CN107189985B - miRNA分子及其抑制剂在调控骨间充质干细胞成脂分化中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种miRNA分子及其抑制剂在调控骨间充质干细胞成脂分化中的应用，所述miRNA为miR‑3963，其序列为5’‑UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU‑3’，所述调控为促进或抑制。本发明利用miR‑3963或其抑制剂对小鼠骨实质来源MSC成脂分化能力的调控作用，过表达miR‑3963后，MSC成脂分化能力显著升高；敲减miR‑3963后，MSC成脂分化能力显著下降，由此提出了调控间充质干细胞成脂分化的新型小分子化合物，可应用于调节脂肪合成、控制间充质干细胞成脂分化。

Description

miRNA分子及其抑制剂在调控骨间充质干细胞成脂分化中的 应用

技术领域

本发明属于间充质干细胞培养技术领域，具体涉及一种miRNA分子及其抑制剂在调控骨间充质干细胞成脂分化中的应用。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)是一类具有多向分化潜能的成体干细胞，广泛存在于动物组织和器官，例如骨髓、脂肪组织、心脏、肺脏及新生儿组织包括胎盘、羊膜和脐带，在适宜条件下能够分化为成骨细胞、脂肪细胞、心肌细胞等多种类型细胞。MSC还可以通过分泌细胞外基质和可溶性因子，如细胞因子、趋化因子、生长因子等多种代谢产物，间接调控肿瘤发生与发展。

微小RNA(microRNA，miRNA)是生物体内一类具有调控基因表达作用的非编码小RNA分子，其发夹状前体经Dicer酶切成为21-24nt的成熟的miRNA，通过与靶基因mRNA碱基互补配对的方式，下调基因表达或促进下游mRNA降解。在生物体发育、细胞程序性凋亡坏死、细胞增殖、免疫和神经系统模式形成等生命过程中，miRNA的表达与调控发挥着至关重要的作用，其表达异常可以导致多种疾病发生。因此，深入研究miRNA的功能将有助于我们理解生物发育与疾病的作用机制。同理，也有大量的miRNA参与MSC的增殖、分化、迁移以及免疫调控等生物学功能。

发明内容

本发明人通过研究，发现miR-3963对小鼠骨实质来源MSC成脂分化能力的具有调控作用。

本发明目的之一在于提供miRNA和/或其抑制剂在调控骨间充质干细胞成脂分化中的应用，所述miRNA为miR-3963，其序列为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3’，所述调控为促进或抑制。

上述应用中，所述miRNA抑制剂为单链RNA分子，其序列为5’-GUGUGCAGAAGUGGGAUACA-3’。

上述应用中，所述骨间充质干细胞为小鼠骨实质来源间充质干细胞。

本发明同时也提供了一种促进小鼠骨间充质干细胞成脂分化的方法，包括以下步骤：

分离提取获得小鼠骨片，消化后进行原代培养、传代培养，获得小鼠骨实质间充质干细胞；

将miR-3963导入传代培养后的小鼠骨实质间充质干细胞，然后培养。

上述方法中，所述消化的方法为：将骨片用浓度为0.1％的II型胶原酶，在37℃下，消化30-50min。

上述方法中，所述原代培养的方法为：在温度为37℃、CO₂浓度为5％、湿度为饱和湿度的条件下，采用含10％FBS的α-MEM完全培养基，培养72h后全量换液；培养过程中每2-3d更换一次新的含10％FBS的α-MEM完全培养基。

上述方法中，所述传代培养的方法为：待爬出的细胞在培养瓶底部融合成单层，达80％-90％融合度时，加入胰酶消化，离心，收集的细胞重新接种于含10％FBS的α-MEM完全培养基，传代比例为1:2-1:3；所述胰酶的浓度为0.25％；所述离心的转速为1000rpm，时间为10min。

上述方法中，所述α-MEM完全培养基中青霉素、链霉素的量分别为100U/ml。

上述方法中，将miR-3963导入传代培养后的小鼠骨实质间充质干细胞的方法为：用脂质体包裹miR-3963mimic，接种于第三代指数期的小鼠骨实质间充质干细胞，当细胞融合40-60％时进行转染；所述miR-3963mimic为双链RNA分子，其中有义链为5’-UGAGAACUGAAUUCCAUAGGCU-3’。

上述方法中，所述转染方法为：转染体系为150μl，控制脂质体中miRNA终浓度为50nM，转染培养基为含10％FBS的α-MEM培养基，不含抗生素。

上述方法中，所述脂质体为jetPRIME，其包裹miR-3963mimic的方法为：将miR-3963mimic用DEPC水稀释，得到终浓度为20μM的miR-3963mimic水溶液；将水溶液按体积比1:20-60稀释于无血清培养基中，得到A液；将Jet Prime按体积比1:10-20稀释于无血清培养基中，得到B液；混合A、B液，得到脂质体/miRNA复合物。

上述方法中，所述的小鼠为1周龄的C57BL/6小鼠。本发明的有益效果为：

1、本发明利用miR-3963或其抑制剂对小鼠骨实质来源MSC成脂分化能力的调控作用，过表达miR-3963后，MSC成脂分化能力显著升高；敲减miR-3963后，MSC成脂分化能力显著下降，由此提出了调控间充质干细胞成脂分化的新型小分子化合物，可应用于调节脂肪合成、控制间充质干细胞成脂分化。

2、本发明的提供的促进小鼠骨间充质干细胞成脂分化的方法，利用脂质体承载小分子化合物miR-3963mimic转染小鼠骨实质来源的间充质干细胞，方法操作简便，可以控制miR-3963稳定表达；优选培养基和转染体系，可快速、方便、高效地进行转染，转染效率较高，但是对细胞损伤尽可能减小。转染培养14天后，MSC成脂分化能力显著升高。

附图说明

图1为小鼠骨实质间充质干细胞的形态结构与细胞表面标记物表型；其中，A为纯化培养第三代(P3)的小鼠骨实质间充质干细胞；B为A图放大效果；C为P3代的MSC流式标记结果。

图2为miR-3963类似物或抑制剂对小鼠骨实质间充质干细胞的转染效率以及转染后3963的表达改变情况；A-D为转染后的荧光照片，A为转染miR-3963mimic NC，B为转染miR-3963mimic，C为转染miR-3963inhibitor NC，D为转染miR-3963inhibitor。

图3为miR-3963类似物或抑制剂对小鼠骨实质间充质干细胞成脂肪细胞分化的调控作用；A-F为油红染色结果，A为自分化组，B为诱导组，C为转染miR-3963mimic NC，D为转染miR-3963mimic，E为转染miR-3963inhibitor NC，F为转染miR-3963inhibitor(10X)，G为mRNA水平上C/EBPα和PPARγ表达变化，H为蛋白水平上PPARγ的表达变化。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围不限于此。以下实施例中所用到的实验方法如无特殊说明均为常规的方法；所用到的原料为：胎牛血清(FBS)为Hyclone公司产品；流式细胞术相关抗鼠单克隆抗体：CD29-PE、Sca-1-FITC、CD105-PE、CD31-PE、CD34-FITC、MHCII-PE、CD45-FITC、Isotype Rat-IgG2a-FITC、IsotypeRat-IgG2a-PE，均为eBioscience公司产品；PBS(8.0gNaCl、2.9g Na2HPO4·12H2O、0.2gKCl、0.24g KH2PO4溶于1000mL去离子水中，调整pH值至7.4，非特殊指出，本文中所用PBS皆为此配方)；II型胶原酶、胰蛋白酶、地塞米松、胰岛素、油红O染料、IBMX均为Sigma公司产品；MiReasy试剂盒购自美国Qiagen Sciences公司，RT-PCR试剂盒为Takara公司产品；miR-3963类似物或抑制物及其阴性对照、引物购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司，其具体序列如表1所示。

实施例1小鼠骨实质来源间充质干细胞的分离提取与鉴定。

骨片贴壁法培养小鼠骨片来源的MSC。取一周龄C57BL/6小鼠，断颈处死，放入75％乙醇中浸泡5min，将消毒后的小鼠放入超净工作台。无菌平皿中解剖开皮毛层，充分暴露大腿，眼科镊取胫骨、股骨放入青瓶，剪碎。用眼科镊将其置于0.1％的II型胶原酶中消化45min，消化后，取出骨片，置于25cm2培养瓶中培养，采用含10％FBS的α-MEM完全培养基(青霉素、链霉素各10万U)，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下培养72h，全量换液，之后每隔2-3天更换一次培养液，待爬出的细胞达80％-90％融合度时，加入0.25％的胰蛋白酶进行消化传代。细胞传至第三代对数生长期时备用。

检测细胞表面抗原表达，所用抗体为抗CD29-PE、Sca-1-FITC、CD105-PE、CD31-PE、CD34-FITC、MHCII-PE、CD45-FITC、isotype Rat-IgG2a-FITC、isotype Rat-IgG2a-PE，用流式细胞仪进行检测。结果如图1所示，其中，A为纯化培养第三代(P3)的小鼠骨实质间充质干细胞，梭形突起变长，排列有明显方向性，呈旋涡状生长；B为A图放大效果；C为P3代的MSC流式标记结果：高表达间质细胞表面标志CD29和CD105，高表达干性标志物Sca-1，不表达内皮标志物CD31、不表达造血细胞表面标志CD34、CD45和主要组织相容性复合体MHCII，具备符合MSC的形态和表型特征。

实施例2miRNA及其抑制剂的制备与转染

1、miRNA及其抑制剂的制备

1.00OD260的miR-3963mimic(miR-3963类似物)和miR-3963mimic negativecontrol用125μl DEPC水稀释，1.00OD260的miR-3963inhibitor和miR-3963negativecontrol用250μl DEPC水稀释，使其终浓度为20μmol/L。将3μl RNA稀释于150μl无血清的α-MEM培养基得到A液。将9μl Jet Prime稀释于150μl无血清α-MEM培养基中得到B液。轻轻混合A、B液，室温下静置20min，形成A/B复合物，即脂质体复合物。其中miR-3963mimic、miR-3963mimic阴性对照、miR-3963inhibitor、miR-3963inhibitor阴性对照的序列如表1所示，上述序列购自上海生工生物工程(上海)股份有限公司。

表1 RNA序列

2、转染

转染前1d将P3代MSCs分别以1×10⁵/孔、2×10⁴/孔种于6孔板和24孔板中，分别加入2ml、500μl10％FBS的α-MEM培养基/孔，细胞融合50％左右进行转染。将脂质体复合物加入六孔板中，miRNA终浓度为50nmol/L。6h后，弃上清，加入2ml 10％FBS的α-MEM培养基/孔。

3、miR-3963化学合成模拟物或抑制剂对小鼠骨实质间充质干细胞进行转染效率检测。

RNA带有CY3荧光标记，可于荧光显微镜下进行观察。为进一步检测转染microRNA后，细胞内mRNA水平是否产生变化，进行q-PCR检测。使用MiReasy试剂盒提取microRNA，利用总RNA1ug、RNA free water、RT特异性引物R、5×RTase M-MLV Buffer 4ul、DTT 1ul、dNTP 1ul、RTase M-MLV 2ul、RNase inhibitor 1ul制备逆转录混合反应液20ul，在PCR扩增仪上进行逆转录反应(70℃，10min；42℃，1h；70℃，10min)，反应结束后，逆转录产物cDNA置于冰上或储存于-20℃保存。配制实时定量PCR反应体系：2×Ultra Master Mix 10ul、10umol/L的PCR特异引物F 0.5ul、10umol/L的PCR特异引物R 0.5ul、cDNA1ul、RNase FreeWater 8ul，置于MicroTM Optical 8-Tube Strip、盖上MicroTM Optical 8-Cap Strip，短暂离心混合，置于冰上或者4℃冰箱中。设置PCR程序后，将其放入Real-Time PCR仪，进行PCR反应，反应条件为：95℃，10min；40个PCR循环收集荧光(95℃，15s；60℃，1min)；95℃，15s；60℃，1min；95℃，15s。Sno作为内参，数据采用2-△△CT法进行分析。

结果如图2所示，图2-A-D为转染后的荧光照片，A为转染miR-3963mimic NC，B为转染miR-3963mimic，C为转染miR-3963inhibitor NC，D为转染miR-3963inhibitor。脂质体介导带有CY3荧光标记的miR-3963mimic和miR-3963inhibitor及对照组RNA转染于P3代的MSC，并于转染6h后在荧光显微镜下检测其转染效率，各组均可见红色荧光标记的MSC，证实外源RNA进入MSC内；E为转染后miR-3963的表达变化，转染miR-3963mimic后，MSC内的miR-3963的表达水平显著上调(p<0.0001)，并显著高于对照组。同时，转染miR-3963inhibitor的MSC内miR-3963的表达水平亦显著下调(p<0.0001)。上述结果提示设计的miR-3963mimic与miR-3963inhibitor对MSC转染有效，且能够有效改变内源miR-3963的表达水平。

实施例3诱导成脂分化效果

miR-3963类似物促进小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂肪分化，同时，miR-3963抑制剂可有效抑制小鼠骨实质来源间充质干细胞成脂肪分化。

转染后将细胞用脂肪诱导分化培养液(内含10％FBS、100U/ml青霉素、100U/ml链霉素、1umol/L地塞米松、10ug/ml胰岛素、0.5mmol/L IBMX的α-MEM)，2-3d后全量换液。培养至14d后，去除培养液，并加入PBS清洗2次，每孔加入2ml 4％中性甲醛溶液固定30min，用PBS清洗2次，24孔板中每孔加入500ul油红O染料工作液，用PBS清洗2次。在倒置显微镜下观察，并同时拍照。

Q-PCR检测成脂分化因子C/EBPα和PPARγ的相对表达量，逆转录时需将RT特异性引物R更换为Oligo dT和Random。其中Q-PCR引物序列如表2所示。

Western blot检测PPARγ在蛋白水平的变化。收集各组成脂诱导分化细胞，PBS洗2遍，细胞裂解液4℃裂解细胞30min，12000rpm4℃离心10min，BCA蛋白浓度测定试剂检测蛋白含量。取20ug蛋白样品加上样缓冲液煮沸变性后，经10％SDS-PAGE分离后，转移到PVDF膜上，含5％脱脂奶粉室温封闭1h。4℃过夜孵育一抗，用TBST洗膜3次，加入二抗室温孵育1h，再用TBST洗膜3次，ECL化学发光显影。

结果如图3所示，A-F为油红染色结果，A为自分化组，B为诱导组，C为转染miR-3963mimic NC，D为转染miR-3963mimic，E为转染miR-3963inhibitor NC，F为转染miR-3963inhibitor(10X)。转染有miR-3963mimic的MSC经成脂诱导即可大量分化为脂肪细胞(图3D)，与其他相比，过表达miR-3963mimic可显著提高MSC自分化所形成的脂滴数目和脂肪细胞比例，提示miR-3963可促进MSC向脂肪细胞分化；

G为mRNA水平上C/EBPα和PPARγ表达变化。q-PCR检测结果表明，与其他组相比转染miR-3963mimic的MSC内高表达成脂分化因子C/EBPα和PPARγ(p<0.05)。

H为蛋白水平上PPARγ的表达变化。Western blot检测发现与自分化组、诱导组相比，过表达miR-3963mimic后，分化的MSC内PPARγ蛋白水平显著高与其他组，证实miR-3963对MSC向脂肪细胞分化具有促进作用，其缺失将直接导致MSC向脂肪细胞分化受阻。

表2 RT-PCR引物序列

显然，上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例，而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所

<120> miRNA分子及其抑制剂在调控骨间充质干细胞成脂分化中的应用

<130> seqlist

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 22

<212> RNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

ugagaacuga auuccauagg cu 22

<210> 2

<211> 20

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> mir-3963抑制剂

<400> 2

gugugcagaa gugggauaca 20

Claims (5)

1.一种促进小鼠骨间充质干细胞成脂分化的方法，其特征在于，包括以下步骤：

分离提取获得小鼠骨片，消化后进行原代培养、传代培养，获得小鼠骨实质间充质干细胞；

将miR-3963导入传代培养后的小鼠骨实质间充质干细胞，然后培养。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述消化的方法为：将骨片用浓度为0.1％的II型胶原酶，在37℃下，消化30-50min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述原代培养的方法为：在温度为37℃、CO₂浓度为5％、湿度为饱和湿度的条件下，采用含10％FBS的α-MEM完全培养基，培养72h后全量换液；培养过程中每2-3d更换一次新的含10％FBS的α-MEM完全培养基。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述传代培养的方法为：待爬出的细胞在培养瓶底部融合成单层，达80％-90％融合度时，加入胰酶消化，离心，收集的细胞重新接种于含10％FBS的α-MEM完全培养基，传代比例为1:2-1:3；所述胰酶的浓度为0.25％；所述离心的转速为1000rpm，时间为10min。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述α-MEM完全培养基中青霉素、链霉素的量分别为100U/ml。

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