPI00299738前胶原C-内肽酶增强子1前体；135.IPI00015902β血小板衍生的生长因子受体前体；136.IPI00216691(肌动蛋白)抑制蛋白-1；137.IPI00169383磷酸甘油酸激酶1；138.IPI00219568磷酸甘油酸激酶，睾丸特异性的；139.IPI00296180尿激酶型纤溶酶原激活物前体；140.IPI00215943网蛋白1的剪接同等型3；141.IPI00215942网蛋白1的剪接同等型2；142.IPI00014898网蛋白1的剪接同等型1；143.IPI00398777网蛋白1同等型8；144.IPI00398776网蛋白1同等型7；145.IPI00186711网蛋白1同等型6；146.IPI00420096网蛋白1同等型3；147.IPI00398779网蛋白1同等型11；148.IPI00398778网蛋白1同等型10；149.IPI00398002网蛋白1同等型1；150.IPI00419585肽酰脯氨酰顺反异构酶A；
151.IPI00472718肽酰脯氨酰异构酶A同等型2；152.IPI00000874过氧化物氧还蛋白-1；153.IPI00024915过氧化物氧还蛋白-5，线粒体的，前体；154.IPI00375306过氧化物氧还蛋白5前体，同等型b；155.IPI00012503激活剂前体多肽前体的剪接同等型Sapmu-0；156.IPI00374179蛋白酶体激活剂亚基1同等型2；157.IPI00030154蛋白酶体激活剂复合物亚基1；158.IPI00168812PTK7蛋白质酪氨酸激酶7同等型d前体；159.IPI00419941PTK7蛋白质酪氨酸激酶7同等型a前体；160.IPI00003590Quiescin Q6，同等型a；161.IPI00015916骨衍生的生长因子(片段)；162.IPI00015916骨衍生的生长因子；163.IPI00298289Reticulon-4的剪接同等型2；164.IPI00021766Reticulon-4的剪接同等型1；165.IPI00013895Calgizzarin；166.IPI00010402假设的蛋白质；167.IPI00218733超氧化物歧化酶；168.IPI00014572SPARC前体；169.IPI00005614血影蛋白β链的剪接同等型长，脑1；170.IPI00008780司腺钙蛋白-2前体；171.IPI00301288SEL-OB蛋白；172.IPI00216138转凝蛋白；173.IPI00018219转化生长因子-β诱导的蛋白质ig-h3前体；174.IPI00304865转化生长因子，β受体III；175.IPI00296099血小板反应蛋白-1前体；176.IPI00032292金属蛋白酶抑制剂1前体；177.IPI00027166金属蛋白酶抑制剂2前体；178.IPI00220828胸腺素β-4；179.IPI00180240胸腺素样3；
180.IPI00299633OTTHUMP00000031270(片段)；181.IPI00465028磷酸丙糖异构酶1变体(片段)；182.IPI00451401磷酸丙糖异构酶的剪接同等型2；183.IPI00010779原肌球蛋白4；184.IPI00216975原肌球蛋白α-4链的剪接同等型2；185.IPI00180675微管蛋白α-3链；186.IPI00218343微管蛋白α-6链；187.IPI00216298硫氧还蛋白；188.IPI00472175CDNA FLJ46672fis，克隆TRACH3009008，与硫氧还蛋白还原酶高度类似；189.IPI00450472泛素缀合酶E2I；190.IPI00018352泛素羧基端水解酶同工酶L1；191.IPI00010207泛素折叠修饰剂(Ubiquitin-fold modifier)1前体；192.IPI00260630URB；193.IPI0002126314-3-3蛋白ζ/δ；194.IPI00642991假设的蛋白质DKFZp686F10164；195.IPI00470919假设的蛋白质DKFZp686K08164；196.IPI00719088胶原，VI型，α1前体；197.IPI00654685与SPARC前体类似；198.IPI00641961胶原，XII型，α1；199.IPI00645849细胞外基质蛋白1；200.IPI00554786硫氧还蛋白还原酶1；201.IPI00645018纤溶酶原激活物，尿激酶；202.IPI00552339金属蛋白酶1的组织抑制剂；203.IPI00642997肌动蛋白，胞质的2；204.IPI00719778与膜联蛋白A2类似；205.IPI00647915转凝蛋白2；206.IPI00552815胶原，V型，α1；207.IPI00552981 CDNA PSEC0266fis，克隆NT2RP3003649，与人类纤蛋白-1D mRNA高度类似；208.IPI0018077629kDa蛋白；209.IPI00552416细丝蛋白A，α；
210.IPI00640698肌动蛋白，γ-肠平滑肌；211.IPI00514530肌动蛋白，α1、骨骼肌；212.IPI00556442胰岛素样生长因子结合蛋白2变体(片段)；213.IPI00513782凝溶胶蛋白；214.IPI0047873129kDa蛋白；215.IPI0039647924kDa蛋白；216.IPI0033462739kDa蛋白；217.IPI00555762PTK7蛋白质酪氨酸激酶7同等型a变体(片段)；218.IPI0065820297kDa蛋白；219.IPI00006273CYR61蛋白；220.IPI00719405TMSL6蛋白；221.IPI00658096胸腺素β-4；222.IPI003761635kDa蛋白；223.IPI00556217微纤维蛋白1变体(片段)；224.IPI00514817与核纤层蛋白A/C类似；225.IPI00644087早衰蛋白质(Progerin)；226.IPI00655812横纹肌肉瘤抗原MU-RMS-40.12；227.IPI00604517与核仁素类似；228.IPI00444262 CDNA FLJ45706fis，克隆FEBRA2028457，其与核仁素高度类似；229.IPI00412473蛋白；230.IPI00414489蛋白；231.IPI00411463蛋白；232.IPI00556415转凝蛋白变体(片段)；233.IPI00718825钙调蛋白；234.IPI0047815617kDa蛋白；235.IPI00386621CALM3蛋白；236.IPI00647001酸性；237.IPI00642650与司腺钙蛋白2前体类似；238.IPI00641471胶原样蛋白；239.IPI00514669SH3域结合富含谷氨酸的蛋白质样3；240.IPI00719422磷酸丙糖异构酶(片段)；241.IPI00003734推定的S100钙结合蛋白H NH0456N16.1；242.IPI0002957411kDa蛋白；243.IPI00641047凝溶胶蛋白；244.IPI00647556凝溶胶蛋白；245.IPI00654821假设的蛋白质LOC54845同等型1；246.IPI00647572Dickkopf相关蛋白3前体；247.IPI00639879与胞质分裂蛋白sepA类似；248.IPI00657746与胞质分裂蛋白8的贡献者类似；249.IPI00555993血管内皮生长因子受体3变体；250.IPI00552545胞质分裂蛋白8的贡献者。
具有未鉴定功能的蛋白质：IPI00642991假设的蛋白质DKFZp686F10164；IPI00470919假设的蛋白质DKFZp686K08164；IPI00654685与SPARC前体类似；IPI00719778与膜联蛋白A2类似；IPI00552981 CDNA PSEC0266fis，克隆NT2RP3003649，其与人类纤蛋白-1DmRNA高度类似；IPI0018077629kDa蛋白；IPI0047873129kDa蛋白；IPI0039647924kDa蛋白；IPI0033462739kDa蛋白；IPI0065820297kDa蛋白；IPI003761635kDa蛋白；IPI00514817与核纤层蛋白A/C类似；IPI00644087早衰蛋白质；IPI00655812横纹肌肉瘤抗原MU-RMS-40.12；IPI00604517与核仁素类似；IPI00444262CDNA FLJ45706fis，克隆FEBRA2028457，其与核仁素高度类似；IPI00412473蛋白；IPI00414489蛋白；IPI00411463蛋白；IPI0047815617kDa蛋白；IPI00386621CALM3蛋白；IPI00647001酸性；IPI00642650与司腺钙蛋白2前体类似；IPI00641471胶原样蛋白；IPI00514669SH3域结合富含谷氨酸的蛋白质样3；IPI00003734推定的S100钙结合蛋白H_NH0456N16.1；IPI0002957411kDa蛋白；IPI00654821假设的蛋白质LOC54845同等型1；IPI00647572Dickkopf相关蛋白3前体；IPI00639879与胞质分裂蛋白sepA类似；IPI00657746与胞质分裂蛋白8的贡献者类似；IPI00555993血管内皮生长因子受体3变体。
基因产物
蛋白质可以选自下文表D2中所列的基因的基因产物。表D2包含下文各段中的下列基因：
ACTA1；COL5A2；HSPA8；PSAP；ACTA2；COL5A3；HSPE1；PSME1；ACTB；COL6A1；HSPG2；PTK7；ACTC；COL6A2；IGFBP2；QSCN6；ACTG1；COL6A3；IGFBP5；RTN4；ACTG2；CSTB；IGFBP6；S100A11；AGRN；CTBS；IGFBP7；SH3BGRL3；ALCAM；CTSB；K-α-1；SOD1；ANP32B；CYR61；KDR；SPARC；ANXA2；DOCK10；LAMC1；SPTBN1；ARHGDIA；DOCK8；LGALS1；STC2；B2M；ECM1；LGALS3BP；SVEP1；BMP1；EEF1G；LMNA；TAGLN；C14orf166；ENO1；LOX；TAGLN2；C1R；ENO1B；LTBP1；TGFBI；CALM1；ENO2；LUM；TGFBR3；CD109；FBLN1；MDH2；THBS1；CD44；FBN1；MRC2；TIMP1；CDH11；FBN2；MYH11；TIMP2；CDH13；FGF17；MYH9；TMSB4X；CDH2；FGFR2；NCL；TMSL3；CFH/HF1；FLJ21918；NPM1；TMSL6；CFL1；FLNA；PBP；TPI1；CLSTN1；FN1；PCOLCE；TPM4；COL11A1；FSTL1；PDGFRB；TUBA3；COL12A1；GALNT5；PFN1；TUBA6；COL16A1；GLRX；PGK1；TXN；COL1A1；GOLPH2；PGK2；TXNRD1；COL1A2；GSN；PLAU；UBE2I；COL3A1；GSTP1；PLEC1；UCHL1；COL4A1；HNRPCL1；PPIA；UFM1；COL4A2；HNRPF；PRDX1；URB；COL5A1；HNT；PRDX5；YWHAZ。
58种生物学过程中的201种基因
另外/或者，颗粒可以包含下文在表D3中所列的201种基因的基因产物之任一种。这些基因依照该基因牵涉的生物学过程来表征。
因而，可以采用颗粒来影响、控制或调节这58种生物学过程之任一种。
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表D3。58种生物学过程之每种中的201种基因(间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的基因)的列表
30种途径中的201种基因
另外/或者，颗粒可以包含下文在表D4中所列的201种基因的基因产物之任一种。这些基因依照该基因牵涉的途径来表征。
因而，可以采用颗粒来影响、控制或调节这30种途径之任一种。
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表D4。30种途径之每种中的201种基因(间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的基因)的列表
593种基因和794种基因产物
另外/或者，颗粒可以包含下文在表D5中所列的593种基因的基因产物和/或794种基因产物之任一种。
因而，可以采用颗粒来影响、控制或调节该基因或基因产物牵涉的生物学过程或途径之任一种。
表D5。间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)中的593种别的蛋白质外来体
颗粒可以特别包含小囊泡。颗粒可以包含外来体。
实施例描述了分泌物中赋予针对再灌注损伤的心脏保护的活性成分的分离。活性成分可以包含由间充质干细胞(MSC)分泌的外来体。
外来体是在晚期胞吞区室(多泡体)中形成的小膜小囊泡，其在1983年首次描述为由网织红细胞分泌21，并且随后发现由许多细胞类型(包括多种造血细胞、造血或非造血起源的肿瘤和上皮细胞)分泌22。它们是来自新近描述的“核糖核酸酶复合物”的独特实体，也称作外来体23。
外来体可以通过形态学和生物化学参数定义(参见综述22，24-35)。因而，本文所描述的颗粒可以包含这些形态学或生物化学参数之一项或多项。
外来体经典地定义为由具有40-100nm直径的脂双层限制的“碟样”小囊泡或变平的球体，并且通过内体膜的向内出芽来形成。与所有脂质小囊泡一样并且与由凋亡细胞所释放的蛋白质聚集体或核小体碎片不同，外来体具有约1.13-1.19g/ml的密度，而且在蔗糖梯度上漂浮。外来体富含胆固醇和鞘磷脂，和脂筏标志物，诸如GM1、GM3、Flotillin和src蛋白质激酶Lyn，这提示它们的膜富含脂筏。
已经检查了来自不同物种之不同细胞类型的外来体的分子组成。一般而言，外来体含有表现为对于所有外来体共同的遍在的蛋白质和细胞类型特异性的蛋白质。还有，来自相同细胞类型但不同物种的外来体中的蛋白质是高度保守的。遍在的外来体相关蛋白包括细胞骨架中找到的胞质蛋白质例如微管蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白结合蛋白，胞内膜融合和运输例如膜联蛋白和rab蛋白，信号转导蛋白例如蛋白质激酶、14-3-3和异源三聚体G蛋白，代谢酶例如过氧化物酶、丙酮酸和脂质激酶、和烯醇化酶-1和四次跨膜蛋白家族例如CD9、CD63、CD81和CD82。四次跨膜蛋白是外来体中高度富含的，而且已知牵涉大分子复合物和膜亚域的组织。
外来体中细胞类型特异性蛋白质的例子是来自MHC II类表达细胞的外来体中的MHC II类分子、树突细胞衍生的外来体中的CD86、T细胞衍生的外来体上的T细胞受体等。显著地，外来体不含细胞核、线粒体、内质网或高尔基体起源的蛋白质。还有，外来体中没有高度丰富的质膜蛋白，这提示它们不仅仅是质膜的碎片。已报告的遍在的外来体相关蛋白中许多也存在于hESC-MSC分泌物的蛋白质组谱中。
还知道外来体含有mRNA和微小RNA，其可以被投递至另一细胞，而且在此新位置中可以是有功能的36。外来体的生理学功能仍然定义得较差。认为它帮助消除废弃的蛋白质、使蛋白质再循环、介导传染性颗粒诸如朊病毒和病毒的传播、诱导补体抗性、促进免疫细胞-细胞通信和传送细胞信号传导1，22，25-28，37-40。已经在免疫疗法中使用外来体来治疗癌症34。
来自间充质干细胞的颗粒的用途
可以使用颗粒作为MSC或MSC-CM的替代物，如上文所描述的。特别地，颗粒可以用于目前使用或者未来可以使用MSC或MSC-CM的任何治疗目的。
会明显的是，本文所描述的方法和组合物使颗粒能够自间充质干细胞生成。如此，间充质干细胞的任何用途会同等地附着至来自间充质干细胞的颗粒。
可以使用通过本文所描述的方法和组合物生成的间充质干细胞和已经分化的细胞来治疗疾病或者制备用于治疗疾病的药物组合物。此类疾病可以包括通过再生疗法可治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、变性性疾病诸如糖尿病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病等和癌症。因而，可以使用来自MSC的颗粒来治疗此类疾病。
来自间充质干细胞的颗粒，诸如那些依照本文所描述的方法和组合物生成的颗粒可以用于多种商业上重要的研究、诊断、和治疗目的。
特别可以使用来自间充质干细胞的颗粒来制备用于治疗疾病的药物组合物。此类疾病可以包括通过再生疗法可治疗的疾病，包括心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤、变性性疾病诸如糖尿病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病等和癌症。
通过本文所描述的方法和组合物生成的间充质干细胞与骨髓衍生的间充质干细胞(BM-MSC)具有类似或相同的特性。因此，间充质干细胞和自这些生成的任何已经分化的细胞以及自其衍生的颗粒可以在已知使用BM-MSC或者有可能要使用它们的任何应用中使用。
由来自间充质干细胞的颗粒可治疗的疾病
对MSC蛋白质组的分析显示了所表达的蛋白质牵涉三种生物学过程：新陈代谢、防御应答、和组织分化，包括血管形成、血细胞形成和骨骼发育。因而，可以使用本文所描述的来自MSC的颗粒来治疗疾病，在所述疾病中这些功能可以具有作用，或者所述疾病的修复或治疗牵涉这些生物学过程之任一种或多种。类似地，为了例如治疗或预防此类疾病，可以使用由MSC表达的蛋白质单独地或组合地(优选地处于如本文所描述的颗粒形式)来补充MSC或由MSC条件化的培养基的活性或替换MSC或由MSC条件化的培养基。
显示了由MSC表达的201种基因产物激活心血管生物学、骨发育和血细胞形成中重要的信号传导途径诸如Jak-STAT、MAPK、Toll样受体、TGF-β信号传导和mTOR信号传导途径。因而，可以使用来自MSC的颗粒等来预防或治疗疾病，这些信号传导途径之任一种牵涉所述疾病，或者所述疾病的病因学牵涉这些信号传导途径之任一种或多种中的一种或多种缺陷。
因而，可以使用此类颗粒来治疗心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤和变性性疾病，诸如糖尿病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病和癌症。
还可以使用此类颗粒来治疗心肌梗死、皮肤伤口、皮肤病学病症、皮肤病学损伤、皮炎、银屑病、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮肤癌、特应性皮炎、贝切特病、慢性肉芽肿性疾病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡、以诱导炎症的初始损伤和导致慢性组织重塑的免疫失调为特征的病理学状况包括纤维化和功能丧失、肾缺血性损伤、囊性纤维化病、鼻窦炎和鼻炎或整形外科疾病。
可以使用颗粒来帮助个体中的伤口愈合、瘢痕减少、骨形成、骨移植物或骨髓移植。
除非上下文另有规定，术语“条件化培养基”应当理解成不仅包括暴露于MSC的细胞培养基以及包含一种或多种，优选基本上所有存在于条件化培养基中的多肽的此类组合物。
还可以使用颗粒作为由MSC分泌或表达的蛋白质之任一种的来源。因此，我们提供了一种生成如表D1至D5之任一项中所显示的多肽的方法，该方法包括获得颗粒，如所描述的，并自所述颗粒分离多肽。
心脏病
可以使用本文所描述的间充质干细胞颗粒方法和组合物来治疗或预防心脏病。
心脏病是影响心脏的多种不同疾病的涵盖性术语。在2007年时，它是美国、英格兰、加拿大和威尔士的首要死亡原因，仅在美国每34秒便杀死一人。心脏病包括下列任一项。
冠心病(coronary heart disease)
冠状动脉疾病是由供应心肌的动脉壁内的粥样斑块积累引起的动脉疾病。心绞痛(angina pectoris)(胸痛(chest pain))和心肌梗死(心脏病发作(heartattack))是冠心病的症状和由冠心病引起的状况。每年超过459,000名美国人死于冠心病。在英国，每年101,000例死亡是由于冠心病。
心肌病(Cardiomyopathy)
心肌病是由于任何原因引起的心肌(即真实的心脏肌肉)功能衰退。患有心肌病的人常常有心律失常(arrhythmia)和/或心脏性猝死(sudden cardiacdeath)的风险。外因性心肌病(主要的病理学在心肌外的心肌病)自身构成大多数心肌病。到目前为止，心肌病的最常见原因是缺血。
世界卫生组织作为具体的心肌病包括：酒精中毒性心肌病(Alcoholiccardiomyopathy)、冠状动脉疾病(coronary artery disease)、先天性心脏病(congenital heart disease)、影响心脏的营养病(nutritional diseases affecting theheart)、缺血性心肌病(ischemic/ischaemic cardiomyopathy)、高血压性心肌病(hypertensive cardiomyopathy)、瓣膜性心肌病(valvular cardiomyopathy)、炎性心肌病(inflammatory cardiomyopathy)。
还包括：
系统性代谢病继发的心肌病
内因性心肌病(不是由于可鉴定的外部原因的心脏肌肉虚弱)
扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy)(DCM，最常见的形式，和心脏移植的主要适应症之一。在DCM中，心脏(特别是左心室)扩大，并且泵送功能减弱)
肥厚型心肌病(hypertrophic cardiomyopathy)(HCM或HOCM，由编码肌节蛋白的基因中的多个突变引起的遗传病症。在HCM中，心脏肌肉变厚，这可以阻塞血流，并阻止心脏适当地发挥功能)，
心律失常性右心室心肌病(Arrhythmogenic right ventricularcardiomyopathy)(ARVC，其源于心脏的电干扰，其中心脏肌肉被纤维性瘢痕组织替换。右心室一般最受影响)
限制型心肌病(restrictive cardiomyopathy)(RCM，其是最不常见的心肌病。心室壁是僵硬的，但是可不变厚，而且对抗血液正常充满心脏)。
致密化不全心肌病(Noncompaction cardiomyopathy)-左心室壁未能从出生正确生长，而且因此在超声心动图过程中观察时其具有海绵状外观。
心血管疾病
心血管疾病是许多影响心脏自身和/或血管系统，特别是通向心脏和来自心脏的静脉和动脉的特定疾病之任一项。对疾病二态性的研究提示患有心血管疾病的女性通常遭受影响血管的形式，而男性通常遭受影响心脏肌肉自身的形式。心血管疾病的已知或相关原因包括糖尿病(diabetes mellitus)、高血压、高高半胱氨酸血症(hyperhomocysteinemia)和高胆固醇血症(hypercholesterolemia)。
心血管疾病类型包括动脉粥样硬化(atherosclerosis)。
缺血性心脏病(Ischaemic heart disease)
缺血性心脏病是心脏自身的疾病，其特征在于对器官的血供降低。这在供应氧和营养物的动脉变得停止时发生，并且心脏不会获得足够的氧和营养物，并且最终会停止跳动。
心力衰竭
心力衰竭(也称作充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)和充血性心力衰竭(congestive cardiac failure，CCF))是可以源自损害心脏充满或泵送足够量的血液遍及整个身体的能力的任何结构或功能性心脏病症的状况。肺源性心脏病(cor pulmonale)是心脏右侧的衰竭。
高血压心脏病
高血压心脏病是由高血压，特别是局限性高血压(localised high bloodpressure)引起的心脏病。可以由高血压心脏病引起的状况包括：左心室肥大(left ventricular hypertrophy)、冠心病、(充血性)心力衰竭、高血压性心肌病、心脏心律失常、炎性心脏病等。
炎性心脏病牵涉心脏肌肉和/或其周围的组织的炎症。心内膜炎(endocarditis)包含心脏内层，即心内膜的炎症。所牵涉的最常见结构是心瓣膜。炎性心肥大(Inflammatory cardiomegaly)。心肌炎包括心肌，即心脏的肌肉部分的炎症。
瓣膜性心脏病(valvular heart disease)
瓣膜性心脏病是影响心脏的一个或多个瓣膜的疾病过程。心脏右侧的瓣膜是三尖瓣和肺动脉瓣(pulmonic valve)。心脏左侧的瓣膜是左房室瓣和主动脉瓣。包括主动脉瓣狭窄(aortic valve stenosis)、二尖瓣脱垂(mitral valveprolapse)和瓣膜性心肌病。
[上文文本改编自心脏病。(2009年2月3日)。在维基百科中，免费的百科全书。2009年2月20日06:33检索自http://en.wikipedia.org/w/index.php？title＝Heart_disease&oldid＝268290924]。
颗粒的投递
可以通过任何合适的手段将如本文件中所描述的颗粒投递至人或动物身体。
因此，我们描述了用于将如本文件中所描述的颗粒投递至靶细胞、组织、器官、动物身体或人身体的投递系统和用于使用该投递系统来将颗粒投递至目标的方法。
投递系统可以包含颗粒源，诸如含有颗粒的容器。投递系统可以包含用于将颗粒分配至目标的分配器。
因而，我们提供了用于投递颗粒的投递系统，其包含与可操作用于将颗粒投递至目标的分配器一起的如本文件中所描述的颗粒源。
我们进一步提供了此类投递系统在将颗粒投递至目标的方法中的用途。
用于将流体投递入身体中的投递系统是本领域中已知的，包括注射、外科滴注、导管(包括灌注导管)诸如那些记载于美国专利6,139,524的，例如药物投递导管，诸如那些记载于美国专利7,122,019的。
向肺或鼻道的投递(包括鼻内投递)可以使用例如如本领域中已知的鼻喷雾、喷出器(puffer)、吸入器等(例如如美国外观设计专利D544,957中所显示的)来实现。
向肾的投递可以使用主动脉内肾投递导管(诸如记载于美国专利7,241,273的)来实现。
会明显的是，特定的投递应当是可配置的以在合适的时间间隔投递需要量的颗粒，以便达到最佳治疗。
例如，可以使用颗粒来治疗或预防动脉粥样硬化。在这里，可以静脉内完成颗粒的灌注以稳定化动脉粥样硬化斑块或降低斑块中的炎症。可以通过静脉内灌注，使用颗粒来治疗或预防感染性休克(septic shock)。
可以使用颗粒来治疗或预防心力衰竭。这可以通过颗粒的长期冠状动脉内或心肌内灌注以延迟重塑或延迟心力衰竭来实现。可以通过鼻内投递，使用颗粒来治疗或预防肺炎症。
可以使用颗粒来治疗或预防皮肤病学状况(例如银屑病)。可以使用经皮微注射针来采用颗粒的长期投递，直至状况得到解决。
会明显的是，投递方法会取决于要向其投递颗粒的特定器官，并且技术人员会能够据此确定采用哪种手段。
作为一个例子，在心脏炎症的治疗中，可以通过直接的冠状动脉内注射通过胸壁或者使用标准的基于经皮导管的方法在关于直接注射入组织(诸如心肌)中或从插入体腔中的支架或导管输注抑制剂的荧光镜检查指导下将颗粒投递至例如心脏组织(即心肌、心包膜、或心内膜)。
可以使用任何种类的冠状动脉导管或灌注导管来施用化合物。或者，可以在冠状血管中放置的支架上包被或浸渍颗粒。
组织再生
也可以在有所需要的人患者中使用依照本文所描述的方法和组合物生成的间充质干细胞和已经分化的细胞和自其衍生的颗粒来进行组织重建或再生。细胞以容许它们移植至预期的组织位置并重建或再生功能上缺陷的区域的方式施用。
例如，可以使用本文所描述的方法和组合物来调控干细胞的分化。可以使用间充质干细胞和已经分化的细胞及自其衍生的颗粒来进行组织工程化改造，诸如用于皮肤移植物的生长。干细胞分化的调控可以用于人工器官或组织的生物工程或者用于修复学，诸如支架。
癌症
可以使用通过本文所描述的方法和组合物生成的间充质干细胞和已经分化的细胞及自其衍生的颗粒来治疗癌症。
术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞生长为特征的生理学状况。癌症的例子包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、和白血病(leukemia)。
此类癌症的更具体的例子包括鳞状细胞癌(squamous cell cancer)、小细胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、胃癌(gastric cancer)、胰腺癌(pancreatic cancer)、神经胶质细胞肿瘤(glial cell tumor)诸如成胶质细胞瘤(glioblastoma)和神经纤维瘤病(neurofibromatosis)、子宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、肝癌(liver cancer)、膀胱癌(bladdercancer)、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌(colon cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、子宫内膜癌(endometrial carcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、肾癌(kidney cancer)、肾癌(renal cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、外阴癌(vulval cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈癌(head and neck cancer)。别的例子是实体瘤癌症，包括结肠癌、乳腺癌、肺癌和前列腺癌，造血恶性肿瘤(hematopoietic malignancy)包括白血病和淋巴瘤、何杰金氏病(Hodgkin’sdisease)、再生障碍性贫血(aplastic anemia)、皮肤癌(skin cancer)和家族性腺瘤性息肉病(familiar adenomatous polyposis)。别的例子包括脑新生物、结肠直肠新生物、乳房新生物、子宫颈新生物、眼新生物、肝新生物、肺新生物、胰腺新生物、卵巢新生物、前列腺新生物、皮肤新生物、睾丸新生物、新生物、骨新生物、滋养层新生物、输卵管新生物、直肠新生物、结肠新生物、肾新生物、胃新生物、和甲状旁腺新生物。还包括乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、结肠直肠癌、肺癌、恶性黑素瘤、白血病、淋巴瘤、卵巢癌、宫颈癌和胆道癌瘤。
依照本文所描述的方法和组合物生成的间充质干细胞和已经分化的细胞也可以与抗癌剂诸如内皮他丁(endostatin)和血管他丁(angiostatin)或细胞毒剂或化疗剂联合使用。例如药物，诸如诸如阿霉素(adriamycin)、道诺霉素(daunomycin)、顺铂(cis-platinum)、依托泊苷(etoposide)、泰素(Taxol)、泰索帝(Taxotere)和生物碱类(alkaloids)诸如长春新碱(vincristine)、和抗代谢物诸如甲氨蝶呤(methotrexate)。如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如I、Y、Pr)、化疗剂、和毒素诸如细菌、真菌、植物或动物起源的酶促活性毒素或其片段。
还有，该术语包括癌基因产物/酪氨酸激酶抑制剂，诸如WO 94/22867中披露的二环安沙霉素类(ansamycins)；EP 600832中披露的1，2-二(芳氨基)苯甲酸衍生物；EP 600831中披露的6，7-二氨基-酞嗪-1-酮衍生物；如EP 516598中所披露的4，5-二(芳氨基)-邻苯二甲酰亚胺衍生物；或抑制酪氨酸激酶结合含有SH2的底物蛋白质的肽(参见例如WO 94/07913)。“化疗剂”是在癌症治疗中有用的化学化合物。化疗剂的例子包括阿霉素、多柔比星(Doxorubicin)、5-氟尿嘧啶(5-FU)、阿糖胞苷(Ara-C)、环磷酰胺(Cyclophosphamide)、塞替派(Thiotepa)、白消安(Busulfan)、环磷酰胺(Cytoxin)、泰素、甲氨蝶呤、顺铂、美法仑(Melphalan)、长春碱(Vinblastine)、博来霉素(Bleomycin)、依托泊苷、异环磷酰胺(Ifosfamide)、丝裂霉素C、米托蒽醌(Mitoxantrone)、长春新碱(Vincristine)、VP-16、长春瑞滨(Vinorelbine)、卡铂(Carboplatin)、替尼泊苷(Teniposide)、道诺霉素(Daunomycin)、洋红霉素(Carminomycin)、氨基蝶呤(Aminopterin)、放线菌素D(dactinomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)、烟酰胺(Nicotinamide)、埃斯波霉素类(Esperamicins)(参见美国专利No.4,675,187)、美法仑及其它相关氮芥类(nitrogen mustards)、和内分泌疗法(诸如己烯雌酚(DES)、他莫昔芬(Tamoxifen)、LHRH拮抗性药物、黄体酮类(progestins)、抗黄体酮类(anti-progestins)等)。
获得间充质干细胞(MSC)
可以自间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)分离或生成本文所描述的颗粒。可以通过本领域中已知的任何方法来生成适合于在生成条件化培养基和颗粒中使用的MSC。
特别地，可以在包含FGF2的无血清培养基中在没有共培养的情况中通过增殖通过分散胚胎干(ES)细胞集落获得的细胞或其后代来生成MSC。这在下文部分中更为详细地描述。
自hESC获得间充质干细胞(MSC)或MSC样细胞的现有技术方法牵涉将人端粒末端转移酶逆转录酶(hTERT)基因转染入分化中的hESC中(Xu等，2004)或者与小鼠OP9细胞系共培养(Barberi等，2005)。这些衍生方案中外源遗传材料和小鼠细胞的使用引入异动物(xenozootic)传染原感染或致肿瘤性的不可接受的风险。
因此，可以自通过使用用于从分化中的hESC分离类似的或相同的(诸如同质的)MSC群体的临床上相关的且可再现的方案衍生的MSC生成颗粒。一般而言，该方法包括将胚胎干(ES)细胞集落分散成细胞。然后将细胞铺板并增殖。在包含成纤维细胞生长因子2(FGF2)的无血清培养基中在没有共培养的情况中增殖细胞以获得间充质干细胞(MSC)。
如此，所述方案不需要血清、使用小鼠细胞或遗传操作，而且需要较少的操作和时间，并且因此是高度可缩放的。可以使用该方案来从两种不同hESC系即HuES9和H-1和还有第三种系即Hes-3分离MSC。通过本文所描述的方法和组合物获得的人ES细胞衍生的MSC(hESC-MSC)与骨髓衍生的MSC(BM-MSC)显著相似。
胚胎干细胞培养可以包含人胚胎干细胞(hESC)培养。
在一个实施方案中，生成间充质干细胞(MSC)的方法包括在补充有FGF2和任选地PDGF AB的培养基中在没有饲养细胞支持的情况中用胰蛋白酶处理并增殖hESC，之后分选CD105+CD24-细胞。
所述方法可以包括在补充有FGF2和任选地PDGF AB的培养基中无饲养细胞增殖后一周自经胰蛋白酶处理的hESC分选CD105+、CD24-细胞以生成hESC-MSC细胞培养物，其中至少一些，诸如基本上所有或所有细胞是彼此相似或相同的(诸如同质的)。
可以使用通过此方法生成的MSC来生成间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)，可以自其分离颗粒。
解聚的胚胎干细胞集落
一种生成间充质干细胞的方法可以包括将胚胎干细胞集落分散或解聚成细胞。
胚胎干细胞集落可以包含huES9集落(Cowan CA，Klimanskaya I，McMahon J，Atienza J，Witmyer J，等(2004)Derivation of embryonic stem-celllines from human blastocysts.N Engl J Med 350：1353-1356)或H1 ESC集落(Thomson JA，Itskovitz-Eldor J，Shapiro SS，Waknitz MA，Swiergiel JJ，等(1998Embryonic Stem Cell lines Derived from Human Blastocysts.Science 282：1145-1147)。
可以以实质性的程度将集落中的细胞解聚或分散，即至少解聚或分散成块。可以以集落中的所有细胞是单一的程度将集落解聚或分散，即集落是完全解聚的。
可以用分散剂实现解聚。
分散剂可以是能够使集落中的至少一些胚胎干细胞彼此分开的任何东西。分散剂可以包含破坏集落中细胞间和/或细胞与底物之间的粘着的试剂。分散剂可以包含蛋白酶。
分散剂可以包含胰蛋白酶。用胰蛋白酶进行的处理可以持续例如3分钟或大约于37℃。然后可以将细胞中和、离心、并在培养基中重悬，之后铺板。
所述方法可以包括用胰蛋白酶分散人胚胎干细胞的汇合平板，并将细胞铺板。
解聚可以包括下列次序的步骤中的至少一些：抽吸、漂洗、胰蛋白酶处理、温育、移取、猝灭、再接种和等分。下列方案改编自Hedrick Lab，UC SanDiego(http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)。
在抽吸步骤中，从容器诸如烧瓶抽吸或一般取出培养基。在漂洗步骤中，用一定体积(例如5-10ml)缓冲培养基(其可以没有Ca2+和Mg2+)漂洗细胞。例如，可以用没有钙和镁的PBS漂洗细胞。在胰蛋白酶处理步骤中，向容器添加缓冲液中一定量的分散剂，并滚动容器以用分散剂溶液包被生长表面。例如，可以将汉克氏(Hank’s)BSS中的1ml胰蛋白酶添加至烧瓶。
在温育步骤中，将细胞于维持的温度维持若干时间。例如，可以于37℃将细胞维持几分钟(例如2至5分钟)。在移取步骤中，可以通过机械作用，例如通过刮擦或者通过用手重击容器侧面来移取细胞。细胞应当成片脱落，并从表面滑落。
在淬灭步骤中，将一定体积的培养基添加至烧瓶。培养基可以包含中和剂以停止分散剂的作用。例如，若分散剂是蛋白酶，诸如胰蛋白酶，则培养基可以含有诸如血清蛋白质等蛋白质，其会消除蛋白酶的活性。在一个具体的例子中，将3ml含有血清的细胞培养基添加至烧瓶以补足总共4ml。可以吸取细胞以移取或分散细胞。
在再接种步骤中，将细胞再接种入新鲜的培养容器中，并添加新鲜的培养基。可以以不同分拆比进行许多再接种。例如，可以以1/15稀释和1/5稀释来再接种细胞。在一个具体的例子中，可以如下再接种细胞，即将1滴细胞添加入25cm2烧瓶中并将3滴添加入另一瓶中以再接种培养物，然后将7-8ml培养基添加至每瓶以提供来自例如75cm2烧瓶的1/15稀释和1/5稀释。在等分步骤中，可以以想要的分拆比将细胞等分入新皿或者无论什么容器，并添加培养基。
在一个具体的实施方案中，所述方法包括下列步骤：首先将人ES细胞以非贴壁方式悬浮培养以形成胚状体(EB)。然后对5-10日龄EB进行胰蛋白酶处理，之后在经明胶包被的组织培养板上作为贴壁细胞铺板。
以细胞培养物维持
可以将解聚的细胞铺板，并以细胞培养物维持。
可以将细胞铺板至培养容器或基底诸如明胶化的平板上。至关重要地，在没有共培养存在的情况中，例如在没有饲养细胞的情况中培养和增殖细胞。
可以将细胞培养物中的细胞在无血清培养基中培养，所述无血清培养基补充有一种或多种生长因子诸如成纤维细胞生长因子2(FGF2)和任选地血小板衍生生长因子AB(PDGF AB)，为例如5ng/ml。在通过用胰蛋白酶处理、清洗和再铺板为汇合时可以将细胞培养物中的细胞以1∶4分拆或传代培养。
没有共培养
可以在没有共培养的情况中培养细胞。术语“共培养”指培养在一起的两种或更多种不同种类的细胞(例如基质(stromal)饲养细胞)的混合物。
如此，在典型的ES细胞培养物中，培养皿的内表面通常包被有小鼠胚胎皮肤细胞的饲养层，其已经进行过处理，因此它们不会分裂。饲养层提供粘附表面来使ES细胞能够附着并生长。另外，饲养细胞将ES细胞生长所需要的营养物释放入培养基中。在本文所描述的方法和组合物中，可以在没有此类共培养的情况中培养ES和MSC细胞。
可以将细胞以单层或者在没有饲养细胞的情况中培养。可以在没有饲养细胞的情况中培养胚胎干细胞以建立间充质干细胞(MSC)。
可以将解离的或解聚的胚胎干细胞直接铺板至培养基底上。培养基底可以包含组织培养容器，诸如培养皿。容器可以是经预处理的。可以将细胞铺板至明胶化的组织培养板上，并在其上生长。
用于皿的明胶包被的例示性方案如下。制备蒸馏水中0.1％的明胶溶液，并将其高温灭菌。这可以于室温贮存。用明胶溶液覆盖组织培养皿的底部，并温育5-15分钟。除去明胶，并且平板准备好使用。应当在添加细胞前添加培养基以防止低渗溶解。
无血清培养基
可以在培养基中培养解离的或解聚的胚胎干细胞，所述培养基可以包括无血清培养基。
术语“无血清培养基”可以包括没有血清蛋白质(例如胎牛血清)的细胞培养基。无血清培养基是本领域中已知的，并且记载于例如美国专利5,631,159和5,661,034。无血清培养基可购自例如Gibco-BRL(Invitrogen)。
无血清培养基可以是没有蛋白质的，即它可以缺乏蛋白质、水解物、和未知组成的成分。无血清培养基可以包含化学成分确定的培养基，其中所有成分均具有已知的化学结构。化学成分确定的无血清培养基是有利的，因为它提供了完全确定的系统，其消除了变动性，这容许改善的再现性和更一致的性能，而且降低了受外来物污染的可能性。
无血清培养基可以包含敲除DMEM培养基(Invitrogen-Gibco，GrandIsland，New York)。
无血清培养基可以补充有一种或多种成分，诸如血清替换培养基，浓度在例如5％、10％、15％等。无血清培养基可以包含或者补充有来自Invitrogen-Gibco(Grand Island，New York)的10％血清替换培养基。
生长因子
培养解离的或解聚的胚胎干细胞的无血清培养基可以包含一种或多种生长因子。许多生长因子是本领域中已知的，包括PDGF、EGF、TGF-a、FGF、NGF、(促)红细胞生成素、TGF-b、IGF-I和IGF-II。
生长因子可以包含成纤维细胞生长因子2(FGF2)。培养基还可以含有其它生长因子，诸如血小板衍生的生长因子AB(PDGF AB)。这两种生长因子都是本领域中已知的。所述方法可以包括在包含FGF2和PDGF AB两者的培养基中培养细胞。
或者/另外，培养基可以包含或者进一步包含表皮生长因子(EGF)。EGF的使用可以增强MSC的生长。EGF可以以任何合适的浓度使用，例如5-10ng/ml EGF。可以使用EGF替换PDGF。EGF是本领域中公知的一种蛋白质，并且称为符号EGF、Alt.符号URG、Entrez 1950、HUGO 3229、OMIM131530、RefSeq NM_001963、UniProt P01133。
如此，我们公开了包含(i)FGF2、(ii)FGF2和PDGF和(iii)FGF2和EGF及其它组合的培养基的用途。
FGF2是一种广谱促有丝分裂的、血管生成的、和神经营养性的因子，其在许多组织和细胞类型中以低水平表达，并在脑和垂体中达到高浓度。FGF2已经牵涉许多的生理学和病理学过程，包括肢发育、血管发生、伤口愈合、和肿瘤生长。FGF2可以在商业上获自例如Invitrogen-Gibco(GrandIsland，New York)。
血小板衍生的生长因子(PDGF)是一种广泛细胞类型(包括成纤维细胞、平滑肌和结缔组织)的有力促细胞分裂剂。PDGF(其由称作A链和B链的两条链的二聚体构成)能以AA或BB同二聚体或者以AB异二聚体存在。人PDGF-AB是一种25.5kDa同二聚体蛋白质，其由13.3kDa A链和12.2B链组成。PDGF AB可以在商业上获自例如Peprotech(Rocky Hill，New Jersey)。
生长因子诸如FGF2和任选地PDGF AB可以以约100pg/ml、诸如约500pg/ml、诸如约1ng/ml、诸如约2ng/ml、诸如约3ng/ml、诸如约4ng/ml、诸如约5ng/ml的浓度存在于培养基中。在一些实施方案中，培养基含有约5ng/ml的FGF2。培养基还可以含有PDGF AB，诸如在约5ng/ml。
分拆细胞
培养中的细胞一般会继续生长直至汇合，此时接触抑制引起细胞分裂和生长停止。然后可以自基底或烧瓶解离此类细胞，并通过稀释入组织培养基中并再铺板来“分拆”、传代培养或传代。
因此，本文所描述的方法和组合物可以包括传代或培养过程中的分拆。可以以1∶2或更多、诸如1∶3、诸如1∶4、1∶5或更多的比率分拆细胞培养物中的细胞。术语“传代”指在于采集细胞系的汇合培养物的等分试样、接种入新鲜的培养基中、并培养该系直至获得汇合或饱和的过程。
选择、筛选或分选步骤
所述方法可以进一步包括选择或分选步骤，以进一步分离或选择间充质干细胞。
选择或分选步骤可以包括依靠一种或多种表面抗原标志物自细胞培养物选择间充质干细胞(MSC)。选择或分选步骤的使用进一步增强MSC的分选和选择特异性的严格性，而且此外还潜在地降低来自起始材料的胚胎干细胞诸如hESC和其它hESC衍生物有可能的污染。然后，这会进一步降低畸胎瘤形成的风险，而且进一步提高我们描述的方案的临床相关性。
许多基于抗原表达进行选择或分选的方法是已知的，并且这些中任一种可以在本文所描述的选择或分选步骤中使用。可以依靠荧光激活细胞分选(FACS)来实现选择或分选。如此，如本领域中已知的，FACS牵涉将细胞暴露于报告物，诸如经标记的抗体，其结合并标记由细胞表达的抗原。生成抗体及将其标记以形成报告物的方法是本领域中已知的，并且记载于例如Harlow和Lane。然后将细胞流过FACS仪，其基于所述标记将细胞彼此分选。或者/另外，可以采用磁性细胞分选(MACS)来分选细胞。
我们已经认识到虽然已知许多候选表面抗原与MSC有关，例如CD105、CD73、ANPEP、ITGA4(CD49d)、PDGFRA，但有些MSC相关表面抗原(例如CD29和CD49e)在ES细胞诸如hESC中也是高度表达的，并且它们的表达通过FACS分析得到证实。表面抗原与MSC的关联可能不足以把抗原说成用于从ES细胞诸如hESC分离MSC的选择标志。因而，选择或分选步骤可以采用MSC与ES细胞间差别表达的抗原。
我们的方法的选择或分选步骤可以基于抗原的表达来阳性选择间充质干细胞。可以通过例如比较hESC和hESCMSC的基因表达谱来鉴定此类抗原。在具体的实施方案中，选择或分选可以特定地利用下文表E1A和表E1B中所显示的任何抗原。
我们的方法的选择或分选步骤可以基于抗原的表达来阳性选择间充质干细胞，所述抗原被鉴定为在MSC上表达，但不在ES细胞诸如hESC上表达。
CD73在MSC上是高度表达的，而在hESC上没有高度表达。CD73和CD105两者都是MSC中高度表达的表面抗原，而且是相对于hESC在hESC-MSC中前20位高度表达的表面抗原之一，使用CD73或CD105(或两者)作为推定的MSC选择标志在分选由分化中的hESC生成的推定MSC中会是同等有效的。
或者/另外，选择或分选步骤可以基于表面抗原针对抗原进行阴性选择，所述表面抗原在胚胎干细胞(ES细胞)诸如hESC，而不是间充质干细胞例如hESC-MSC上被高度表达为表面抗原。选择或分选可以基于已知的或先前鉴定的hESC特异性表面抗原诸如MIBP、ITGB1BP3和PODXL、和CD24。
FACS分析确认CD24在hESC上而不在hESC-MSC上表达。因此，可以单独地或者与作为阳性选择标志的CD105一起使用CD24作为阴性选择或分选标志物以从分化中的hESC培养物分离推定MSC。
实施例
自成人骨髓衍生的间充质干细胞(MSC)已经显现为用于治疗心血管疾病最有希望的干细胞类型之一(Pittenger和Martin，2004)。虽然已经将自体MSC的治疗效果归因于其分化成许多不同修复或替换细胞类型诸如心肌细胞、内皮细胞和血管平滑细胞的潜力(Minguell和Erices，2006；Zimmet和Hare，2005)，但是移植的MSC在受损伤的组织中变成治疗相关数目的功能修复细胞的分化功效仍有待建立。
最近的报告提示了这些修复效果的一些是由MSC分泌的旁分泌因子介导的(Caplan和Dennis，2006a；Gnecchi等，2005；Gnecchi等，2006；Schafer和Northoff，2008)。此旁分泌假设将根本不同的方面引入干细胞(特别是MSC)在再生性药物中的用途。MSC旁分泌作用的潜在机制包括内源性再生能力、血管发生和动脉生成、减弱重塑、和降低凋亡。若MSC的治疗效果是通过其分泌物部分介导的，则可以通过应用其分泌的因子来扩充基于干细胞的疗法的全集。此类办法能潜在地提供“现成的”基于MSC的治疗选项，其是以可承担的成本和卓越的质量控制和一致性，针对急性MI患者中的再灌注损伤的时间敏感性保护所必需的。
支持此旁分泌假设，许多研究已经鉴定了能主要经由心脏和血管组织生长和再生而潜在地修复受损伤的心脏组织的细胞因子、趋化因子和生长因子的存在(Caplan和Dennis，2006b；Liu和Hwang，2005)。我们通过实施对MSC旁分泌分泌物的第一次深入蛋白质组分析来进一步支持此假设(Sze等，2007)。这通过我们自人ESC衍生高度可扩充的且相同的MSC培养物(Lian等，2007)和使用化学成分确定的培养基来培养细胞并经由条件化培养基(CM)收获分泌物得以促进。令人惊讶地，分泌性蛋白质中许多是细胞内蛋白质，而且不知道是被分泌或转运穿过质膜的。对分泌物组(secretome)的计算分析预测分泌物组共同具有修复受损伤的组织诸如心肌缺血/再灌注(MI/R)损伤的潜力(Sze等，2007)。
为了测试计算预测，对MI/R损伤的猪模型施用CM形式的分泌物(Timmers等，2008)。在由冠状动脉阻塞引起的心肌缺血过程中，再灌注疗法是目前最有效的治疗形态。然而，牵涉打开受阻塞的动脉以恢复血流或再灌注的再灌注还诱导对新灌注的缺血组织的损伤(Saraste等，1997)。因此，如果可以在再灌注时即刻中和再灌注损伤，那么再灌注疗法的有效性可以得到极大的改善。在再灌注后立即将CM冠状动脉内投递至MI/R损伤的猪模型时，再灌注后早到4小时便有心肌梗死的60％降低、心脏功能的保持和降低的氧化应激。这确认MSC的旁分泌分泌物能改善临床相关动物模型中的MI/R损伤(Timmers等，2008)。
然而，分泌物介导对MI/R损伤的此即刻效果的机制是不清楚的。明显的是，这种保护效果的即刻性排除组织再生的相对长久过程为该机制的一部分。还有，分泌性蛋白质中许多是细胞内蛋白质，而且不知道是容易穿过质膜的。为了更好地了解MSC的旁分泌效果，我们使用具有不同分子量截留(MWCO)的膜系统地分级CM以鉴定和描绘活性级分的组成。我们先前显示了过滤流过0.2μM膜但不是1000kDa MWCO的CM是心脏保护性的(Timmers等，2008)。然而，针对具有1000kDa MWCO的膜部分浓缩的CM是心脏保护性的。这提示了心脏保护效果是由具有50-100nm直径的大复合物介导的。
在本文中，我们将我们先前报告的分泌物中的蛋白质列表扩充至大于700种蛋白质，并且这些蛋白质包括外来体中通常找到的许多蛋白质。我们还鉴定了分泌物中RNA(小于300nt)的存在。此外，磷脂小囊泡中包囊蛋白质和RNA，并且分泌物中仅在流体动力学半径(rh)范围1-1000nm内的可检出颗粒是rh＝45-55nm的。这些颗粒在HPLC分级上洗脱为单一峰。这些研究共同表明分泌物中大的心脏保护性复合物携带外来体的独特特征中的许多，这导致我们的假设，即分泌物中的活性心脏保护性成分是外来体。
实施例1：材料和方法：MSC-CM制备
先前已经描述了用于MSC生成和CM制备的方案15，16。
简言之，使用临床顺从性方案，通过自人胚胎干细胞(hESC)衍生的MSC条件化化学成分确定的无血清培养基。通过胰蛋白酶处理并在无饲养细胞和无血清的选择培养基中增殖来自HuES9hESC系或H1hESC系的hESC来生成三种多克隆、核型稳定的、且表型上MSC样的培养物，其不表达多能性相关标志物，但展示出MSC样表面抗原(CD29+、CD44+、CD49a+/e+、CD105+、CD166+、CD34-、CD45-)和基因表达谱15。
可以将这些培养物之一，即HuES9.E1稳定地扩充至少80个群体倍增。为了收获MSC分泌物，将hESC衍生的MSC培养物转移至化学成分确定的无血清培养基以使培养基条件化3天，之后收集含有MSC分泌物的培养基，通过离心来澄清，使用10kDa MW截留超滤膜来浓缩25倍，并通过过滤流过220nm滤器来除菌。
通过多维蛋白质鉴定技术(MuDPIT)和细胞因子抗体阵列分析来分析分泌性蛋白质组，并揭示201种独特的基因产物的存在。计算分析披露了此CM拥有潜在的细胞保护特性16。
实施例2：材料和方法：动物
所有实验依照由实验动物资源研究所(Institute of Laboratory AnimalResources)准备的“实验室猪护理和使用指南(Guide for the Care and Use ofLaboratory Pigs)”并依照由荷兰乌得勒支大学药学院动物实验委员会的在先批准实施。
实施例3：材料和方法：研究设计
将30只雌性DallandLandrace猪(60-70kg；IDDLO，Lelystad，荷兰)(均用氯吡格雷(clopidogrel)75mg/天预处理3天和用胺碘酮(amiodarone)400mg/天预处理10天)随机归入MSC-CM、非CM、或盐水处理。
添加盐水组以评估新鲜的、非条件化培养基的潜在效果。在所有猪中，通过近端左旋支冠状动脉(LCxCA)结扎75分钟和随后再灌注4小时来诱导MI。选择75分钟缺血期间以造成严重的心肌损伤，而不诱导完全透壁性心肌梗死(completely transmural myocardialinfarction)。使用4小时再灌注期，因为使用TTC染色的梗死大小测量在再灌注3小时后是最可靠的17。较长的再灌注期后，评估氧化应激状态和凋亡机制变得更困难。
通过静脉内输注MSC-CM(1.0ml、2.0mg蛋白质)、非CM或盐水在再灌注开始前5分钟启动处理。再灌注后立即给予额外的冠状动脉内推注MSC-CM(4.0ml、8.0mg蛋白质)、非CM或盐水。再灌注后4小时评估心肌梗死大小和功能。
实施例4：材料和方法：MI和操作规程
整个操作过程中，连续监测ECG、全身动脉压(Systemic Arterial Pressure)、和二氧化碳描记图。在如以前所描述的全身麻醉下18，实施正中胸骨切开术，并在颈动脉中插入两个引入片层(introduction sheet)，用于6Fr引导导管和8Fr电导导管(CD Leycom，Zoetermeer，荷兰)。
经由颈内静脉将Swan Ganz导管的远侧尖端放入肺动脉中。在近端主动脉和LCxCA周围放置Transonic流量探测器(Transonic Systems Inc，Ithaca，NY)以测量心排血量和冠脉血流量(coronary flow)，并在下腔静脉周围放置金属丝以使功能测量能在PV环的不同加载条件下进行。
功能测量后，静脉内施用10.000个IU的肝素，并收紧缝合线以阻塞近端LCxCA。在发生心室纤颤时使用用50J的内部心脏除颤。缺血75分钟后，通过解开缝合线来重新打开LCxCA。再灌注后立即经由引导导管通过LCxCA输注硝化甘油(0.1mg以防止无再流动)，接着用MSC-CM、非CM或盐水冠状动脉内处理。再灌注4小时后，实施最终的功能测量，并外植心脏，用于梗死大小分析。
实施例5：材料和方法：功能测量
使用电导导管方法来测量左心室(LV)压和体积，如先前所描述的18。展示自电导导管衍生的LV压和体积信号，并用Leycom CFL-512(CD Leycom)以250-Hz采样率获得。
在稳态期间和在暂时的腔静脉阻塞期间获得数据，均在呼气末时关闭呼吸器。用定制软件实施对压力-体积环的分析，如先前所描述的19。另外，在乳头中间(midpapillary)肌肉水平上获得短轴心外膜超声图(ProsoundSSD-5000，5-MHz探测器UST-5280-5，Aloka Holding Europe AG，Zug，瑞士)。在心舒期末(ED)和心缩期末(ES)测量梗死区域、遥远区域(隔膜)和LV内部区域(LVia)的壁厚度(WT)。收缩期壁增厚(SWT)计算为[(WT(ES)-WT(ED))/WT(ED)]*100％，分数区域缩短(fractional areashortening，FAS)为[(LVia(ES)-LVia(ED))/LVia(ED)]*100％，而左心室射血分数(LVEF)为[(EDV-ESV)/EDV]*100％。
依靠舒张末期压力-体积关系的线性回归来量化舒张末期室腔僵硬。在MI前、缺血后1小时和再灌注后4小时测量超声波心动描记术和PV环。为了考验心肌顿挫(stunned myocardium)，在通过静脉内多巴酚丁胺(dobutamine)输注(2.5μg/kg/分钟和5.0μg/kg/分钟)的药物诱导的应激过程中实施别的测量。
实施例6：材料和方法：梗死大小
就在切出心脏前，在与进行MI诱导完全相同的位置再结扎LCxCA(猪)或LCA(小鼠)。经由冠状系统来输注伊文思蓝染料以描绘危险区(AAR)。
然后切出心脏，将LV分离，并从尖端向基部切成5片。将片在37℃缓冲液(13.6g/L KH2PO4+17.8g/L Na2HPO4·2H2O，pH 7.4)中的1％氯三苯四唑(TTC，Sigma-Aldrich Chemicals，Zwijndrecht，荷兰)中温育15分钟以区别梗死组织与可存活心肌。
从两侧扫描所有片，并且在每个载玻片中，通过使用数字测面法软件(Image J)来比较梗死面积与危险区和总面积。校正片重量后，梗死大小计算为AAR的百分比和LV的百分比。
实施例7：材料和方法：氧化诱导的细胞死亡测定法
将人白血病CEM细胞在CM或非CM中温育，并用50μM H2O2处理以诱导氧化应激。在H2O2处理后12、24、36和48小时时使用锥虫蓝排除来评估细胞存活。
实施例8：材料和方法：免疫染色
通过对8-羟基-2’-脱氧鸟苷(8-OHdG)(一种对DNA氧化应激的产物)免疫染色来评估缺血和再灌注区域中的细胞核氧化应激。将组织样品在4％福尔马林中固定，之后包埋在石蜡中。
在10mM柠檬酸中抗原修复后，将组织切片与10％正常的马血清一起温育30分钟，与0.1％PBSA中的小鼠抗8-OHdG(OXIS international，Foster City，CA，USA)1∶20于4℃一起温育过夜，与经生物素标记的马抗小鼠(Vectorlaboratories，Burlingame，CA，USA)1∶500一起温育1小时，并与链霉亲合素-HRPO 1∶1000一起温育1小时。
最后，将切片与H2O2-二氨基联苯胺一起温育10分钟。用数字图像显微术软件分析(Olympus，Münster，德国)以200x放大率在每片切片4个随机挑选的视野中量化8-OHdG阳性细胞核的量。
实施例9：材料和方法：Western印迹
使用1ml Tripure分离试剂(Boehringer，Mannheim，德国)依照制造商的方案自从猪的缺血/再灌注区域收集的冷冻组织样品分离蛋白质。对于Western印迹，将8μg总蛋白质在10％SDS-PAGE凝胶上分开，转移至硝酸纤维素C膜(Amersham，Buckinghamshire，UK)上，并使用磷酸盐缓冲盐水(PBS)-0.1％Tween-5％Protifar(Nutricia，荷兰)来封闭。
将膜与针对磷酸SMAD21∶1000(Cell Signalling Technology)、活性胱天蛋白酶31∶100(Chemicon，德国)、或β-微管蛋白1∶5000(Abcam，Cambridge，UK)的家兔抗体一起温育，随后与山羊抗家兔HRP 1∶2000(DAKO，Glostrup，丹麦)一起温育。使用化学发光底物(NENk Life Science Products)来检测；使用GelDoc 1000系统(Biorad，Veenendaal，荷兰)来分析条带。
实施例10：材料和方法：MSC-CM分级
通过无菌过滤流过220nm滤器来制备MSC-CM，并经由10nm滤器来浓缩，因此含有10和220nm之间的成分。随后，通过将MSC-CM过滤流过具有100nm名义上的孔大小的1000kDa MW截留膜(Pall Corporation，新加坡)来制备小于1000kDa的级分，生成含有10和100nm之间的产物的级分。
为了鉴定含有培养基内赋予心脏保护的因子(10-100nm或100-220nm)的级分，使用缺血和再灌注损伤的小鼠或猪模型。通过30分钟左冠状动脉(LCA)阻塞，随后再灌注来诱导MI。经由尾静脉用20μl未分级的MSC-CM(10-220nm)、小于1000kDa的级分(10-100nm)、或盐水静脉内处理小鼠，5分钟后再灌注。24小时后使用伊文思蓝和TTC来评估梗死大小，如先前所描述的。
实施例11：材料和方法：数据分析
数据呈现为均值±SEM。以不知情的方式收集数据，并使用单因素ANOVA用SPSS 11.5中的事后Bonferroni检验来比较。认为P值小于0.05是显著的。
实施例12：结果：死亡率
处理前，4只猪由于缺血期间的顽固性心室纤颤(refractory ventricularfibrillation)而死亡，并且因此从研究排除。用CM(n＝9)、非CM(n＝9)或盐水(n＝8)处理的所有猪也都活过追踪期(follow up period)。
实施例13：结果：梗死形成大小
与那些用非CM和盐水处理的猪相比，梗死大小(与危险区(AAR)相比以及与LV相比)在用MSC-CM处理的猪中是显著降低的(图1)。MSC-CM处理导致梗死大小的约60％降低。重要地，AAR在所有猪中是相似的，这指明初始的缺血损伤在所有猪中是相似的(下文表E1)。
Figure BPA00001248880800601
Figure BPA00001248880800611
表E1。血液动力学和功能参数。用非CM、CM或盐水处理的猪的基线值和心肌梗死值，其用超声波心动描记术和基于电导导管的LV压和体积测量来测定。AAR指明危险区；IS，梗死大小；LV，左心室；HR，心率；QLCx，左旋支冠状动脉流；CO，心排血量；WT，壁厚度；SWT，收缩期壁增厚；FAS，分数区域缩短；EDV，舒张期末容积；ESV，收缩期末容积；SV，每搏量；EF，射血分数；Ees，收缩期末弹性。非CM，n＝9；CM，n＝9；盐水，n＝8。*p＜0.05对基线；
Figure BPA00001248880800612
p＜0.05对非CM；
Figure BPA00001248880800613
p＜0.05对盐水。
实施例14：结果：心脏功能
基线参数在所有组中是相似的(上文表E1)。缺血期间，后外侧壁在所有组中变得完全运动障碍，如通过超声心动图收缩期壁增厚(SWT，图2A)的负值所观察到的。再灌注后4小时，非CM和盐水对照组两者的再灌注后外侧壁仍是运动障碍的。然而，在用MCS-CM处理的猪中，SWT部分恢复(图2A)。
β1-肾上腺素能受体激动剂多巴酚丁胺的静脉内输注在经MCS-CM处理的猪中进一步提高收缩期壁增厚，而在对照组中没有看到改善。还有，全局左心室收缩功能由于缺血而降低(图2B)。在用CM处理的猪中，分数区域缩短在再灌注后升高，几乎回到基线水平，并且在多巴酚丁胺输注过程中升高到基线水平以上。
在对照猪中，全局收缩功能仍受损伤。从PV-环衍生的指标看，改善的心脏功能也变得明显(表E1)。左心室EF和每搏量在经CM处理的猪中是显著较高的。这转化为改善的血液动力学参数，诸如心排血量、动脉压均值和心率。
舒张功能在缺血和再灌注损伤后在对照组中降低，如通过升高的舒张末期心肌僵硬所观察到的。然而，在经CM处理的猪中，舒张功能没有受到损伤。
实施例15：结果：氧化应激
已经证明了梗死大小的降低和功能的改善，我们使用过氧化氢(H2O2)诱导的细胞死亡的体外测定法来测定CM和非CM对氧化应激(即缺血再灌注损伤的一项主要原因)的影响。
我们在存在CM或非CM的情况中在人白血病CEM细胞中诱导过氧化氢(H2O2)介导的氧化应激，并通过锥虫蓝排除来监测细胞存活。结果显示了与非CM相比，CM显著提供保护不受(H2O2)诱导的细胞存活损失(p＜0.05)(图3A)。
为了测定CM是否还降低经CM处理的猪的心脏中的氧化应激，通过对氧化的DNA的8-OHdG免疫染色来量化用CM、非CM或盐水处理的猪的组织切片中的细胞核氧化应激。与经CM处理的猪相比，在经非CM或盐水处理的猪的切片中观察到指明DNA氧化的强烈的细胞核染色(图3B-D)。另外，在经非CM或盐水处理的猪中还有显著更多的阳性细胞核(图3E)。
因此，CM能在体外和在体内赋予针对氧化应激的细胞保护。
实施例16：结果：TGF-β信号传导
MSC的分泌物含有许多牵涉TGF-β信号传导的蛋白质16。为了在体内评估CM处理对TGF-β信号传导的影响，我们通过Western印迹来量化经CM处理的猪和对照猪的心肌组织样品中磷酸化的SMAD-2。CM处理导致降低的pSMAD2表达，这指明经由ALK-5的TGF-β信号传导是降低的(图4A、4B)。
实施例17：结果：凋亡
再灌注损伤经由凋亡而不是坏死来引起细胞死亡20-22。为了证实CM处理在再灌注过程中降低凋亡，我们通过Western印迹来量化活性胱天蛋白酶3(即一种关键的凋亡介导物)的水平。在用MSC-CM处理的猪中，与非CM对照和盐水对照两者相比，活性胱天蛋白酶3水平较低，这提示CM在体内抑制凋亡(图4C、4D)。
实施例18：结果：MSC-CM分级
未分级的MSC-CM含有10和220nm之间的产物。为了更近地达到鉴定MSC-CM内的心脏保护因子，生成含有大小范围为10-100nm的产物的小于1000kDa级分。未分级的MSC-CM赋予心脏保护，而小于1000kDa级分不然(图5)，这指明心脏保护因子在具有大小范围为100至220nm的大于1000kDa级分中。
实施例19：结果：大小分级没有依照分子量分离分泌性蛋白质
为了鉴定条件化培养基中的活性成分，我们试图通过将条件化培养基过滤流过具有不同MW截留的膜来将条件化培养基大小分级成独特的MW级分。
在将条件化培养基过滤流过MW截留100kD的膜以生成4∶1的保留物比滤液体积比时，大多数小于100kD的蛋白质分离入大于100kD的级分中，而不进入预期的小于100kD级分中(图6)。未分级的条件化培养基和大于100kD级分两者中的各蛋白质条带的比率是相似的。
大多数具有MW小于300kD的蛋白质也没有过滤流过具有MW截留300kD的膜(图6)。滤液中的一些主要蛋白质条带的MW大小与非条件化培养基(NCM)中的和与培养基中外源添加的蛋白质补充物：胰岛素-转铁蛋白-含硒蛋白质补充物(ITS)、FGF2、EGF和PDGF AB相似(图7)。
这些观察共同提示了由细胞分泌的蛋白质在复合物中，而且这些分泌复合物是作为补充物向培养基外源添加的大于100kD蛋白质，而小于100kD的蛋白质容易过滤流过具有100kD MW截留的膜。
实施例20：结果：具有大于1,000kD的MW或50-150nm直径的大小分级的条件化培养基中的生物学活性
为了测定推定的分泌复合物的大小上限和下限，我们实施条件化培养基的大小分级，并测试在缺血再灌注损伤的小鼠中的生物学活性。因为将条件化培养基过滤流过0.2μM滤器，并针对具有MW截留10kD的膜进行浓缩，这有效地将推定的分泌复合物放置在2至200nm之间的大小范围中(图8)。
为了进一步使这种大小范围变窄，我们测定来自将条件化培养基完全过滤流过具有100kD或1000kD的MW截留的膜的滤液、来自将条件化培养基过滤流过具有1000kD的MW截留的膜的保留物中是否有生物学活性。保留物的体积占输入体积的1/5。对心肌缺血(MI)和再灌注损伤的小鼠或猪模型测试级分。
在此模型中，通过缝合线结扎进行30分钟左冠状动脉(LCA)阻塞，从而诱导MI，并通过除去缝合线来启动再灌注。经由尾静脉用20μl未分级的MSC-CM(10-220nm)、20μl小于100或1,000kD级分、4μl大于1000kD保留物或盐水静脉内处理小鼠，5分钟后进行再灌注。24小时后，切出心脏。切出前，通过再结扎LCA，然后经由主动脉灌注伊文思蓝来测定危险区(AAR)。AAR定义为不被染料染色的面积，并且表示为左心室壁面积的百分比。24小时后使用伊文思蓝和TTC来评估梗死大小，如先前所描述的。
所有动物中的相对AAR不是显著不同的(图9)。然而，在与盐水比较时，相对梗死大小在用条件化培养基和大于1000kD级分处理的动物中是显著降低的(分别为p＝0.01和0.05)(图10)。小于100和小于1000kD级分没有生物学活性，这提示了推定的活性复合物大于1000kD。然而，仍有可能的是，复合物小于1000kD，而且使条件化培养基流过滤器使复合物失活。
实施例21：结果：条件化培养基的电子显微术揭示50至200nm颗粒的存在
使用标准方法来实施对条件化培养基的电子显微术分析。简言之，将PBS中的条件化培养基加载至Formwar碳包被的网格(Ted Pella Inc，Redding，CA，USA产品目录编号01800N-F)上，在2.5％戊二醛中固定，清洗，在2％乙酸双氧铀中形成反差，包埋于乙酸双氧铀(0.8％)和甲基纤维素(0.13％)的混合物中，并在电子显微镜下检查。与上文的大小分级研究一致，我们观察到约50-150nm的许多小囊泡的存在，这提示这些小囊泡是分泌物中推定的活性复合物(图11)。
该假设得到如下观察的支持，即在将条件化培养基以200,000×g超速离心1小时时，在如先前所描述的那样20通过LC/LC-MS测定时沉淀物含有分泌物中找到的蛋白质的至少70％。
实施例22：结果：条件化培养基的脂质组成
为了分析条件化培养基的脂质组成，通过Folch规程来提取条件化培养基和NCM的疏水性脂质/类固醇成分。简言之，将50ml条件化培养基或NCM与5ml氯仿和2ml甲醇剧烈混合。容许有机相与水相分开。取出底部的氯仿层，并通过Speedvac蒸发至干燥。
将残留物在甲醇中重建，用于LC-MS/MS分析。然后用二氯甲烷/甲醇/水/乙胺流动相将样品注射至正相(硅土相)HPLC柱。然后通过纳米喷射(nanospray)至LTQ-FTMS/Orbitrap来使洗脱液在线离子化。以交替的正的和负的模式运行LTQ-FTMS/Orbitrap以检测具有不同化学特性的脂质/类固醇。通过MS/MS扫描来进一步分析每次MS扫描的前5种前体离子。
因此，通过FTMS和LTQ的组合来表征分子。首先将每个串联质谱的前体质量与脂质和代谢数据库中的候选物相配。然后将与数据库中的任何分子具有小于5pmm质量误差的离子的MS/MS谱与已知的标准谱或由MassFrontier程序预测的谱比较。
对来自条件化培养基的氯仿提取物的质谱术分析揭示质膜中(即磷脂、糖脂、和类固醇)和还有外来体中通常找到的脂质的存在35。磷脂包括磷脂酰丝氨酸和磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、神经酰胺；糖脂诸如脑苷脂和类固醇诸如胆固醇。
已经观察到外来体在其脂膜中具有称为脂筏的微域22，24-35 41，42。外来体是富含胆固醇的，而且其胆固醇-磷脂比率一般超过质膜中找到的0.3-0.4(mol/mol)的比率35。这些筏以它们对非离子型去污剂诸如Triton X-100或Brij-98于低温的溶解的抗性和它们对结合胆固醇的环糊精的敏感性为特征。一般地，常常使用去污剂诸如Triton X-100中不溶的和去污剂不溶性来鉴定脂筏的存在。
在用Triton X-100处理条件化培养基时，分泌性蛋白质继续作为复合物分离，这不依赖于使用膜过滤进行的它们的大小分级实验(图12)，提示推定的复合物对Triton X-100的溶解有抗性，这与脂筏的存在一致43。
我们测定复合物是否对存在20mM环糊精的情况中的溶解敏感。如果推定的复合物在膜中具有脂筏，那么通过环糊精提取胆固醇引起溶解，而且释放蛋白质，然后所述蛋白质能依照其分子大小进行大小分级。使用层析和质谱术技术来评估推定的复合物中的脂质的相对定量组成，如先前所概述的35。这测定脂质组成是否能支持脂筏的存在。
实施例23：结果：条件化培养基的RNA组成
如自细胞提取RNA中通常使用的，条件化培养基的Trizol提取接着进行异丙醇沉淀生成在水中具有260∶280nm吸光度比率1.9的沉淀物，这提示了它可能是RNA。
这与先前的报告，即外来体含有mRNA和微小RNA一致36。对此沉淀物测定对RNA酶活性的敏感性。也会用RNA酶处理条件化培养基，之后用Trizol提取。这些测定法测定沉淀物是否是RNA，及RNA是否被隔离在脂质小囊泡诸如外来体中。
如果这样的话，通过通用基因表达测定法诸如微阵列、测序、RT-PCR和体外翻译测定法来测定RNA以测定RNA的组成和功能。使用具有和没有15N-亮氨酸的标准商品化网织红细胞溶胞物系统在体外翻译RNA。通过质谱术鉴定翻译的蛋白质产物。
实施例24：结果：蛋白质组序型
描述为存在于分泌物中的约700种蛋白质中(美国临时专利申请No.60/878,222和国际申请PCT/SG2006/000232。Mesenchymal Stem CellConditioned Medium(间充质干细胞条件化培养基))，有发现为其它外来体的蛋白质组中通常存在的许多蛋白质(图13)44。还有约700种蛋白质的列表中尚未描述为存在于外来体中的许多蛋白质。一些值得注意的但不是穷举的例子是Thy1、Wnt 5a、Wnt 5b、抑制素A(或激活素A)。
实施例25：结果：表面抗原序型
条件化培养基的蛋白质组序型还描述已知为膜结合的蛋白质的存在。一些值得注意的但不是穷举的例子包括CD9、CD109、thy-120。外来体的其它已知表面抗原诸如在尿中分泌的外来体的表面上找到的CD2445不在MSC19或其分泌物20中表达。
另外，这些表面抗原中许多以细胞类型特异性方式表达。这些观察共同提示了表面抗原序型会限定并区别来自不同细胞来源的外来体。为了表征这些推定的分泌复合物的表面抗原序型，使用标准的商品化生物素化试剂盒来使条件化培养基生物素化。在Western印迹分析中使用标准的方案将蛋白质在标准的SDS-PAGE上分开，转移到尼龙或硝酸纤维素上，并用亲合素-过氧化物酶探查。在此方案中，仅在复合物上的表面上且在物理上易接近生物素的蛋白质被生物素化。复合物内的并且因此在物理上不易接近的所有蛋白质被生物素化。也使用亲合素-亲和层析来分离生物素化的蛋白质，并使用LC/MS来鉴定。通过MSC的Western印迹分析、免疫电子显微术和基因表达来确认这些蛋白质的身份。
实施例26：外来体
基于上文的观察，我们假设条件化培养基中最小的活性心脏保护单元是外来体。
为了证明此假设，我们使用具有MW截留100kD的膜的膜过滤技术来浓缩条件化培养基。然后以约150-200000g将浓缩的条件化培养基超速离心1-2小时。将沉淀物在PBS中重悬，通过电子显微术来分析以确认具有大小范围50-150nm的颗粒的存在，并测定其蛋白质、脂质和RNA含量。
对悬浮液测定对条件化培养基在计算上预测的生物学活性20，并分别在小鼠和猪模型中测试心脏保护效果，如上文或下文所描述的。
实施例27：猪研究的研究设计
将30只雌性Dalland Landrace猪(60-70kg；IDDLO，Lelystad，荷兰)(均用氯吡格雷75mg/天预处理3天和用胺碘酮400mg/天预处理10天)随机归入MSC-CM、非CM、或盐水处理。
添加盐水组以评估新鲜的、非条件化培养基的潜在效果。在所有猪中，通过近端左旋支冠状动脉(LCxCA)结扎75分钟和随后再灌注4小时来诱导MI。选择75分钟缺血期间以造成严重的心肌损伤，而不诱导完全透壁性心肌梗死。使用4小时再灌注期，因为使用TTC染色的梗死大小测量在再灌注3小时后是最可靠的46。
较长的再灌注期后，评估氧化应激状态和凋亡机制变得更困难。通过静脉内输注MSC-CM(1.0ml、2.0mg蛋白质)、非CM或盐水在再灌注开始前5分钟启动处理。再灌注后立即给予额外的冠状动脉内推注MSC-CM(4.0ml、8.0mg蛋白质)、非CM或盐水。再灌注后4小时评估心肌梗死大小和功能。
为了鉴定培养基内赋予心脏保护的因子，我们使用缺血和再灌注损伤的小鼠或猪模型。通过30分钟左冠状动脉(LCA)阻塞，随后再灌注来诱导MI。经由尾静脉用未分级的条件化培养基、小于1000kDa的级分、小于500kD的级分、小于300kD的级分、小于100kD的级分或盐水静脉内处理小鼠，5分钟后再灌注。第二天(再灌注后24小时)评估梗死大小。
实施例28：MI和操作规程
整个操作过程中，连续监测ECG、全身动脉压、和二氧化碳描记图。在如以前所描述的全身麻醉下47，实施正中胸骨切开术，并在颈动脉中插入两个引入片层，用于6Fr引导导管和8Fr电导导管(CD Leycom，Zoetermeer，荷兰)。
经由颈内静脉将Swan Ganz导管的远侧尖端放入肺动脉中。在近端主动脉和LCxCA周围放置Transonic流量探测器(Transonic Systems Inc，Ithaca，NY)以测量心排血量和冠脉血流量，并在下腔静脉周围放置金属丝以使功能测量能在PV环的不同加载条件下进行。功能测量后，静脉内施用10.000个IU的肝素，并收紧缝合线以阻塞近端LCxCA。在发生心室纤颤时使用用50J的内部心脏除颤。缺血75分钟后，通过解开缝合线来重新打开LCxCA。再灌注后立即经由引导导管通过LCxCA输注硝化甘油(0.1mg以防止无再流动)，接着用MSC-CM、非CM或盐水冠状动脉内处理。再灌注4小时后，实施最终的功能测量，并外植心脏，用于梗死大小分析。
用芬太尼(Fentanyl)(0.05mg/kg)、多美康(Dormicum)(5mg/kg)和Domitor(0.5mg/kg)麻醉小鼠，并使用具有钝端的24号静脉内导管插管。使用啮齿类呼吸器用添加有异氟烷(2.5-3.0％体积/体积)的O2和N2O(1∶2体积/体积)的混合物以105次摆动/分钟的速率使小鼠人工换气。将小鼠在加热垫上放置以将体温维持在37℃。在第三肋间隙中打开胸腔，并使用8-0聚丙烯纺织纤维缝合线来阻塞左冠状动脉(LCA)达30分钟。闭合胸腔，并在第二天(24小时后)，外植心脏，用于梗死大小分析。
实施例29：功能测量
以250Hz的采样率使ECG、动脉压和心排血量数字化，并贮存用于离线分析(Leycom CFL-512，CD Leycom)。使用电导导管方法来测量左心室(LV)压和体积，如先前所描述的47。展示自电导导管衍生的LV压和体积信号，并用Leycom CFL-512(CD Leycom)以250-Hz采样率获得。
在稳态期间和在短暂的腔静脉阻塞期间获得数据，均在呼气末时关闭呼吸器。用定制软件实施对压力-体积环的分析，如先前所描述的48。另外，在乳头中间肌肉水平上获得短轴心外膜超声图(Prosound SSD-5000，5-MHz探测器UST-5280-5，Aloka Holding Europe AG，Zug，瑞士)。在心舒期末(ED)和心缩期末(ES)测量梗死区域、遥远区域(隔膜)和LV内部区域(LVia)的壁厚度(WT)。
收缩期壁增厚(SWT)计算为[(WT(ES)-WT(ED))/WT(ED)]*100％，分数区域缩短(fractional area shortening，FAS)为[(LVia(ES)-LVia(ED))/LVia(ED)]*100％，而左心室射血分数(LVEF)为[(EDV-ESV)/EDV]*100％。依靠舒张末期压力-容积关系的线性回归来量化舒张末期室腔僵直。在MI前、缺血后1小时和再灌注后4小时测量超声波心动描记术和PV环。为了考验心肌顿挫，在通过静脉内多巴酚丁胺输注(2.5μg/kg/分钟和5.0μg/kg/分钟)的药物诱导的应激过程中实施别的测量。
实施例30：梗死大小
就在切出心脏前，在与进行MI诱导完全相同的位置再结扎LCxCA(猪)或LCA(小鼠)。经由冠状系统来输注伊文思蓝染料以描绘危险区(AAR)。然后切出心脏，将LV分离，并从尖端向基部切成5片。
将片在37℃
Figure BPA00001248880800691
缓冲液(13.6g/L KH2PO4+17.8g/L Na2HPO4·2H2O，pH 7.4)中的1％氯三苯四唑(TTC，Sigma-Aldrich Chemicals，Zwijndrecht，荷兰)中温育15分钟以区别梗死组织与可存活心肌。
从两侧扫描所有片，并且在每个载玻片中，通过使用数字测面法软件(Image J)来比较梗死面积与危险区和总面积。校正片重量后，梗死大小计算为AAR的百分比和LV的百分比。
实施例31：材料和方法：条件化培养基的制备
如先前所描述的那样培养HuES9.E1细胞(Lian等，2007；Sze等，2007)。
简言之，用PBS将80％汇合的HuES9.E1细胞培养物清洗三次，并在化学成分确定的培养基中培养过夜，所述化学成分确定的培养基由没有酚红的DMEM(产品目录号31053，Invitrogen)组成，并且补充有胰岛素、转铁蛋白、和含硒蛋白质(ITS)(Invitrogen)、5ng/ml FGF2(Invitrogen)、5ng/ml PDGF AB(Peprotech，Rocky Hill，NJ)、谷氨酰胺-青霉素-链霉素、和b-巯基乙醇。然后用PBS漂洗培养物三次，然后添加新鲜的确定成分培养基。
3天后，将培养基收集，以500xg离心，并浓缩。通过使用100kDa MWCO切向力过滤(TFF)使CM浓缩50x来制备大于100kDa CM样品。使用超滤膜来实施所有其它浓缩。在所有规程后将所有CM和其它不同处理的CM经过0.2微米过滤，并且之后贮存或使用。
实施例32：材料和方法：LC MS/MS分析
将2ml经透析的条件化(CM)或非条件化培养基(NCM)中的蛋白质还原，烃基化，并进行胰蛋白酶消化，如先前所描述的(Sze等，2007)。然后通过将经消化的混合物流过条件化的Sep-Pak C-18SPE筒(Waters，Milford，MA，USA)来使样品脱盐，用3％乙腈(ACN)(JT Baker，Phillipsburg，NJ)和0.1％甲酸(FA)缓冲液清洗两次，并用70％CAN和0.1％FA缓冲液洗脱。然后通过在真空离心机中除去有机溶剂来将洗脱的样品干燥至约10％的其初始体积。
为了降低样品复杂性，用HPLC系统(Shimadzu，日本)经由PolysulfoethylSCX柱(200mm x 4.6mm)(PolyLC，USA)实施离线肽分级。以1ml/分钟的流动相A(5mM KH4PO4+30％乙腈)和流动相B(5mM KH4PO4+30％乙腈+350mM KCl)。收集8份级分，并用真空离心机干燥。将分级的样品加载入与装备有纳米喷射源的LTQ-FT超线性离子阱质谱仪(Thermo Electron，San Jose，CA)在线偶联的Shimadzu DGU-20A3C18反相HPLC系统的自动取样器中。在Zorvax 300SB-C18富集柱(5mm x 03mm，Agilent Technologies，德国)中捕获注射的肽，并洗脱入纳米孔径的C18填充柱(
Figure BPA00001248880800701
MichromBioresources，Auburn，CA)中。
使用以200nl/分钟流速的90分钟梯度来将肽洗脱入质谱仪中。通过对来自FTMS中每次MS扫描的最强烈的峰中8个实施MS/MS扫描以数据依赖性模式操作LTQ。对于每次实验，通过始位书写程序(home-written program)将8份SCX级分的MS/MS(dta)谱组合成单一Mascot通用文件。经由内部Mascot服务器(第2.2版，Matrix Science，UK)通过针对IPI人蛋白质数据库(第3.34版；67,758种序列)搜索组合的数据来实现蛋白质鉴定。搜索参数是：最多2次错过使用胰蛋白酶的切割；固定的修饰是对半胱氨酸的氨甲酰基甲基化，而可变的修饰是对甲硫氨酸的氧化。对于肽前体和片段离子，质量容差分别设置成20ppm和0.8Da。如果发现两种不同肽具有大于同源性得分的得分，那么将蛋白质鉴定视作真肯定。
实施例33：材料和方法：HPLC分级和使用准弹性光散射(QELS)检测器的动态光散射
仪器设置由液相层析系统及二元泵(binary pump)、自动注射器、恒温柱炉和通过来自Shimadzu公司(Kyoto，日本)的Class VP软件操作的UV-可见光检测器组成。所使用的层析柱是来自Tosoh公司(Tokyo，日本)的TSK保护柱SWXL，6x40mm和TSK凝胶G4000SWXL，7.8x300mm。在UV-可见光检测器后串联连接下列检测器，即Dawn 8(光散射)、Optilab(折光率)和QELS(动态光散射)。最后三种检测器来自Wyatt Technology公司(California，USA)，并且通过ASTRA软件操作。
通过大小排阻，即较大的分子会在较小的分子之前洗脱来分开样品的成分。所使用的洗脱缓冲液是具有150mM NaCl pH 7.2的20mM磷酸盐缓冲液。将此缓冲液在使用前过滤流过0.1μm的孔大小，并脱气15分钟。以0.5ml/分钟的流速平衡层析系统，直至Dawn 8中的信号稳定在0.3左右检测器电压单位。将UV-可见光检测器设置于220nm，并且将该柱用炉平衡至25℃。洗脱模式是等度的，并且运行时间是40分钟。注射样品的体积范围为50至100μl。自UV-可见光检测器对外来体峰对所有其它峰的％面积积分。通过QELS和Dawn 8检测器计算流体动力学半径Rh。将峰顶点处的最高计数率(Hz)视为Rh。
将于220nm显现的分开成分的峰收集为级分，用于进一步表征研究。
实施例34：材料和方法：蔗糖梯度密度平衡离心
对于蔗糖梯度密度平衡离心，制备具有22.8-60％(w/v)浓度的14种蔗糖溶液。在SW60Ti超速离心管(Beckman Coulter Inc.，Fullerton CA，USA)的底部使最浓的溶液成层，接着是下个最高的蔗糖浓度。小心地在顶部加载CM，之后以200,000Xg，4℃在SW60Ti转子(Beckman Coulter Inc.)中超速离心16.5小时。从蔗糖梯度的顶部向底部收集16份级分。使用微量天平来计算所有蔗糖级分的密度，并合并成13份级分。对于一些CM，用细胞溶解缓冲液(细胞提取缓冲液，Biovision，www.BioVision.com)预处理CM，之后在蔗糖梯度密度平衡离心上加载。将溶解缓冲液以1∶1体积比与蛋白酶抑制剂混合物(Halt蛋白酶抑制剂混合物，没有EDTA，Thermo Scientific，www.thermofisher.com)一起添加至CM。将混合物于室温在温和摇动的情况中温育30分钟。
实施例35：材料和方法：蛋白质定量
使用NanoOrange蛋白质量化试剂盒(Invitrogen)依照制造商的指令来量化CM的蛋白质浓度。
实施例36：材料和方法：SDS-PAGE和Western印迹分析
将CM的总蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶上分开，之后转移至硝酸纤维素膜(Amersham Biosciences，Uppsala，瑞典)。将膜封闭，与针对人CD9、CD81、SOD-1、丙酮酸激酶、Alix、Tsp-1的小鼠抗体，接着与针对小鼠一抗的偶联有辣根过氧化物酶的二抗一起温育。然后将印迹与化学发光的HRP底物一起温育以检测结合的一抗，并且因此检测抗原的存在。
实施例37：材料和方法：鞘磷脂、磷脂酰胆碱和胆固醇测定法
使用商品化测定试剂盒来测量CM和来自以100,000xg于4℃超速离心CM达2小时的沉淀物的两份独立制备物中的胆固醇、鞘磷脂和磷脂酰胆碱浓度。使用
Figure BPA00001248880800721
红胆固醇测定试剂盒(Molecular Probes，USA)来测量胆固醇，通过鞘磷脂测定试剂盒(Cayman Chemical Company，Ann Arbor，MI，USA)来测量鞘磷脂，并使用磷脂酰胆碱测定试剂盒(Cayman Chemical Company，Ann Arbor，MI，USA)来测量磷脂酰胆碱。
实施例38：材料和方法：有限的胰蛋白酶处理条件化培养基
用/不用Triton x或溶解缓冲液于4℃在温和摇动的情况中处理CM达30分钟。容许通过于室温在温和摇动的情况中将胰蛋白酶添加至经处理的CM达3秒至20分钟来实施蛋白水解消化。使用胰蛋白酶抑制剂PMSF来停止消化。
实施例39：材料和方法：miRNA微阵列分析
通过miRNA微阵列来分析来自MSC的总细胞RNA的两个生物学重复和来自CM的分泌性RNA的两个生物学重复。将杂交和数据分析外包给LCSciences，LLC(www.LCsciences.com)。芯片含有Sanger miRBase Release 10.1(http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/)中所列miRNA转录物的探针。
实施例40：结果：心脏保护性分泌物含有形成多蛋白质复合物的外来体相关蛋白
为了鉴定活性成分，我们先前已经通过超滤流过具有不同MWCO的膜来分级CM。显示了在将CM过滤流过具有1000kDa的MWCO的膜时，滤液不是保护性的。然而，针对类似的膜浓缩约125倍的CM在缺血/再灌注损伤的小鼠模型中是心脏保护性的。总之，过滤流过具有小于0.2μm的MWCO诸如100kDa、300kDa、500kDa或1000kDa的滤器不是心脏保护性的(图14)，但针对1000kDa膜(Timmers等，2008)或100kDa膜浓缩的CM是心脏保护性的(图14)。则这些观察提示活性级分由大于1000kDa或具有50-100nm直径的大复合物组成。基于颗粒的大小范围，我们假定CM中的颗粒是外来体。外来体是自具有双脂膜的多泡体形成的(Fevrier和Raposo，2004；Keller等，2006)，所述双脂膜与质膜具有相同的取向。已知它们是由许多细胞类型生成的，并且认为在细胞间通讯中是重要的。外来体具有40-100nm的直径。已经显示了外来体是由许多细胞类型分泌的，并且这些外来体的蛋白质组成表现为细胞特异性的。然而，一些蛋白质诸如CD9、丙酮酸激酶和Alix表现为通常在外来体中表达(Sze等，2007)。我们先前已经鉴定了分泌物中的约201种蛋白质(Sze等，2007)。
在本文中，通过修改我们蛋白质组分析中我们先前描述的方法，我们将列表扩充至793种蛋白质(表E2)，如材料和方法中所详述的。793种含有外来体相关蛋白中的许多诸如CD9、CD81、Alix、TSP-1、SOD-1和丙酮酸激酶(Olver和Vidal，2007)。我们通过Western印迹分析确认了分泌物中这些蛋白质的存在(第1道，图15)。CD81、CD9和Alix的免疫共沉淀支持其与外来体的关联和分泌物中外来体的存在。TSP-1、SOD-1和丙酮酸激酶不与CD81免疫共沉淀，这提示这些蛋白质不存在于CD81+外来体中或者根本不存在于外来体中。(图15)。
表E2(下文)。通过LC-MS/MS和抗体阵列鉴定的739种独特基因产物的
按字母顺序列表
Figure S05820517620061225D000101
Figure S05820517620061225D000102
表E2。CM的蛋白质组序型，如通过LC MS/MS和抗体阵列所测定的。分析4份独立样品。在4份样品的至少3份中检测出表中的每种蛋白质。
表E2中的上述蛋白质中，通过LC MS/MS和抗体阵列鉴定出TIMP1、TIMP2、TNFRSF11B、LGALS3、ALCAM、DCN、SFRP1、GDF15、PDGFC、PTX3、LTBP1、IGFBP2、GREM1、IGFBP7、MIF、MMP1、PLAU、INHBA和THBS1。通过对由培养细胞所分泌的外来体进行的LC MS/MS和至少4项研究鉴定PPIA、HIST1H4、PPIB、HIST1H4A、HIST1H4B、HIST1H4C、HIST1H4D、HIST1H4E、HIST1H4F、HIST1H4H、HIST1H4I、HIST1H4J、HIST1H4K、HIST1H4L、HIST2H2AA3、HIST2H2AA4、HIST2H4A、HIST2H4B、HIST4H4、HLA-A、HLA-B、SDCBP、TUBA1A、TUBA6、TUBA8、GAPDH、TUBB、TUBB2C、TUBB3、TUBB4、TUBB6、TUBB8、HSP90AB1、ANXA1、HSP90B1、ANXA2、ANXA5、ANXA6、PDCD6IP、CD9、CFL1、CLTC、ENO1、PKM2、MSN、和YWHAG。通过抗体阵列鉴定FGF16、FGFRL1、TNFRSF12A、TNFSF12、CXCL1、CCL18、CXCL12、CCL2、CXCL16、CCL7、CXCL2、CCN4、CXCL9、CCR4、CCR5、ANGPT4、GDF1、GDF11、SFRP4、GDF3、GDF5、GDF8、DKK1、LTA、PDGFA、LTB、MADH4、IFNG...、GPC5、IGF2R、CHRDL1、GRN、VEGFC、IL13、IL15、EML2、IL15RA、IL1RAP、MMP10、IL2、GZMA、IL21R、IL3、IL6、IL6ST、IL8、HGF和THBS。通过LC MS/MS来鉴定剩余的蛋白质。
实施例41：结果：外来体相关蛋白位于磷脂小囊泡中
为了证实CM中外来体的存在，以200,000g将CM超速离心2小时。有CD9(即沉淀物中的一种外来体相关蛋白)的大于200倍富集，其中上清液中没有可检测水平的CD9(图16)。以100,000g超速离心1小时不足以沉降所有的CD9(图16)。将CM过滤流过具有500kDa的MWCO的滤器，接着以200,000g离心滤液或保留物达2小时，从而生成保留物级分中的沉淀物(图16)。此沉淀物中高度富集分别具有19kDa的MW的CD9。然而，此沉淀物没有在缺血/再灌注损伤的小鼠模型中赋予任何心脏保护，并且我们假定这是由于需要剧烈的涡旋振荡和移液以重悬沉淀物。我们观察到仅CD9的级分以100,000g和200,000g 1小时沉降，而大多数以200,000g 2小时沉降。小级分以200,000g 4小时沉降。这些观察共同支持我们的假设，即活性成分是相对较大的复合物，其可以通过超速离心来沉降。
为了确认外来体相关蛋白确实在外来体，即磷脂小囊泡中，通过平衡超速离心在蔗糖密度梯度上分级CM。与脂质小囊泡一样，外来体的密度范围为1.13g ml-1至1.19g ml-1，而且在蔗糖梯度上漂浮。在蔗糖梯度上浮选容易分开外来体与污染性材料，诸如蛋白质聚集体或核小体碎片(Thery等，2002)。然后沿着梯度对来自蔗糖梯度的级分分析CD9、CD81、Tsp1、SOD-1和丙酮酸激酶的存在(图17A)。一项显著的特征在于蛋白质没有沉降至与其分子量相关的预期蛋白质密度。为了测定这些表观密度是否由于蛋白质被包含在脂质小囊泡中，用细胞溶解缓冲液处理CM(图17B)，之后在蔗糖密度梯度上分级。用质膜溶解试剂的这种预处理将表观密度之每种恢复至与其分子量相关的预期蛋白质密度。因此，外来体相关蛋白位于脂质小囊泡中，这与我们的外来体假设一致。
为了确认CM中有脂质小囊泡，测定鞘磷脂和磷脂酰胆碱(即质膜的主要磷脂)、和胆固醇的浓度(图17C)。如预期的，相对于非条件化培养基，每μg蛋白质的这些脂质的相对浓度在CM中较高。此外，以200,000g超速离心CM达2小时显著提高脂质的浓度(图17C)。
实施例42：结果：外来体蛋白质是膜结合的或包囊的
因为外来体相关蛋白包括许多已知的膜蛋白诸如CD9和胞质蛋白诸如SOD1，因此我们测定这些蛋白质是否类似地位于小囊泡的脂膜上和腔。将CM随时间进行有限的胰蛋白酶处理(图18A)。与SOD1具有类似MW的CD9比SOD1相对更易受胰蛋白酶消化。仅在超过50％的CD9被消化后才观察到对SOD1的消化(图18A)。与不生成可检测的中间体的对SOD1的胰蛋白酶消化不一样，对CD9的胰蛋白酶消化生成3种胰蛋白酶肽中间体，这提示CD9具有有不同胰蛋白酶敏感性的域。基于肽中间体的长度和CD9的已知胰蛋白酶位点，将3种易感性胰蛋白酶肽中间体定位至跨膜域或胞质域。这提示已知的细胞CD9的胞质外域类似地暴露于分泌的CD9上，并且因此是胰蛋白酶敏感的，而跨膜域和胞质域不被暴露，并且因此对胰蛋白酶消化是相对有抗性的。这些观察共同提示CD9(即一种已知的膜蛋白)在外来体中也是膜结合的，并且以与质膜中的CD9相同的方向取向，而胞质SOD-1位于腔中，并且仅在通过消化膜蛋白来损害膜的完整性时才能被消化。
实施例43：结果：MSC的分泌物中脂质小囊泡包囊的RNA的存在
先前报告了RNA是由细胞在外来体中分泌的(Smalheiser，2007；Taylor和Gercel-Taylor，2008；Valadi等，2007)。为了测定RNA是否存在于心脏保护分泌物中，通过Trizol对CM提取RNA以产生每mg蛋白质5-6ug RNA。在乙二醛-琼脂糖凝胶(图19A)或尿素-PAGE(图19B)上分离时，RNA含有检测不到水平的18S和28S核糖体RNA，其中大多数RNA小于300nt。为了测定分泌物中RNA的稳定性是否由于其在作为磷脂小囊泡内的包囊，如对蛋白质所观察到的，用RNA酶处理CM，之后提取RNA。RNA收率和大小分布与未处理的CM的相似(图19C)，这提示分泌的RNA受到保护免于RNA酶降解。接着，我们通过用基于SDS的细胞溶解缓冲液、环糊精或磷脂酶A2处理CM来测试RNA被与细胞膜类似的脂膜保护的可能性。用四种试剂之一处理后，将CM暴露于RNA酶，然后提取RNA。用基于SDS的细胞溶解缓冲液的预处理导致RNA的完全损失，而用环糊精或磷脂酶A2进行的处理导致RNA的部分降解和损失。这些观察提示RNA通过富含胆固醇的磷脂膜受到保护免于RNA酶活性，使得容易通过基于SDS的细胞溶解缓冲液、溶解脂质的去污剂诸如TritonX-100、螯合和提取胆固醇的环糊精或磷脂酶D的降解来溶解或损害膜。我们还观察到约70-100nt的RNA比那些具有较小MW的RNA对RNA酶III活性更敏感，这提示较大的RNA是双链的(图19D)。
实施例44：结果：分泌的RNA被隔离在小囊泡中
因为显示了RNA在脂质小囊泡中，所以我们接着使用蔗糖梯度平衡超速离心来测定这些小囊泡的浮力密度。将CM、用溶解缓冲液预处理的CM或一组RNA MW标志物加载至蔗糖密度梯度上，并超速离心，如图4a、b中所描绘的。然后在13份级分中取出梯度，然后对每份级分提取RNA。分泌的RNA在1.074-1.1170g/ml的密度处平衡(图20)。比较而言，RNA MW标志物展现出1.115-1.1170g/ml的浮力密度，而用溶解缓冲液预处理CM之后离心引起分泌的RNA的密度升高至RNA MW标志物的，即1.115-1.145g/ml(图20C)。因此，这些观察与RNA被包囊在脂质小囊泡中一致，并且如此具有比可溶性RNA低得多的表观密度。用溶解缓冲液预处理CM释放RNA，并导致在RNA标志物的密度处沉降的RNA。
实施例45：结果：含有RNA的小囊泡不在含有CD81的外来体中
如上文所显示的，抗CD81抗体免疫共沉淀CD9、CD81和Alix。在本文中，我们测试RNA是否还与CD81免疫沉淀。免疫沉淀后，RNA不存在于沉淀物中，但是保留在上清液中(图21)。因此，分泌的RNA不被隔离在CD81+、CD81+CD9+、或CD81+CD9+Alix+小囊泡中。
实施例46：结果：分泌的RNA含有微小RNA(其包括前miRNA)
已经报告了外来体含有微小RNA(Smalheiser，2007；Taylor和Gercel-Taylor，2008；Valadi等，2007)，并且因为CM中大多数RNA小于300nt，我们通过实施微阵列杂交来对来自MSC及其CM的RNA测试微小RNA(miRNA)的存在。在MSC中检测出149种miRNA，而在CM中检测出63种(图22A，下文表E3)。
  hsa-let-7a   hsa-miR-24-2*   hsa-miR-98   hsa-miR-149*   hsa-miR-214   hsa-miR-484
  hsa-let-7b   hsa-miR-25   hsa-miR-99a   hsa-miR-151-3p   hsa-miR-221   hsa-miR-491-5p
  hsa-let-7c   hsa-miR-26a   hsa-miR-99b   hsa-miR-151-5p   hsa-miR-222   hsa-miR-503
  hsa-let-7d   hsa-miR-26b   hsa-miR-100   hsa-miR-152   hsa-miR-320   hsa-miR-505*
  hsa-let-7e   hsa-miR-27a   hsa-miR-103   hsa-miR-155   hsa-miR-324-5p   hsa-miR-532-5p
  hsa-let-7f   hsa-miR-27b   hsa-miR-106a   hsa-miR-181a   hsa-miR-328   hsa-miR-574-3p
  hsa-let-7g   hsa-miR-27b*   hsa-miR-106b   hsa-miR-181a*   hsa-miR-330-3p   hsa-miR-574-5p
  hsa-let-7i   hsa-miR-28-3p   hsa-miR-107   hsa-miR-181a-2*   hsa-miR-331-3p   hsa-miR-575
  hsa-miR-10a   hsa-miR-28-5p   hsa-miR-125a-3p   hsa-miR-181b   hsa-miR-335   hsa-miR-584
  hsa-miR-15a   hsa-miR-29a   hsa-miR-125a-5p   hsa-miR-181c   hsa-miR-342-3p   hsa-miR-612
  hsa-miR-15b   hsa-miR-29c   hsa-miR-125b   hsa-miR-181d   hsa-miR-345   hsa-miR-625
  hsa-miR-16   hsa-miR-30a   hsa-miR-126   hsa-miR-185   hsa-miR-361-5p   hsa-miR-629
  hsa-miR-17   hsa-miR-30a*   hsa-miR-128   hsa-miR-186   hsa-miR-362-3p   hsa-miR-638
  hsa-miR-18a   hsa-miR-30b   hsa-miR-130a   hsa-miR-187*   hsa-miR-362-5p   hsa-miR-663
  hsa-miR-18b   hsa-miR-30c   hsa-miR-130b   hsa-miR-191   hsa-miR-365   hsa-miR-671-5p
  hsa-miR-19b   hsa-miR-30d   hsa-miR-132   hsa-miR-191*   hsa-miR-374b   hsa-miR-708
  hsa-miR-20a   hsa-miR-30e   hsa-miR-137   hsa-miR-192   hsa-miR-421   hsa-miR-744
  hsa-miR-20b   hsa-miR-30e*   hsa-miR-140-3p   hsa-miR-193a-5p   hsa-miR-423-5p   hsa-miR-766
  hsa-miR-21   hsa-miR-31   hsa-miR-143   hsa-miR-195   hsa-miR-424   hsa-miR-768-3p
  hsa-miR-22   hsa-miR-31*   hsa-miR-145   hsa-miR-197   hsa-miR-424*   hsa-miR-768-5p
  hsa-miR-22*   hsa-miR-34a   hsa-miR-145*   hsa-miR-199a-3p   hsa-miR-425   hsa-miR-769-5p
  hsa-miR-23a   hsa-miR-34a*   hsa-miR-146a   hsa-miR-199a-5p   hsa-miR-425*   hsa-miR-877
  hsa-miR-23a*   hsa-miR-92a   hsa-miR-146b-5p   hsa-miR-199b-5p   hsa-miR-454   hsa-miR-923
  hsa-miR-23b   hsa-miR-92b   hsa-miR-148b   hsa-miR-210   hsa-miR-455-3p   hsa-miR-940
  hsa-miR-24   hsa-miR-93   hsa-miR-149   hsa-miR-212   hsa-miR-483-5p
  hsa-let-7b*   hsa-miR-124   hsa-miR-296-5p   hsa-miR-765   hsa-miR-1228   hsa-miR-1238
  hsa-let-7d*   hsa-miR-150*   hsa-miR-493*   hsa-miR-933   hsa-miR-1234
  hsa-miR-122   hsa-miR-198   hsa-miR-572   hsa-miR-1224-5p   hsa-miR-1237
表E3。MSC和CM中的miRNA列表，如通过微阵列杂交所测定的。
47种miRNA存在于MSC和CM两者中。这些是：hsa-let-7a、hsa-miR-149*、hsa-miR-214、hsa-let-7b、hsa-miR-221、hsa-let-7c、hsa-miR-26a、hsa-miR-151-5p、hsa-miR-222、hsa-let-7d、hsa-miR-100、hsa-miR-320、hsa-let-7e、hsa-miR-103、hsa-let-7f、hsa-miR-181a、hsa-miR-574-3p、hsa-miR-574-5p、hsa-let-7i、hsa-miR-107、hsa-miR-575、hsa-miR-125a-5p、hsa-miR-125b、hsa-miR-361-5p、hsa-miR-638、hsa-miR-663、hsa-miR-191、hsa-miR-671-5p、hsa-miR-132、hsa-miR-191*、hsa-miR-193a-5p、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-31、hsa-miR-143、hsa-miR-22、hsa-miR-145、hsa-miR-23a、hsa-miR-146a、hsa-miR-425*、hsa-miR-92a、hsa-miR-923、hsa-miR-23b、hsa-miR-940、hsa-miR-24、hsa-miR-149和hsa-miR-483-5p。
16种miRNA在CM中是可检出的，但是在MSC中以低于检测水平存在。这些是：hsa-let-7b*、hsa-miR-124、hsa-miR-296-5p、hsa-miR-765、 hsa-miR-1228、hsa-miR-1238、hsa-let-7d*、hsa-miR-150*、hsa-miR-493*、hsa-miR-933、hsa-miR-1234、hsa-miR-122、hsa-miR-198、hsa-miR-572、hsa-miR-1224-5p和hsa-miR-1237。
下列miRNA仅存在于MSC中：hsa-miR-24-2*、hsa-miR-98、hsa-miR-484、hsa-miR-25、hsa-miR-99a、hsa-miR-151-3p、hsa-miR-491-5p、hsa-miR-99b、hsa-miR-503、hsa-miR-26b、hsa-miR-152、hsa-miR-505*、hsa-miR-27a、hsa-miR-155、hsa-miR-324-5p、hsa-miR-532-5p、hsa-miR-27b、hsa-miR-106a、hsa-miR-328、hsa-let-7g、hsa-miR-27b*、hsa-miR-106b、hsa-miR-181a*、hsa-miR-330-3p、hsa-miR-28-3p、hsa-miR-181a-2*、hsa-miR-331-3p、hsa-miR-10a、hsa-miR-28-5p、hsa-miR-125a-3p、hsa-miR-181b、hsa-miR-335、hsa-miR-584、hsa-miR-15a、hsa-miR-29a、hsa-miR-181c、hsa-miR-342-3p、hsa-miR-612、hsa-miR-15b、hsa-miR-29c、hsa-miR-181d、hsa-miR-345、hsa-miR-625、hsa-miR-16、hsa-miR-30a、hsa-miR-126、hsa-miR-185、hsa-miR-629、hsa-miR-17、hsa-miR-30a*、hsa-miR-128、hsa-miR-186、hsa-miR-362-3p、hsa-miR-18a、hsa-miR-30b、hsa-miR-130a、hsa-miR-187*、hsa-miR-362-5p、hsa-miR-18b、hsa-miR-30c、hsa-miR-130b、hsa-miR-365、hsa-miR-19b、hsa-miR-30d、hsa-miR-374b、hsa-miR-708、hsa-miR-20a、hsa-miR-30e、hsa-miR-137、hsa-miR-192、hsa-miR-421、hsa-miR-744、hsa-miR-20b、hsa-miR-30e*、hsa-miR-140-3p、hsa-miR-766、hsa-miR-195、hsa-miR-424、hsa-miR-768-3p、hsa-miR-31*、hsa-miR-197、hsa-miR-424*、hsa-miR-768-5p、hsa-miR-22*、hsa-miR-34a、hsa-miR-145*、hsa-miR-199a-3p、hsa-miR-425、hsa-miR-769-5p、hsa-miR-34a*、hsa-miR-199a-5p、hsa-miR-877、hsa-miR-23a*、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-199b-5p、hsa-miR-454、hsa-miR-92b、hsa-miR-148b、hsa-miR-210、hsa-miR-455-3p、hsa-miR-93、hsa-miR-212。
微阵列分析还指明CM含有显著水平的反指导miRNA(用星号表示)。例如，与MSC中的相比，CM中的let7b与let7b*、let7d与let7d*和miR-191与miR-191*的相对比率极大地降低(图22B)。在细胞中，对茎-环前miRNA的切割生成成熟的指导miRNA和反指导miRNA*。后者通常在细胞中降解。指导miRNA与反指导miRNA的低比率的一种可能的解释是分泌物中的微小RNA是前miRNA，而不是成熟的RNA。与该可能性一致的是我们的观察结果，即70-100nt RNA是双链的(图19D)。为了确认这个发现，使用指导mRNA和前miRNA特异性的引物在用或不用RNA酶III在先处理的情况中实施对逆转录的RNA的实时PCR分析。RNA酶III处理会通过降解前miRNA来确认前miRNA的存在，并致使其通过RT-PCR检测不到。
实施例47：结果：心脏保护性分泌物仅含有在可检测范围1-1000nm中的具有流体动力学半径45-55nm的颗粒
为了确认分泌物含有大复合物，首先通过在HPLC上进行大小排阻来分离CM和NCM(图13)，然后使用准弹性光散射(QELS)检测器对如通过在220nm的吸光度测量的每个洗脱峰检查动态光散射(DLS)。
仅具有11-13分钟的保留时间的一个洗脱峰展现出动态光散射，并且此峰中的颗粒的rh是约45-55nm。具有13-16和17-19分钟的保留时间的其它洗脱峰没有展现出动态光散射。因为DLS的rh检测范围是1至1000nm，而DNAα螺旋的直径是2nm，球状蛋白质是1-10nm，核孔(50nm)，大病毒(100nm)及线粒体是3μM，因此DLS能够检测大多数生物学颗粒。
基于我们的观察结果，即心脏保护与具有大于1000kDa的MW的级分有关，我们假设在12分钟的保留时间的洗脱峰是活性成分。
为了确认这个，将此洗脱峰收获，并在心肌缺血/再灌注损伤的小鼠模型中测试，如上文和(Timmers等，2008)中先前所描述的。
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在此通过提及而将本文件中所提及的每篇申请和专利，和每篇上述申请和专利中(包括在每篇申请和专利的审查过程中)引用或提及的每篇文件(“申请引用的文件”)，和每篇申请和专利中和任何申请引用的文件中引用或提及的任何产品的任何制造商指令或产品目录收入本文。此外，在此通过提及而将本文本中所引用的所有文件、和本文本中所引用的文件中所引用或提及的所有文件、和本文本中所引用或提及的任何产品的任何制造商指令或产品目录收入本文。
本发明的所述方法和系统的各种修饰和变化在不背离本发明的范围和精神的前提下对于本领域技术人员会是显而易见的。虽然本发明已经结合具体的优选实施方案进行了描述，应当理解的是，要求保护的发明不应过度地限于此类具体的实施方案，并且可以在本发明的范围内进行对其的许多修饰和添加。实际上，对于分子生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰意图在权利要求书的范围内。此外，可以在不背离本发明范围的前提下将独立权利要求的特征与后续从属权利要求的特征进行各种组合。

Claims (18)

1.一种颗粒，其由间充质干细胞分泌，并且包含间充质干细胞的至少一项生物学特性，诸如间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)的生物学活性，例如心脏保护。
2.依照权利要求1的颗粒，其能够降低梗死大小，例如如心肌缺血和再灌注损伤的小鼠或猪模型中所测定的，或者其能够降低氧化应激，例如如过氧化氢(H2O2)诱导的细胞死亡的体外测定法中所测定的。
3.依照权利要求1或2的颗粒，其中所述颗粒包含小囊泡诸如外来体，例如包含间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)中至少70％的蛋白质，诸如选自表D1或E2中所显示的列表，或者是表D2中所显示的基因的基因产物或者包含如表E3中所显示的一种或多种miRNA。
4.依照权利要求1、2或3的颗粒，其中所述颗粒包含：(a)分子量大于100kDa的复合物，例如包含小于100kDa的蛋白质；(b)分子量大于300kDa的复合物，例如包含小于300kDa的蛋白质；或(c)分子量大于1000kDa的复合物。
5.依照任一项前述权利要求的颗粒，其中所述颗粒具有2nm和200nm之间的大小，诸如50nm和150nm之间的大小或50nm和100nm之间的大小，例如如通过针对0.2μM滤器过滤和针对具有分子量截留10kDa的膜浓缩所测定的或者如通过电子显微术所测定的，或者100nm以下的流体动力学半径，诸如约30nm和约70nm之间，约40nm和约60nm之间，诸如约45nm和约55nm之间，诸如约50nm，例如如通过激光衍射或动态光散射所测定的。
6.依照任一项前述权利要求的颗粒，其中所述颗粒包含选自下组的脂质：磷脂、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱、鞘磷脂、神经酰胺、糖脂、脑苷脂、类固醇、胆固醇，例如其中胆固醇-磷脂比率大于0.3-0.4(mol/mol)。
7.依照任一项前述权利要求的颗粒，其中所述颗粒包含脂筏，或者其中所述颗粒在非离子型去污剂，优选Triton-X100中是不可溶的，或者其中所述颗粒是这样的，即在用非离子型去污剂处理所述颗粒时，具有权利要求4中所规定的分子量的蛋白质基本上保留在具有那些权利要求中所规定的分子量的复合物中，或者其中所述颗粒对环糊精，优选20mM环糊精敏感，使得例如用环糊精处理引起权利要求4中所规定的复合物基本上溶解。
8.依照任一项前述权利要求的颗粒，其中所述颗粒包含核糖核酸(RNA)，优选地，其中所述颗粒具有1.9的吸光度比率(260∶280nm)，或者其中所述颗粒包含选自下组的表面抗原：CD9、CD109和thy-1。
9.一种生成依照任一项前述权利要求的颗粒的方法，该方法包括自间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)分离所述颗粒，所述方法任选包括基于分子量、大小、形状、组成或生物学活性将所述颗粒与其它成分分开，诸如例如其中所述重量选自权利要求4中所列重量或者其中所述大小选自权利要求5中所列大小或者其中所述组成选自权利要求6中所列组成或者其中所述生物学活性选自权利要求1或2之任一项中所列生物学活性。
10.一种生成依照权利要求1至8中任一项的颗粒的方法，该方法包括：
(a)获得间充质干细胞条件化培养基(MSC-CM)；
(b)浓缩所述间充质干细胞条件化培养基，例如通过在大于1000kDa膜上超滤；
(c)将浓缩的间充质干细胞条件化培养基进行大小排阻层析，诸如使用TSK保护柱SWXL，6x40mm或TSK凝胶G4000SWXL，7.8x300mm柱；并
(d)选择UV吸收级分，例如在220nm处，其展现出动态光散射，诸如通过准弹性光散射(QELS)所检测的；
其中步骤(d)例如包括收集以11-13分钟，诸如12分钟的保留时间洗脱的级分。
11.一种药物组合物，其包含与药学可接受赋形剂、稀释剂或载体一起的依照任一项前述权利要求的颗粒。
12.依照权利要求1至10中任一项的颗粒或依照权利要求11的药物组合物，其用于治疗疾病的方法。
13.依照权利要求1至10中任一项的颗粒在制备用于治疗疾病的药物组合物中或者在治疗个体的疾病的方法中的用途。
14.依照权利要求12的颗粒或依照权利要求13的用途，其中所述疾病选自下组：心力衰竭、骨髓疾病、皮肤病、烧伤和变性性疾病诸如糖尿病、阿耳茨海默氏病、帕金森氏病、癌症、心肌梗死、皮肤伤口、皮肤病学病症、皮肤病学损伤、皮炎、银屑病、湿疣、疣、血管瘤、瘢痕疙瘩、皮肤癌、特应性皮炎、贝切特病、慢性肉芽肿性疾病、皮肤T细胞淋巴瘤、溃疡、以诱导炎症的初始损伤和导致慢性组织重塑的免疫失调为特征的病理学状况包括纤维化和功能丧失、肾缺血性损伤、囊性纤维化病、鼻窦炎和鼻炎或整形外科疾病。
15.依照权利要求1至10中任一项的颗粒在个体中帮助伤口愈合、瘢痕减少、骨形成、骨移植物或骨髓移植中，或者在下列各项中的用途：(i)在选自下列任一项或多项的途径的调节中：由ρGTP酶进行的细胞骨架调节、细胞周期、整联蛋白信号传导途径、由趋化因子和细胞因子信号传导途径介导的炎症、FGF信号传导途径、EGF受体信号传导途径、血管发生、血纤维蛋白溶酶原激活级联、凝血、糖酵解、泛素蛋白酶体途径、从头嘌呤生物合成、TCA循环、苯丙氨酸生物合成、血红素生物合成；(ii)在包括下列任一项或多项的过程的调节中：细胞结构和运动性、细胞结构、细胞通信、细胞运动性、细胞粘着、胞吞、有丝分裂、胞吐、胞质分裂、细胞周期、免疫和防御、细胞因子/趋化因子介导的免疫、巨噬细胞介导的免疫、粒细胞介导的免疫、配体介导的信号传导、细胞因子和趋化因子介导的信号传导途径、信号转导、细胞外基质蛋白介导的信号传导、生长因子稳态、受体蛋白质酪氨酸激酶信号传导途径、细胞粘着介导的信号传导、细胞表面受体介导的信号转导、JAK-STAT级联、抗氧化和自由基去除、稳态、应激响应、血液凝固、发育过程、中胚层发育、骨骼发育、血管发生、肌肉发育、肌肉收缩、蛋白质代谢和修饰、蛋白酶解、蛋白质折叠、蛋白质复合物装配、氨基酸活化、细胞内蛋白质运输、其它蛋白质靶向和定位、氨基酸代谢、蛋白质生物合成、蛋白质二硫化物异构酶反应、碳水化合物代谢、糖酵解、戊糖磷酸支路、其它多糖代谢、嘌呤代谢、磷酸盐代谢的调节、维生素代谢、氨基酸生物合成、前mRNA加工、翻译调节、mRNA剪接；或(iii)在包括下列任一项或多项的功能的供应中：信号传导分子、趋化因子、生长因子、细胞因子、白介素、其它细胞因子、细胞外基质、细胞外基质结构蛋白、其它细胞外基质、细胞外基质糖蛋白、蛋白酶、金属蛋白酶、其它蛋白酶、蛋白酶抑制剂、金属蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶抑制剂、氧化还原酶、脱氢酶、过氧化物酶、蛋白伴侣、陪伴蛋白、Hsp 70家族蛋白伴侣、其它蛋白伴侣、合成酶、合酶和合成酶、选择的钙结合蛋白、氨酰基-tRNA合成酶、裂合酶、异构酶、其它异构酶、ATP合酶、水合酶、转氨酶、其它裂合酶、其它酶调节物、选择的调节分子、肌动蛋白结合细胞骨架蛋白、细胞骨架蛋白、非运动性肌动蛋白结合蛋白、肌动蛋白和肌动蛋白相关蛋白、膜联蛋白、微管蛋白、细胞粘着分子、肌动蛋白结合动力蛋白、中间丝、核糖核蛋白、核糖体蛋白质、翻译因子、其它RNA结合蛋白、组蛋白、钙调蛋白相关蛋白、小囊泡外壳蛋白。
16.一种用于投递依照权利要求1至10中任一项的颗粒的投递系统，其包含与可操作用于将所述颗粒投递至目标的分配器一起的颗粒源。
17.依照权利要求16的投递系统在将颗粒投递至目标的方法中的用途。
18.一种颗粒、制备颗粒的方法或用途，其基本上如本文中参照附图图1至图23所描述的和如附图图1至23中所显示的。
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