JP6563145B2 - 不死化汗腺筋上皮細胞 - Google Patents
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Description
(1)不死化遺伝子が導入された不死化汗腺筋上皮細胞であって、α−平滑筋アクチンおよびパンサイトケラチンを発現し、7回以上の継代後にスフィア形成能を有し、不死化遺伝子がhTERT遺伝子、SV40T(ラージT)抗原遺伝子およびSV40t(スモールt)抗原遺伝子であることを特徴とする不死化汗腺筋上皮細胞、
(2)ATP1a1をさらに発現している前記(1)に記載の不死化汗腺筋上皮細胞、
(3)不死化汗腺筋上皮細胞を製造する方法であって、
(I)汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、ウイルスベクターを用いる方法またはトランスフェクション法によって不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入して遺伝子導入体を得る工程、および
(II)前記工程(I)で得られた遺伝子導入体を培地中に浮遊させた状態で培養して不死化汗腺筋上皮細胞を得る工程
を含み、前記工程(I)において、前記細胞構造体として汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織または汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを用い、前記不死化遺伝子としてhTERT遺伝子、SV40T(ラージT)抗原遺伝子およびSV40t(スモールt)抗原遺伝子を用いる不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法、
(4)前記工程(I)を行なう前に、採取された皮膚組織から少なくとも膠原繊維の全部または一部を除去して汗腺含有組織を得る工程をさらに含み、前記工程(I)において、前記細胞構造体として前記汗腺含有組織を用いる前記(3)に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法、ならびに
(5)前記工程(I)を行なう前に、汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる工程をさらに含み、前記工程(I)において、前記細胞構造体として前記スフィアを用いる前記(3)に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法
に関する。
(A)本発明の不死化汗腺筋上皮細胞を被験物質の非存在下で培地中に浮遊させた状態で培養して細胞培養物を得るステップ、
(B)本発明の不死化汗腺筋上皮細胞を被験物質の存在下で培地中に浮遊させた状態で培養して細胞培養物を得るステップ、および
(C)前記ステップ(A)で得られた細胞培養物(A)における分化マーカーの発現プロファイルと前記ステップ(B)で得られた細胞培養物(B)における分化マーカーの発現プロファイルとを調べ、前記細胞培養物(A)における分化マーカーの発現プロファイルと前記細胞培養物(B)における分化マーカーの発現プロファイルとの違いに基づき、前記被験物質が有する汗腺筋上皮細胞の分化調節作用を評価するステップ
を含む。本評価方法により、被験物質が汗腺筋上皮細胞の分化を促進する作用を有することが確認された場合、当該被験物質は、例えば、汗腺筋上皮細胞の機能の異常亢進に起因する状態の改善に用いられることが期待される。また、本評価方法により、被験物質が汗腺筋上皮細胞の分化を抑制する作用を有することが確認された場合、当該被験物質は、例えば、汗腺筋上皮細胞の機能不全に起因する状態の改善に用いられることが期待される。
(I)汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入して遺伝子導入体を得る工程、および
(II)前記工程(I)で得られた遺伝子導入体を培地中に浮遊させた状態で培養して不死化汗腺筋上皮細胞を得る工程
を含むことを特徴とする(以下、「本発明の方法」ともいう)。
(a1)採取された皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離する工程、および
(a2)工程(a1)で得られた組織片から膠原繊維などを除去して汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を得る工程
を含む方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
(b1)採取された皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離する工程、
(b2)工程(b1)で得られた組織片から解離状態の汗腺細胞を得る工程、および
(b3)工程(b2)で得られた汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる工程
を含む方法などが挙げられるが、本発明は、かかる例示のみに限定されるものではない。
(ii)パンサイトケラチン発現陽性およびATP1a1発現陽性を示すこと、および
(iii)5回以上の継代後にスフィア形成能を有すること
を調べることによって同定することができる。α−平滑筋アクチン、パンサイトケラチンおよびATP1a1それぞれの発現の有無は、例えば、蛍光免疫細胞染色法、リアルタイムRT−PCR法などによって確認することができる。スフィア形成能は、前述のスフィアの製造方法と同様の方法によって確認することができる。
<略語および用語の説明>
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
FBS:ウシ胎児血清
GAPDH:グリセルアルデヒド3リン酸脱水素酵素
GFP:緑色蛍光タンパク質
GFP組換ウイルス:GFP遺伝子を保持する組換レンチウイルス
hTERT組換ウイルス:hTERT遺伝子を保持する組換レンチウイルス
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
SV40Tt組換ウイルス:SV40t抗原遺伝子およびSV40T抗原遺伝子を保持する組換レンチウイルス
α−SMA: α−平滑筋アクチン
基礎培地〔ステム・セル・テクノロジーズ社製、商品名:Complete MammoCult HumanMedium〕に、ヒドロコルチゾン−21−ヘミスクシナート、組換ヒト上皮増殖因子、組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヘパリンおよびペニシリン/ストレプトマイシン混合液〔ペニシリン濃度10000ユニット/mL、ストレプトマイシン濃度10000μg/mL〕をそれぞれの濃度が10.5μg/mL(ヒドロコルチゾン−21−ヘミスクシナート)、10ng/mL(組換ヒト上皮増殖因子)、10ng/mL(組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子)、4μg/mL(ヘパリン)および100μg/mL(ペニシリン/ストレプトマイシン混合液)となるように添加して培地(I)を得た。
基礎培地〔ステム・セル・テクノロジーズ社製、商品名:Complete MammoCult HumanMedium〕に、ヒドロコルチゾン−21−ヘミスクシナート、組換ヒト上皮増殖因子、組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子、ヘパリンおよびペニシリン/ストレプトマイシン混合液および細胞培養用人工基底膜マトリックス〔コーニング・インコーポレーティッド(Corning Inc.)製、商品名:Growth Factor Reduced Matrigel Matrix〕をそれぞれの濃度が10.5μg/mL(ヒドロコルチゾン−21−ヘミスクシナート)、10ng/mL(組換ヒト上皮増殖因子)、10ng/mL(組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子)、4μg/mL(ヘパリン)、100μg/mL(ペニシリン/ストレプトマイシン混合液)および2体積%(細胞培養用人工基底膜マトリックス)となるように添加して培地(II)を得た。
基礎培地〔ステム・セル・テクノロジーズ社製、商品名:Complete MammoCult HumanMedium〕に、ヒドロコルチゾン−21−ヘミスクシナート、組換ヒト上皮増殖因子および組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子をそれぞれの濃度が10.5μg/mL(ヒドロコルチゾン−21−ヘミスクシナート)、10ng/mL(組換ヒト上皮増殖因子)および10ng/mL(組換ヒト塩基性線維芽細胞増殖因子)となるように添加して培地(III)を得た。ポリブレンをその濃度が10μg/mLとなるように培地(III)に添加してウイルス感染用培地を得た。
トリプシン溶液〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名:2.5% Trypsin (10×)、no Phenol Red〕、ダルベッコPBS〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名:DPBS、no calcium、no magnesium〕、およびEDTA溶液〔ニッポンジーン社製、商品名:0.5M EDTA〕を混合することで、0.5質量%トリプシン−EDTA溶液を得た。
粉末状のディスパーゼ〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名:Dispase II,powder〕をダルベッコPBS〔サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社製、商品名:DPBS,no calcium,no magnesium〕に溶解させることで、5U/mLディスパーゼ液を得た。
(1)解離状態の汗腺細胞の製造
皮膚組織として、生体(68歳のヒト)から切除後すぐに4℃で冷蔵保存され、切除後48時間以内の眼瞼の皮膚組織を用いた。皮膚組織を10μMニュートラルレッド(Neutral Red)含有PBSに浸すことにより、前記皮膚組織中の汗腺にニュートラルレッドを取り込ませた。つぎに、光学顕微鏡下でピンセットとハサミとを用い、前記皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離した。分離された組織片を15mL容量チューブ中の無菌PBS内に集めた。前記組織片を含有するPBSを軽く振とうさせた後、当該PBSを350×gおよび4℃で5分間の遠心分離に供して上清を除去することにより、前記組織片を洗浄した。
前記(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞と2質量%FBS/PBS溶液9mLとを混合した。得られた混合液を350×gおよび4℃で5分間の遠心分離に供して当該混合液から上清を除去した。前記チューブ中の解離汗腺細胞に製造例5で得られた5U/mLディスパーゼ液1mLを添加した後、ピペットを用い、前記チューブ中の解離汗腺細胞を撹拌した。つぎに、前記チューブ中の解離汗腺細胞を含有する混合液をセルストレーナー〔メッシュサイズ:40μm、コーニング社製、商品名:Falcon(登録商標)40μmセルストレーナー、ブルー、滅菌、個別包装〕に通して凝集した細胞を除去することにより、解離汗腺細胞の浮遊液を得た。
GFP組換ウイルス粒子溶液〔アプライド・バイオロジカル・マテリアルズ(Applied Biological Materials)社製、商品名:GFP Control Lentivirus、GFP組換ウイルス粒子濃度:1×106U/mL〕をポリエチレングリコール沈殿法にしたがって濃縮した。得られた濃縮物を前記ウイルス感染用培地でGFP組換ウイルス粒子濃度が1×108U/mLになるように希釈することにより、GFP組換ウイルス希釈液を得た。
参考例1の(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞とPBS9mLとを混合した。つぎに、得られた混合液を350×gおよび4℃で5分間の遠心分離に供して上清を除去した。遠心分離後の解離汗腺細胞5×102〜1×105個と製造例3で得られたウイルス感染用培地90μLとを混合した。得られた混合液に、前記GFP組換ウイルス希釈液10μLを添加し、スフィア−ウイルス混合液を得た。前記スフィア−ウイルス混合液を37℃の5体積%二酸化炭素雰囲気中でインキュベートして解離汗腺細胞に組換ウイルスを感染させることにより、解離汗腺細胞にGFP遺伝子を導入した。ウイルス感染開始時から24時間経過後、ウイルス感染汗腺細胞を回収した。
参考例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアおよび参考例2で得られたウイルス感染汗腺細胞におけるGFPに基づく蛍光を蛍光顕微鏡下に観察した。また、参考例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアおよび参考例2で得られたウイルス感染汗腺細胞を共焦点顕微鏡下に観察した。
参考例1の(2)「スフィア培養」で得られたスフィア含有液とPBS9mLとを混合した。つぎに、得られた混合液を350×gおよび4℃で5分間の遠心分離に供して上清を除去した。遠心分離後のスフィア4〜10個と製造例3で得られたウイルス感染用培地100μLとを混合した。得られた混合液に、hTERT組換ウイルス粒子溶液〔アプライドバイオロジカルマテリアルズ社製の商品名:High Titer Lentivirus containing hTERT、hTERT組換ウイルス粒子濃度:1×109U/mL〕0.5μLとSV40Tt組換ウイルス粒子溶液〔アプライドバイオロジカルマテリアルズ社製の商品名:High Titer Lentivirus expressing SV40 large and small T antigens、SV40Tt組換ウイルス粒子濃度:1×109U/mL〕0.5μLとを添加し、スフィア−ウイルス混合液を得た。前記スフィア−ウイルス混合液を37℃の5体積%二酸化炭素雰囲気中でインキュベートしてスフィアを構成する汗腺細胞に組換レンチウイルスを感染させることにより、スフィアを構成する細胞に不死化遺伝子を導入した。ウイルス感染開始時から24時間経過後、ウイルス感染汗腺スフィアを回収した。
参考例1の(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」および(2)の「スフィア培養」と同様の操作を行なうことにより、スフィアを得た。
(1)スフィア継代培養
以下の(1−1)および(1−2)を行なうことを「1回の継代培養」と定義した。
実施例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアと、製造例4で得られた0.5質量%トリプシン−EDTA溶液1mLとを15mL容量チューブ中で混合した。ピペットを用い、前記チューブ中の汗腺を3分間撹拌することにより、汗腺を構成する汗腺細胞を互いに解離させ、解離汗腺細胞を得た。
前記(1−1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞と、2質量%FBS/PBS溶液9mLとを混合した。得られた混合液を350×gおよび4℃で5分間の遠心分離に供して上清を除去した。前記チューブ中の解離汗腺細胞に製造例5で得られた5U/mLディスパーゼ液1mLを添加した後、ピペットを用い、前記チューブ中の解離汗腺細胞を撹拌した。つぎに、前記チューブ中の解離汗腺細胞を含有する混合液をセルストレーナー〔メッシュサイズ:40μm、コーニング製、商品名:Falcon(登録商標)40μmセルストレーナー、ブルー、滅菌、個別包装〕に通して凝集した細胞を除去することにより、解離汗腺細胞の浮遊液を得た。
前記(1−1)「解離汗腺細胞の製造」および(1−2)「スフィア培養」からなる一連の操作を繰り返し、前記(1−2)「スフィア培養」におけるスフィアの形成の有無に基づき、スフィア形成能を調べた。
抗パンサイトケラチン抗体、抗パンサイトケラチン抗体に対する蛍光標識二次抗体、抗α−SMA抗体および当該抗α−SMA抗体に対する蛍光標識二次抗体を用いて前記(1−1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞および比較例1で得られた解離汗腺細胞の蛍光免疫染色を行なった。つぎに、免疫染色後の解離汗腺細胞におけるパンサイトケラチンに基づく蛍光の強度〔以下、「蛍光強度A」という〕およびα−SMAに基づく蛍光の強度〔以下、「蛍光強度B」という〕を測定した。
前記(1−1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞から全RNAを抽出した。得られた全RNAをその濃度が1μg/μLとなるようにDNアーゼ/RNアーゼフリーの精製水〔invitrogen社製、商品名:UltraPure DNase/RNase−Free Distilled Water〕を添加した。逆転写キット〔QIAGEN社製、商品名:Quatitect Reverse Transcription Kit〕を用い、前記全RNAからcDNAを合成し測定試料を得た。
<評価基準>
「不死化汗腺筋上皮細胞がATP1a1遺伝子を発現している」
・・・補正発現値が「正の値」である。
「不死化汗腺筋上皮細胞がATP1a1遺伝子を発現していない」
・・・補正発現値が「0」または「負の値」である。
(1)汗腺含有組織の製造
皮膚組織として、生体(41歳のヒト)から切除後すぐに4℃で冷蔵保存され、切除後48時間以内の眼瞼の皮膚組織を用いた。皮膚組織を10μMニュートラルレッド含有PBSに浸すことにより、前記皮膚組織中の汗腺にニュートラルレッドを取り込ませた。つぎに、光学顕微鏡下でピンセットとハサミとを用い、前記皮膚組織から汗腺を含む組織片を分離した。分離された組織片を15mL容量チューブ中の無菌PBS内に集めた。前記組織片を含有するPBSを軽く振とうさせた後、当該PBSを350×gおよび4℃で5分間の遠心分離に供して上清を除去することにより、前記組織片を洗浄した。
hTERT組換ウイルス粒子溶液とSV40Tt組換ウイルス粒子溶液とを前記ウイルス感染用培地でhTERT組換ウイルス粒子濃度が1×108U/mLおよびSV40Tt組換ウイルス粒子濃度が1×108U/mLとなるように希釈して不死化遺伝子含有組換ウイルス希釈液を得た。
試験例2の(1)「スフィア継代培養」において、実施例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例2で得られたウイルス感染組織を用いたことを除き、試験例2の(1)「スフィア継代培養」と同様の操作を行ない、スフィア継代培養を行なった。
(1)解離汗腺細胞の製造
参考例1の(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」において、68歳のヒトの眼瞼の皮膚組織を用いる代わりに20歳のヒトの眼瞼の皮膚組織(参考例3)、71歳のヒトの眼瞼の皮膚組織(参考例4)、74歳のヒトの眼瞼の皮膚組織(参考例5)、51歳のヒトの腹部の皮膚組織(参考例6)または55歳のヒトの腹部の皮膚組織(参考例7)を用いたことを除き、参考例1の(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。
参考例1の(2)「スフィア培養」において、参考例1の(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに参考例3〜7の(1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた各解離汗腺細胞を用いたことを除き、参考例1の(2)「スフィア培養」と同様の操作を行ない、スフィア含有液を得た。
実施例1において、参考例1の(2)「スフィア培養」で得られたスフィア含有液を用いる代わりに参考例3で得られたスフィア含有液(実施例3)、参考例4で得られたスフィア含有液(実施例4)、参考例5で得られたスフィア含有液(実施例5)、参考例6で得られたスフィア含有液(実施例6)または参考例7で得られたスフィア含有液(実施例7)を用いたことを除き、実施例1と同様の操作を行ない、ウイルス感染汗腺スフィアを得た。
参考例1の(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」において、68歳のヒトの眼瞼の皮膚組織を用いる代わりに20歳のヒトの眼瞼の皮膚組織(比較例3)、71歳のヒトの眼瞼の皮膚組織(比較例4)、74歳のヒトの眼瞼の皮膚組織(比較例5)、51歳のヒトの腹部の皮膚組織(比較例6)または55歳のヒトの腹部の皮膚組織(比較例7)を用いたことを除き、比較例1の(1)「解離状態の汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。
試験例2の(1)「スフィア継代培養」において、実施例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例3〜7で得られたウイルス感染組織を用いたことを除き、試験例2の(1)「スフィア継代培養」と同様の操作を行ない、スフィア継代培養を行なった。
(1)スフィア継代培養
以下の(1−1)および(1−2)を行なうことを「1回の継代培養」と定義した。
試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」において、実施例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例3〜7で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いたことを除き、試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。
前記(1−1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞の一部(細胞数Aの解離汗腺細胞)と、2質量%FBS/PBS溶液9mLとを混合した。得られた混合液を350×gおよび4℃で5分間の遠心分離に供して上清を除去した。前記チューブ中の解離汗腺細胞に製造例5で得られた5U/mLディスパーゼ液1mLを添加した後、ピペットを用い、前記チューブ中の解離汗腺細胞を撹拌した。つぎに、前記チューブ中の解離汗腺細胞を含有する混合液をセルストレーナー〔メッシュサイズ:40μm、コーニング製、商品名:Falcon(登録商標)40μmセルストレーナー、ブルー、滅菌、個別包装〕に通して凝集した細胞を除去することにより、解離汗腺細胞の浮遊液を得た。
前記(1−1)「解離汗腺細胞の製造」および(1−2)「スフィア培養」からなる一連の操作をスフィア形成が停止するまで繰り返した。
[各継代間での細胞増殖倍率(KX)]=[細胞数B]/[細胞数A]
(II)
にしたがい、各継代間での細胞増殖倍率(KX)を求めた。各継代間での細胞増殖倍率(KX)を用い、式(III)にしたがい、
[総細胞増殖倍率]=K1×K2・・・×KX (III)
(式中、Xは正の整数を示す)
にしたがい、実施例3〜7で得られたスフィアに含まれる汗腺細胞の総細胞増殖倍率を求めた。その結果を表2に示す。
(1)解離汗腺細胞の製造
試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」において、実施例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに実施例3で得られたスフィア(実験番号1)、実施例4で得られたスフィア(実験番号2)または実施例5で得られたスフィア(実験番号3)を用いたことを除き、試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、解離汗腺細胞を得た。なお、前記において、実施例3で得られたスフィアとして継代数5回のスフィア、実施例4で得られたスフィアとして継代数8回のスフィア、実施例5で得られたスフィアとして継代数14回のスフィアを用いた。
試験例6の(1)「解離完成細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を表3に示される濃度となるように凍結保存液〔タカラバイオ(株)製、商品名CELLBANKER(登録商標) 1plus〕1mLに懸濁した。得られた懸濁液を−80℃に保たれたフリーザで凍結させ、凍結細胞を得た。得られた凍結細胞を−80℃に保たれたフリーザまたは液体窒素中で表3に示される期間保存した。その後、凍結物を解凍して実験番号1〜3の解凍細胞を得た。得られた解凍細胞の数を測定した。以下において、解凍細胞の数を細胞数Cとして用いた。
試験例2の(1−2)「スフィア培養」において、試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに試験例6の(2)「解離汗腺細胞の凍結保存」で得られた解凍細胞を用いたことを除き、試験例2の(1−2)「スフィア培養」と同様の操作を行ない、実験番号1〜3のスフィア含有液Aを得た。
以下の(3−1)および(3−2)を行なうことを「1回の継代培養」と定義した。
試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」において、実施例1で得られたウイルス感染汗腺スフィアを用いる代わりに試験例6の(2)「スフィア形成」で得られたスフィア含有液Aのうち、実験番号3のスフィア含有液Aを用いたことを除き、試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」と同様の操作を行ない、実験番号3の解離汗腺細胞を得た。
試験例2の(1−2)「スフィア培養」において、試験例2の(1−1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞を用いる代わりに試験例6の(3−1)「解離汗腺細胞の製造」で得られた解離汗腺細胞(実験番号3)を用いたことを除き、試験例2の(1−2)「スフィア培養」と同様の操作を行ない、実験番号3のスフィア含有液Bを得た。
[細胞増殖倍率]=[細胞数D]/[細胞数C] (IV)
にしたがい、実験番号1〜3のスフィアに含まれる不死化汗腺細胞を凍結保存したときの細胞増殖倍率を求めた。細胞増殖能の評価結果を表4に示す。表中、細胞増殖能およびスフィア形成能の評価基準は、以下のとおりである。
<細胞増殖能の評価基準>
+:式(IV)にしたがって算出された細胞増殖率が1より大きい。
−:式(IV)にしたがって算出された細胞増殖率が1以下である。
<スフィア形成能の評価基準>
+:光学顕微鏡下でスフィアの形成が確認される。
−:光学顕微鏡下でスフィアの形成が確認されない。
Claims (5)
- 不死化遺伝子が導入された不死化汗腺筋上皮細胞であって、α−平滑筋アクチンおよびパンサイトケラチンを発現し、7回以上の継代後にスフィア形成能を有し、不死化遺伝子がhTERT遺伝子、SV40T(ラージT)抗原遺伝子およびSV40t(スモールt)抗原遺伝子であることを特徴とする不死化汗腺筋上皮細胞。
- ATP1a1をさらに発現している請求項1に記載の不死化汗腺筋上皮細胞。
- 不死化汗腺筋上皮細胞を製造する方法であって、
(I)汗腺筋上皮細胞が表面に露出している細胞構造体を培地中に浮遊させた状態で培養しながら、ウイルスベクターを用いる方法またはトランスフェクション法によって不死化遺伝子を当該汗腺筋上皮細胞に導入して遺伝子導入体を得る工程、および
(II)前記工程(I)で得られた遺伝子導入体を培地中に浮遊させた状態で培養して不死化汗腺筋上皮細胞を得る工程
を含み、前記工程(I)において、前記細胞構造体として汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織または汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを用い、前記不死化遺伝子としてhTERT遺伝子、SV40T(ラージT)抗原遺伝子およびSV40t(スモールt)抗原遺伝子を用いる不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法。 - 前記工程(I)を行なう前に、採取された皮膚組織から少なくとも膠原繊維の全部または一部を除去して汗腺筋上皮細胞が表面に露出している汗腺含有組織を得る工程をさらに含み、前記工程(I)において、前記細胞構造体として前記汗腺含有組織を用いる請求項3に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法。
- 前記工程(I)を行なう前に、汗腺細胞を培地中に浮遊させた状態で培養し、汗腺筋上皮細胞が表面に露出しているスフィアを形成させる工程をさらに含み、前記工程(I)において、前記細胞構造体として前記スフィアを用いる請求項3に記載の不死化汗腺筋上皮細胞の製造方法。
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