KR20200010439A - 불사화(不死化) 땀샘 근상피 세포 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 α-SMA 및 판사이토케라틴을 발현하고, 적어도 5회의 계대 후에 스피어 형성능을 갖는 불사화(不死化) 땀샘 근상피 세포, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 세포에 도입하고, 얻어진 유전자 도입체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여 불사화 땀샘 근상피 세포를 얻는 불사화 땀샘 근상피 세포의 제법이다.

Description

불사화(不死化) 땀샘 근상피 세포
본 발명은, 불사화 땀샘 근상피 세포에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은, 제한제(制汗劑), 데오도런트제 등의 외용제, 땀샘 기능의 개선제 등의 개발 등에 유용한 불사화 땀샘 근상피 세포 및 그 제조 방법에 관한 것이다.
땀샘의 기능 부전 및 기능의 이상 항진은, 열중증(熱中症) 등의 질환, 피부의 끈적임, 불쾌감 등을 일으키는 일이 있다. 땀샘 근상피 세포는, 땀샘을 구성하는 세포의 하나이다. 땀샘 근상피 세포는, 땀의 분비 시의 땀샘의 운동에 관여하고 있다. 또, 땀샘 근상피 세포는, 땀샘의 줄기세포인 것이 본 발명자들에 의해 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 1 참조). 그래서, 땀샘의 기능 부전 및 기능의 이상 항진을 개선하는 수단을 개발하기 위해, 땀샘 근상피 세포를 땀샘의 기능 평가 등에 이용하는 것을 생각할 수 있다.
그러나, 땀샘으로부터 단리(單離)된 땀샘 근상피 세포는, 땀샘에 존재하는 양이 적고, 게다가 계대 배양이 가능한 횟수가 적은 점에서, 입수성 및 취급성이 뒤떨어진다는 결점을 갖는다. 그래서, 땀샘 근상피 세포를 불사화시켜, 장기간에 걸치는 세포 증식능을 땀샘 근상피 세포에 부여하는 것이 요망된다.
땀샘 세포를 불사화시키는 방법으로서, 배양 용기에 접착한 상태에서 배양된 땀샘 세포에 시미안 바이러스 40(이하, 「SV40」이라고 한다)을 감염시키는 방법이 보고되어 있다(예를 들면, 비특허문헌 2 참조). 그러나, 상기 방법은, 땀샘 세포를 생체 환경과 다른 환경하에서 배양하기 때문에, 생체내에 있어서의 땀샘 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 갖는 불사화 땀샘 세포를 얻기 어렵다는 결점을 갖는다. 한편, 땀샘 세포를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하는 것을 생각할 수 있다. 그러나, 본 발명자들은, 현시점에서는, 부유 상태의 땀샘 세포에 외래 유전자를 도입할 수 있는 기술을 구체적으로 기재한 문헌을 발견하고 있지 않다.
구라타 류이치로 등, 「사람 피부로부터의 땀샘 근상피 세포의 단리 및 캐릭터리제이션(Isolation And Characterization Of Sweat Gland Myoepithelial Cells From Human Skin)」, 셀 스트럭처 앤드 펑션(Cell Structure and Function), 제39권, 2014년 발행, pp.101-112 캐서린 엠 리(CATHERINE M. LEE) 등, 「NCL-SG3: 경상피 이온 수송능을 갖는 사람 에크린 땀샘 세포주(NCL-SG3: a human eccrine sweat gland cell line that retains the capacity for transepithelial ion transport)」, 저널 오브 셀 사이언스(Journal of Cell Science), 제92권, 1989년 발행, pp.241-249
본 발명은, 상기 종래 기술을 감안하여 이루어진 것이고, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 가지며, 당해 기능 및 성질을 갖는 세포를 장기간에 걸쳐 증식시킬 수 있는 불사화 땀샘 근상피 세포, 그리고 당해 불사화 땀샘 근상피 세포를 높은 제조 효율로 제조할 수 있는 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은,
(1) α-평활근 액틴 및 판사이토케라틴을 발현하고, 적어도 5회의 계대 후에 스피어 형성능을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 불사화(不死化) 땀샘 근상피 세포,
(2) ATP1a1을 추가로 발현하고 있는 상기 (1)에 기재한 불사화 땀샘 근상피 세포,
(3) 불사화 땀샘 근상피 세포를 제조하는 방법으로서,
(Ⅰ) 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 땀샘 근상피 세포에 도입하여 유전자 도입체를 얻는 공정, 및
(Ⅱ) 상기 공정 (Ⅰ)에서 얻어진 유전자 도입체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여 불사화 땀샘 근상피 세포를 얻는 공정을 포함하는 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법,
(4) 상기 공정 (Ⅰ)에 있어서, 바이러스 벡터를 개재하여 불사화 유전자를 상기 땀샘 근상피 세포에 도입하는 (3)에 기재한 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법,
(5) 상기 공정 (Ⅰ)을 행하기 전에, 채취된 피부 조직으로부터 적어도 교원 섬유의 전부 또는 일부를 제거하여 땀샘 함유 조직을 얻는 공정을 추가로 포함하고, 상기 공정 (Ⅰ)에 있어서, 상기 세포 구조체로서 상기 땀샘 함유 조직을 이용하는 상기 (3) 또는 (4)에 기재한 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법, 그리고
(6) 상기 공정 (Ⅰ)을 행하기 전에, 땀샘 세포를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 스피어를 형성시키는 공정을 추가로 포함하고, 상기 공정 (Ⅰ)에 있어서, 상기 세포 구조체로서 상기 스피어를 이용하는 상기 (3) 또는 (4)에 기재한 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포에 의하면, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 가지며, 당해 기능 및 성질을 갖는 세포를 장기간에 걸쳐 증식시킬 수 있다는 뛰어난 효과가 이루어진다. 또, 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법에 의하면, 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포를 높은 제조 효율로 제조할 수 있다는 뛰어난 효과가 이루어진다.
도 1의 (A)는 참고예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어의 형광 현미경 관찰의 결과를 나타내는 도면 대용 사진이고, (B)는 참고예 2에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 세포의 형광 현미경 관찰의 결과를 나타내는 도면 대용 사진이며, (C)는 참고예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어의 위상차 현미경 관찰의 결과를 나타내는 도면 대용 사진이고, (D)는 참고예 2에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 세포의 공(共)초점 현미경 관찰의 결과를 나타내는 도면 대용 사진이다.
도 2의 (A)는 시험예 2 (1)에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 나타내는 도면 대용 사진이고, (B)는 시험예 2 (1)에 있어서, 비교예 1에서 얻어진 해리(解離) 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 나타내는 도면 대용 사진이다.
도 3의 (A)는 세포의 종류와 판사이토케라틴 발현량과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프, (B)는 세포의 종류와 α-SMA 발현량과의 관계를 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4의 (A)는 시험예 3에 있어서, 실시예 2에서 얻어진 바이러스 감염 조직에 포함되는 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 나타내는 도면 대용 사진, (B)는 시험예 3에 있어서, 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 나타내는 도면 대용 사진이다.
본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, 상기한 바와 같이, α-평활근 액틴 및 판사이토케라틴을 발현하고, 적어도 5회의 계대 후에 스피어 형성능을 갖고 있는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에 있어서, 「불사화」란, 적어도 5회의 계대 후에 세포가 스피어 형성능을 갖고 있는 것을 말한다. 또, 「땀샘으로부터 단리된 땀샘 근상피 세포」란, 땀샘으로부터 분리되어, 초대 배양이 행해진 땀샘 근상피 세포(이하, 「초대 땀샘 근상피 세포」라고도 한다)를 말한다.
α-평활근 액틴 및 판사이토케라틴은, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 마커이다. α-평활근 액틴은, 땀샘 수축을 일으킨다는 땀샘 근상피 세포의 기능의 발현에 관여한다. 또 판사이토케라틴은, 땀샘 근상피 세포의 세포 골격을 형성하고 있다. 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, α-평활근 액틴 및 판사이토케라틴을 발현하고 있기 때문에, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 갖는다. 또한, 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, 적어도 5회의 계대 후에 스피어 형성능을 갖고 있으므로, 초대 땀샘 근상피 세포와 비교하여, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 갖는 세포를 장기간에 걸쳐 증식시킬 수 있다.
초대 땀샘 근상피 세포는, 4회째의 계대보다 먼저 스피어 형성능을 잃는다. 이에 반해, 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, 적어도 5회, 바람직하게는 7회 이상, 보다 바람직하게는 9회 이상, 더욱 바람직하게는 18회 이상, 더욱더 바람직하게는 100회 이상의 계대 후여도, 스피어 형성능을 갖고 있다. 따라서, 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, 초대 땀샘 근상피 세포와 비교하여, 보다 장기간에 걸쳐 세포 증식능을 유지한다.
「생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능과 마찬가지의 기능」으로는, 예를 들면, 땀의 분비 시의 땀샘의 수축 운동 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 「생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 성질과 마찬가지의 성질」로는, 예를 들면, 땀샘 관강세포 등으로의 분화능, 자기 복제능, α-평활근 액틴 발현 양성, 판사이토케라틴 발현 양성, 나트륨/칼륨 ATP아제의 α 서브유닛(ATP1a1) 발현 양성 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, ATP1a1을 추가로 발현하고 있는 것이 바람직하다. ATP1a1은, 땀샘 이외의 기관 유래의 근상피 세포(예를 들면, 젖샘의 근상피 세포 등)에서는 발현하고 있지 않은 점에서, 땀샘 세포의 마커이다. 따라서, ATP1a1을 발현하는 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, 땀샘 이외의 기관 유래의 근상피 세포와 구별화할 수 있다.
본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 갖는 점에서, 예를 들면, 피험 물질이 갖는 땀샘 근상피 세포의 분화 조절 작용의 평가 방법에 이용되는 것이 기대된다. 이러한 평가 방법은, 예를 들면,
(A) 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포를 피험 물질의 비존재하에서 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여 세포 배양물을 얻는 스텝,
(B) 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포를 피험 물질의 존재하에서 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여 세포 배양물을 얻는 스텝, 및
(C) 상기 스텝 (A)에서 얻어진 세포 배양물 (A)에 있어서의 분화 마커의 발현 프로파일과 상기 스텝 (B)에서 얻어진 세포 배양물 (B)에 있어서의 분화 마커의 발현 프로파일을 조사하고, 상기 세포 배양물 (A)에 있어서의 분화 마커의 발현 프로파일과 상기 세포 배양물 (B)에 있어서의 분화 마커의 발현 프로파일과의 차이에 의거하여, 상기 피험 물질이 갖는 땀샘 근상피 세포의 분화 조절 작용을 평가하는 스텝을 포함한다. 본 평가 방법에 의해, 피험 물질이 땀샘 근상피 세포의 분화를 촉진하는 작용을 갖는 것이 확인된 경우, 당해 피험 물질은, 예를 들면, 땀샘 근상피 세포의 기능의 이상 항진에 기인하는 상태의 개선에 이용되는 것이 기대된다. 또, 본 평가 방법에 의해, 피험 물질이 땀샘 근상피 세포의 분화를 억제하는 작용을 갖는 것이 확인된 경우, 당해 피험 물질은, 예를 들면, 땀샘 근상피 세포의 기능 부전에 기인하는 상태의 개선에 이용되는 것이 기대된다.
본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포는, 예를 들면, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 땀샘 근상피 세포에 도입하는 것 등에 의해 제조할 수 있다.
본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법은,
(Ⅰ) 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 땀샘 근상피 세포에 도입하여 유전자 도입체를 얻는 공정, 및
(Ⅱ) 상기 공정 (Ⅰ)에서 얻어진 유전자 도입체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여 불사화 땀샘 근상피 세포를 얻는 공정을 포함하는 것을 특징으로 한다(이하, 「본 발명의 방법」이라고도 한다).
본 발명의 방법에 의하면, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 땀샘 근상피 세포에 도입한다는 조작이 채택되고 있으므로, 불사화 유전자를 높은 도입 효율로 땀샘 근상피 세포에 도입할 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 의하면, 높은 제조 효율로 불사화 땀샘 근상피 세포를 제조할 수 있다.
공정 (Ⅰ)에서는, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 땀샘 근상피 세포에 도입하여 유전자 도입체를 얻는다.
세포 구조체는, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 것이면, 다른 땀샘 세포 등을 함유하고 있어도 된다. 다른 땀샘 세포로는, 예를 들면, 땀샘 관강세포, 땀샘 분비 세포 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 세포 구조체로는, 예를 들면, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 땀샘 함유 조직, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 스피어 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
땀샘 함유 조직은, 피부 조직 중 땀샘을 함유하는 부분의 조직이다. 땀샘 함유 조직에 포함되는 땀샘의 표층은, 땀샘 근상피 세포에 의해 덮여 있다. 또, 땀샘에 있어서는, 표층으로부터 내부를 향해, 보다 분화가 진행된 땀샘 세포가 존재하고 있다. 땀샘 함유 조직은, 예를 들면, 채취된 피부 조직으로부터 적어도 교원 섬유의 전부 또는 일부를 제거하는 것 등에 의해 분리할 수 있다. 세포 구조체로서 땀샘 함유 조직을 이용하는 경우, 본 발명의 방법은, 공정 (Ⅰ)을 행하기 전에, 채취된 피부 조직으로부터 적어도 교원 섬유의 전부 또는 일부를 제거하여 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 땀샘 함유 조직을 얻는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
땀샘 함유 조직의 제조 방법으로는, 예를 들면,
(a1) 채취된 피부 조직으로부터 땀샘을 포함하는 조직편을 분리하는 공정, 및
(a2) 공정 (a1)에서 얻어진 조직편으로부터 교원 섬유 등을 제거하여 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 땀샘 함유 조직을 얻는 공정을 포함하는 방법 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
채취된 피부 조직으로는, 예를 들면, 외과 수술 시에 발생한 잉여 피부 등으로부터 취득되어, 살아 있는 상태의 피부 조직 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 채취된 피부 조직은, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 신선한 조직인 것이 바람직하다. 채취된 피부 조직이 냉장 보존된 조직인 경우, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 절제 후 48시간 이내의 조직인 것이 바람직하다. 또한, 본 명세서에 있어서, 「살아 있는 상태의 피부 조직」이란, 생체내에 있어서의 본래의 생물학적 활성 및 본래의 움직임과 마찬가지의 생물학적 활성 및 움직임을 나타내는 상태의 피부 조직을 말한다. 피부 조직의 공급원으로는, 예를 들면, 사람 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
공정 (a1)에서는, 채취된 피부 조직으로부터 땀샘을 포함하는 조직편을 분리한다. 공정 (a1)에서는, 땀샘을 시인(視認)하면서 용이하게 땀샘을 포함하는 조직편을 분리할 수 있는 점에서, 피부 조직을 뉴트럴 레드 등의 염색 시약으로 염색하여 땀샘을 가시화하는 것이 바람직하다. 피부 조직을 염색한 경우, 염색 시약에 의한 땀샘에의 영향을 저감시키는 관점 및 미생물 등의 컨테미네이션을 저감시키는 관점에서, 피부 조직으로부터 분리된 조직편을 세정하는 것이 바람직하다.
다음으로, 공정 (a2)에서는, 공정 (a1)에서 얻어진 조직편으로부터 교원 섬유 등을 제거하여 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 땀샘 함유 조직을 얻는다. 공정 (a2)에서는, 예를 들면, 디스파제, 콜라게나제 등의 효소, 물리적인 절제 수단 등을 이용하여 조직편으로부터 교원 섬유를 제거할 수 있다. 공정 (a2)에서는, 다른 표피 부속 기관의 혼입을 막는 관점에서, 모낭, 피지샘 등을 조직편으로부터 추가로 제거하는 것이 바람직하다.
스피어는, 땀샘 세포의 응집 덩어리이다. 스피어는, 땀샘 근상피 세포로 이루어지는 표면층을 갖는다. 스피어에 있어서는, 표면층으로부터 내부를 향해, 보다 분화가 진행된 땀샘 세포가 존재하고 있다. 스피어는, 예를 들면, 땀샘 세포를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하는 것 등에 의해 제조할 수 있다. 세포 구조체로서 스피어를 이용하는 경우, 본 발명의 방법은, 공정 (Ⅰ)을 행하기 전에, 땀샘 세포를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 스피어를 형성시키는 공정을 추가로 포함시킬 수 있다.
스피어의 제조 방법으로는, 예를 들면,
(b1) 채취된 피부 조직으로부터 땀샘을 포함하는 조직편을 분리하는 공정,
(b2) 공정 (b1)에서 얻어진 조직편으로부터 해리 상태의 땀샘 세포를 얻는 공정, 및
(b3) 공정 (b2)에서 얻어진 땀샘 세포를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 스피어를 형성시키는 공정을 포함하는 방법 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
공정 (b1)에서는, 채취된 피부 조직으로부터 땀샘을 포함하는 조직편을 분리한다. 공정 (b1)에 있어서의 조직편의 채취는, 땀샘 함유 조직의 제조 방법의 공정 (a1)에 있어서의 조직편의 채취와 마찬가지의 방법에 의해 행할 수 있다.
다음으로, 공정 (b2)에서는, 공정 (b1)에서 얻어진 조직편으로부터 해리 상태의 땀샘 세포를 얻는다. 공정 (b2)에서는, 세포 해리용 시약을 조직편에 작용시키는 것 등에 의해 조직편으로부터 땀샘 세포를 해리시킴으로써, 해리 상태의 땀샘 세포를 얻을 수 있다. 세포 해리용 시약으로는, 예를 들면, 서몰리신, 디스파제, 콜라게나제, 트립신 등의 효소 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
다음으로, 공정 (b3)에서는, 공정 (b2)에서 얻어진 해리 상태의 땀샘 세포를 스피어 형성용 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 스피어를 형성시킨다. 스피어 형성용 배지로는, 예를 들면, 상피 증식 인자와 염기성 선유아세포(線維芽細胞) 증식 인자와 세포 배양용 인공기저막 매트릭스와 무혈청 배지를 함유하는 배지 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 스피어 형성용 배지가 상피 증식 인자를 함유하는 배지인 경우, 스피어 형성용 배지에 있어서의 상피 증식 인자의 함유율은, 피부 조직의 공급원의 종류 등에 따라 다르므로 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 피부 조직의 공급원의 종류 등에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 피부 조직의 공급원이 사람인 경우, 스피어 형성용 배지에 있어서의 상피 증식 인자의 함유율은, 통상, 세포를 적당히 증식시키는 동시에 적당히 분화시키는 관점에서, 바람직하게는 0.01ng/mL 이상, 보다 바람직하게는 1ng/mL 이상이고, 세포의 과도한 증식 및 분화를 억제하는 관점에서, 바람직하게는 1㎍/mL 이하, 보다 바람직하게는 100ng/mL 이하이다. 스피어 형성용 배지가 염기성 선유아세포 증식 인자를 함유하는 배지인 경우, 스피어 형성용 배지에 있어서의 염기성 선유아세포 증식 인자의 함유율은, 피부 조직의 공급원의 종류 등에 따라 다르므로 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 피부 조직의 공급원의 종류 등에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 피부 조직의 공급원이 사람인 경우, 스피어 형성용 배지에 있어서의 염기성 선유아세포 증식 인자의 함유율은, 통상, 세포를 적당히 증식시키는 동시에 세포의 과도한 분화를 억제하는 관점에서, 바람직하게는 0.01ng/mL 이상, 보다 바람직하게는 1ng/mL 이상이고, 세포의 과도한 증식을 억제하는 동시에 세포를 적당히 분화시키는 관점에서, 바람직하게는 1㎍/mL 이하, 보다 바람직하게는 100ng/mL 이하이다. 무혈청 배지로는, 예를 들면, 스템 셀 테크놀로지스(Stem Cell Technologies)사 제조의 상품명: Complete MammoCult Human Medium, 써모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤 제조의 상품명: Gibco(등록상표) Keratinocyte-SFM 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
땀샘 세포의 배양 조건은, 피부 조직의 공급원의 종류 등에 따라 다르므로 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 피부 조직의 공급원의 종류 등에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 땀샘 세포의 배양 조건은, 예를 들면, 배양 온도, 배양 시간, 배지의 pH, 배양 분위기에 있어서의 이산화탄소 농도 등을 포함한다. 피부 조직의 공급원이 사람인 경우, 배양 온도는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 35℃ 이상, 보다 바람직하게는 36.5℃ 이상이고, 상기와 마찬가지로 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 38℃ 이하, 보다 바람직하게는 37.5℃ 이하이다. 구체적으로는, 상기 배양 온도는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 통상, 바람직하게는 35∼38℃, 보다 바람직하게는 36.5∼37.5℃이다. 또, 피부 조직의 공급원이 사람인 경우, 배양 시간은, 배양 온도 등에 따라 다르므로 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 배양 온도 등에 따라 적절히 결정하는 것이 바람직하다. 배양 시간은, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 60시간 이상, 보다 바람직하게는 144시간 이상이고, 상기와 마찬가지로 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 672시간 이하, 보다 바람직하게는 168시간 이하이다. 구체적으로는, 상기 배양 시간은, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 통상, 바람직하게는 60∼672시간, 보다 바람직하게는 144∼168시간이다. 또한, 피부 조직의 공급원이 사람인 경우, 배지의 pH는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 6.8 이상, 보다 바람직하게는 7.0 이상이고, 상기와 마찬가지로 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 7.6 이하, 보다 바람직하게는 7.4 이하이다. 구체적으로는, 상기 pH는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 통상, 바람직하게는 6.8∼7.6, 보다 바람직하게는 7.0∼7.4이다. 배양 분위기에 있어서의 이산화탄소 농도는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 4 체적％ 이상, 보다 바람직하게는 5 체적％ 이상이고, 상기와 마찬가지로 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 10 체적％ 이하, 보다 바람직하게는 7 체적％ 이하이다. 구체적으로는, 상기 이산화탄소 농도는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 통상, 바람직하게는 4∼10 체적％, 보다 바람직하게는 5∼7 체적％이다. 「땀샘 세포를 배지 중에 부유시킨 상태」는, 땀샘 세포의 배양에 이용되는 배양 용기의 벽면에 당해 땀샘 세포가 접촉하고 있지 않은 상태이면 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 배양 용기는, 땀샘 세포가 접착하는 것을 억제하는 물질을 내면에 갖는 용기여도 된다.
공정 (Ⅰ)에 있어서, 땀샘 근상피 세포에의 불사화 유전자의 도입은, 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태로 배양하면서 행해진다. 「세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태」는, 세포 구조체의 배양에 이용되는 용기의 내면에 당해 세포 구조체가 접촉하고 있지 않은 상태이면 되며, 특별히 한정되는 것은 아니다. 세포 구조체의 배양에 이용되는 용기는, 세포 구조체가 접착하는 것을 억제하는 물질을 내면에 갖는 용기여도 된다. 세포 구조체를 부유시킨 상태에서 배양하기 위한 배지(이하, 「부유 배양용 배지」라고도 한다)는, 땀샘 근상피 세포를 생존시키는 영양 성분을 함유하는 배지이면, 혈청 등의 유전자 도입을 저해하는 성분의 함유량이 적은 배지여도 되고, 당해 성분을 포함하고 있지 않은 배지여도 된다. 부유 배양용 배지는, 저혈청 배지 또는 무혈청 배지에 영양 성분을 보충한 배지여도 되고, 상업적으로 용이하게 입수 가능한 배지여도 된다. 영양 성분으로는, 예를 들면, 아미노산, 비타민, 무기염, 당류, 세포 증식 촉진 인자(예를 들면, 상피 증식 인자, 염기성 선유아세포 증식 인자, 히드로코르티손-21-헤미숙시네이트 등) 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 부유 배양용 배지에 있어서의 영양 성분의 함유율은, 저혈청 배지 또는 무혈청 배지의 종류, 영양 성분의 종류 등에 따라 다르므로 일률적으로는 결정할 수 없는 점에서, 저혈청 배지 또는 무혈청 배지의 종류, 영양 성분의 종류 등에 따라 적절히 설정하는 것이 바람직하다. 이들의 영양 성분은, 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다. 무혈청 배지로는, 예를 들면, 스템 셀 테크놀로지스사 제조의 상품명: Complete MammoCult Human Medium, 써모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤 제조의 상품명: Gibco(등록상표) Keratinocyte-SFM, 써모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤 제조의 상품명: Opti-MEM(등록상표) I Reduced Serum Medium 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 저혈청 배지는, 상기 무혈청 배지에 혈청이 첨가된 배지를 이용할 수 있다. 저혈청 배지의 혈청 농도는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 0.01 체적％ 이상, 보다 바람직하게는 0.1 체적％ 이상이고, 상기와 마찬가지로 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포의 기능 및 성질을 보다 양호하게 유지하는 관점에서, 바람직하게는 0.5 체적％ 이하, 보다 바람직하게는 0.1 체적％ 이하이다. 구체적으로는, 상기 혈청 농도는, 바람직하게는 0.1∼0.5 체적％, 보다 바람직하게는 0.01∼0.1 체적％이다.
땀샘 근상피 세포에의 불사화 유전자의 도입 방법으로는, 예를 들면, 바이러스 벡터를 이용하는 방법, 트랜스펙션법 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 이들의 방법 중에서는, 간편한 조작으로 높은 유전자 도입 효율이 얻어지는 점에서, 바이러스 벡터를 이용하는 방법이 바람직하다. 따라서, 상기 공정 (Ⅰ)에 있어서, 바이러스 벡터를 개재하여 불사화 유전자를 상기 땀샘 근상피 세포에 도입하는 것이 바람직하다.
바이러스 벡터로는, 예를 들면, 렌티바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 이들의 바이러스 벡터 중에서는, 땀샘 근상피 세포에 대한 높은 유전자 도입 효율을 갖고, 불사화 유전자의 안정 도입을 행할 수 있는 점에서, 렌티바이러스 벡터가 바람직하다. 불사화 유전자로는, 예를 들면, 인간 텔로머라아제 역전사효소(hTERT) 유전자, SV40t(스몰 t) 항원 유전자, SV40T(라지 T) 항원 유전자, c-myc 유전자, 파필로마바이러스의 E6 유전자, 파필로마바이러스의 E7 유전자 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 이들의 불사화 유전자는, 단독으로 이용해도 되고, 2종류 이상을 병용해도 된다. 이들의 불사화 유전자 중에서는, 땀샘 근상피 세포에 대한 높은 유전자 도입 효율이 얻어지는 점에서, hTERT 유전자와 SV40t 항원 유전자와 SV40T 항원 유전자를 병용하는 것이 바람직하다.
공정 (Ⅰ)에 있어서, 바이러스 벡터를 이용하는 방법에 의해 불사화 유전자를 땀샘 근상피 세포에 도입하는 경우, 불사화 유전자가 편입된 바이러스 벡터가 패키징된 재조합 바이러스 입자를 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체에 감염시킴으로써, 불사화 유전자를 땀샘 근상피 세포에 도입할 수 있다. 재조합 바이러스 입자는, 예를 들면, 바이러스 벡터에 불사화 유전자가 편입된 재조합 바이러스 벡터와 바이러스의 패키징에 필요한 유전자를 포함하는 벡터를 코트랜스펙션용 세포에 코트랜스펙션하고, 재조합 바이러스 입자를 회수하는 방법 등에 의해 조제할 수 있다. 재조합 바이러스 입자는, 상업적으로 용이하게 입수 가능한 재조합 바이러스 입자여도 된다. 세포 구조체에의 불사화 유전자의 도입은, 유전자 도입 보조제의 존재하에서 재조합 바이러스 입자를 세포 구조체에 접촉시켜 감염시킴으로써 행할 수 있다. 코트랜스펙션용 세포로는, 예를 들면, 293T 세포 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 유전자 도입 보조제로는, 예를 들면, 폴리브렌, 프로타민 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
세포 구조체와 재조합 바이러스 입자와의 접촉 방법으로는, 예를 들면, 부유한 상태의 세포 구조체를 포함하는 바이러스 감염용 배지에 재조합 바이러스 입자를 첨가하는 방법, 세포 구조체와 재조합 바이러스 입자를 포함하는 바이러스 감염용 배지를 혼합하는 방법 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다. 바이러스 감염용 배지로는, 예를 들면, 상기 무혈청 배지에 히드로코르티손-21-헤미숙시네이트, 재조합 인간 상피증식인자, 재조합 인간 염기성 선유아세포 증식 인자, 글루타민산, 비필수 아미노산 등을 보충한 배지, 상업적으로 용이하게 입수 가능한 배지 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
세포 구조체로서 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 땀샘 함유 조직을 이용하는 경우, 상기 땀샘 함유 조직과 재조합 바이러스 입자와의 혼합물 100μL 당의 당해 땀샘 함유 조직에 포함되는 땀샘의 수는, 유전자 도입 효율을 향상시켜 제조 효율을 향상시키는 관점에서, 바람직하게는 1개 이상, 보다 바람직하게는 4개 이상이고, 상기와 마찬가지로 유전자 도입 효율을 향상시켜 제조 효율을 향상시키는 관점에서, 바람직하게는 20개 이하, 보다 바람직하게는 10개 이하이다. 구체적으로는, 상기 혼합물 100μL 당의 당해 땀샘 함유 조직에 포함되는 땀샘의 수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 4∼10개이다. 또, 세포 구조체로서 상기 땀샘 함유 조직을 이용하는 경우, 감염 바이러스 입자수와 땀샘수의 비(감염 바이러스 입자수/땀샘수)는, 바람직하게는 1×102∼1×1010이다.
세포 구조체로서 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 스피어를 이용하는 경우, 상기 스피어와 재조합 바이러스 입자와의 혼합물 100μL 당의 상기 스피어의 수는, 유전자 도입 효율을 향상시켜 제조 효율을 향상시키는 관점에서, 바람직하게는 1개 이상, 보다 바람직하게는 4개 이상이고, 상기와 마찬가지로 유전자 도입 효율을 향상시켜 제조 효율을 향상시키는 관점에서, 바람직하게는 20개 이하, 보다 바람직하게는 10개 이하이다. 구체적으로는, 상기 혼합물 100μL 당의 상기 스피어의 수는, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 4∼10개이다. 또, 세포 구조체로서 상기 스피어를 이용하는 경우, 감염 바이러스 입자수와 스피어수의 비(감염 바이러스수/스피어수)는, 바람직하게는 1×102∼1×1010이다.
다음으로, 공정 (Ⅱ)에서는, 상기 공정 (Ⅰ)에서 얻어진 유전자 도입체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여 불사화 땀샘 근상피 세포를 얻는다.
공정 (Ⅱ)에 이용되는 배지는, 공정 (Ⅰ)에 이용되는 부유 배양용 배지와 마찬가지이다. 공정 (Ⅱ)에 있어서의 유전자 도입체의 배양 조건은, 스피어의 제조 방법에 있어서의 땀샘 세포의 배양 조건과 마찬가지이다.
세포 구조체로서 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 땀샘 함유 조직을 이용한 경우, 공정 (Ⅰ)에서 얻어지는 유전자 도입체는, 땀샘 이외의 조직 등을 포함하는 점에서, 유전자 도입체로부터 불사화 땀샘 근상피 세포를 단리하는 공정을 추가로 행할 수 있다. 유전자 도입체로부터의 불사화 땀샘 근상피 세포의 단리는, 예를 들면, 세포 해리용 시약을 유전자 도입체에 작용시키는 것, 역학적 자극을 유전자 도입체에 부여하는 것, 세포 해리용 시약과 역학적 자극을 병용하는 것 등에 의해 행할 수 있다. 세포 해리용 시약은, 상기 스피어의 제조 방법의 공정 (b2)에 이용되는 세포 해리용 시약과 마찬가지이다. 역학적 자극으로는, 피펫팅에 의한 자극 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
유전자 도입체가 불사화 땀샘 근상피 세포 이외의 세포를 포함하는 경우, 본 발명의 방법은, 공정 (Ⅱ)의 후에, 불사화 땀샘 근상피 세포를 단리하는 공정을 추가로 포함시킬 수 있다. 불사화 땀샘 근상피 세포의 단리 방법으로는, 예를 들면, 땀샘 근상피 세포 특이적 마커를 지표로 이용하는 세포 소팅 등을 들 수 있지만, 본 발명은, 이러한 예시만으로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 방법으로 얻어진 불사화 땀샘 근상피 세포는, 땀샘 근상피 세포의 특징 (i)∼(ⅲ): (i) α-평활근 액틴 발현 양성,
(ⅱ) 판사이토케라틴 발현 양성 및 ATP1a1 발현 양성을 나타내는 것, 및
(ⅲ) 5회 이상의 계대 후에 스피어 형성능을 갖는 것을 조사함으로써 동정(同定)할 수 있다. α-평활근 액틴, 판사이토케라틴 및 ATP1a1 각각의 발현 유무는, 예를 들면, 형광 면역세포 염색법, 리얼타임 RT-PCR법 등에 의해 확인할 수 있다. 스피어 형성능은, 전술의 스피어의 제조 방법과 마찬가지의 방법에 의해 확인할 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 불사화 근상피 세포에 의하면, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 가지며, 당해 기능 및 성질을 갖는 세포를 장기간에 걸쳐 증식시킬 수 있다. 또, 본 발명의 불사화 근상피 세포의 제조 방법에 의하면, 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포를 높은 제조 효율로 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명의 불사화 근상피 세포 및 본 발명의 불사화 근상피 세포의 제조 방법은, 제한제, 데오도런트제 등의 외용제, 땀샘 기능의 개선제 등의 개발 등에 이용되는 것이 기대되는 것이다.
실시예
이하에 실시예에 의해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은, 이러한 실시예만으로 한정되는 것은 아니다. 이하에 있어서, 각 약어 및 각 용어의 의미는, 이하와 같다.
＜약어 및 용어의 설명＞
EDTA: 에틸렌디아민 사초산(四酢酸)
FBS: 소태아혈청
GAPDH: 글리세르알데히드 3인산탈수소효소
GFP: 녹색 형광 단백질
GFP 재조합 바이러스: GFP 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스
hTERT 재조합 바이러스: hTERT 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스
PBS: 인산완충생리식염수
SV40Tt 재조합 바이러스: SV40t 항원 유전자 및 SV40T 항원 유전자를 포함하는 재조합 렌티바이러스
α-SMA: α-평활근 액틴
제조예 1
기초 배지[스템 셀 테크놀로지스사 제조, 상품명: Complete MammoCult HumanMedium]에, 히드로코르티손-21-헤미숙시네이트, 재조합 인간 상피 증식 인자, 재조합 인간 염기성 선유아세포 증식 인자, 헤파린 및 페니실린/스트렙토마이신 혼합액[페니실린 농도 10000 유닛/mL, 스트렙토마이신 농도 10000㎍/mL]을 각각의 농도가 10.5㎍/mL(히드로코르티손-21-헤미숙시네이트), 10ng/mL(재조합 인간 상피 증식 인자), 10ng/mL(재조합 인간 염기성 선유아세포 증식 인자), 4㎍/mL(헤파린) 및 100㎍/mL(페니실린/스트렙토마이신 혼합액)가 되도록 첨가하여 배지 (Ⅰ)을 얻었다.
제조예 2
기초 배지[스템 셀 테크놀로지스사 제조, 상품명: Complete MammoCult HumanMedium]에, 히드로코르티손-21-헤미숙시네이트, 재조합 인간 상피 증식 인자, 재조합 인간 염기성 선유아세포 증식 인자, 헤파린 및 페니실린/스트렙토마이신 혼합액 및 세포 배양용 인공기저막 매트릭스[코닝 인코퍼레이티드(Corning Inc.) 제조, 상품명: Growth Factor Reduced Matrigel Matrix]를 각각의 농도가 10.5㎍/mL(히드로코르티손-21-헤미숙시네이트), 10ng/mL(재조합 인간 상피 증식 인자), 10ng/mL(재조합 인간 염기성 선유아세포 증식 인자), 4㎍/mL(헤파린), 100㎍/mL(페니실린/스트렙토마이신 혼합액) 및 2 체적％(세포 배양용 인공기저막 매트릭스)가 되도록 첨가하여 배지 (Ⅱ)를 얻었다.
제조예 3
기초 배지[스템 셀 테크놀로지스사 제조, 상품명: Complete MammoCult HumanMedium]에, 히드로코르티손-21-헤미숙시네이트, 재조합 인간 상피 증식 인자 및 재조합 인간 염기성 선유아세포 증식 인자를 각각의 농도가 10.5㎍/mL(히드로코르티손-21-헤미숙시네이트), 10ng/mL(재조합 인간 상피 증식 인자) 및 10ng/mL(재조합 인간 염기성 선유아세포 증식 인자)가 되도록 첨가하여 배지 (Ⅲ)를 얻었다. 폴리브렌을 그 농도가 10㎍/mL가 되도록 배지 (Ⅲ)에 첨가하여 바이러스 감염용 배지를 얻었다.
제조예 4
트립신 용액[써모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤 제조, 상품명: 2.5％ Trypsin(10×), no Phenol Red], 둘베코 PBS[써모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤 제조, 상품명: DPBS, no calcium, no magnesium], 및 EDTA 용액[닛폰 진사 제조, 상품명: 0.5M EDTA]을 혼합함으로써, 0.5 질량％ 트립신-EDTA 용액을 얻었다.
제조예 5
분말상(狀)의 디스파제[써모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤 제조, 상품명: Dispase Ⅱ, powder]를 둘베코 PBS[써모 피셔 사이언티픽 가부시키가이샤 제조, 상품명: DPBS, no calcium, no magnesium]에 용해시킴으로써, 5U/mL 디스파제액을 얻었다.
참고예 1
(1) 해리 상태의 땀샘 세포의 제조
피부 조직으로서, 생체(68세의 사람)로부터 절제 후 바로 4℃에서 냉장 보존되고, 절제 후 48시간 이내의 눈꺼풀의 피부 조직을 이용했다. 피부 조직을 10μM 뉴트럴 레드(Neutral Red) 함유 PBS에 담금으로써, 상기 피부 조직 중의 땀샘에 뉴트럴 레드를 도입시켰다. 다음으로, 광학 현미경하에서 핀셋과 가위를 이용하여, 상기 피부 조직으로부터 땀샘을 포함하는 조직편을 분리했다. 분리된 조직편을 15mL 용량 튜브 중의 무균 PBS 내에 모았다. 상기 조직편을 함유하는 PBS를 가볍게 진탕시킨 후, 당해 PBS를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거함으로써, 상기 조직편을 세정했다.
제조예 1에서 얻어진 배지 (Ⅰ) 10mL를 상기 튜브 중의 상기 조직편과 혼합했다. 다음으로, 콜라게나제 Ⅱ를 그 농도가 600U/mL가 되도록 상기 튜브 중의 배지 (Ⅰ)에 첨가했다. 그 후, 상기 튜브 중의 상기 조직편을 로테이터로 회전시키면서 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트함으로써, 상기 조직편으로부터 교원 섬유를 제거했다.
인큐베이션 개시 시부터 4시간 경과 후, 상기 튜브 중의 배지 (Ⅰ) 및 교원 섬유 제거 후의 조직편을 직경 10cm의 디시로 옮겼다. 광학 현미경하에서 피펫을 이용하여, 상기 디시 위의 상기 조직편을 채취했다. 채취된 조직편을 15mL 용량 튜브 중의 무균 PBS 내에 모았다. 상기 조직편을 함유하는 PBS를 가볍게 진탕시킨 후, 당해 PBS를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거함으로써, 상기 조직편을 세정했다.
세정 후의 조직편과, 제조예 4에서 얻어진 0.5 질량％ 트립신-EDTA 용액 1mL를 15mL 용량 튜브 중에서 혼합했다. 피펫을 이용하여, 상기 튜브 중의 땀샘을 3분간 교반함으로써, 땀샘을 구성하는 땀샘 세포를 서로 해리시켜, 해리 상태의 땀샘 세포(이하, 「해리 땀샘 세포」라고도 한다)를 얻었다.
(2) 스피어 배양
상기 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포와 2 질량％ FBS/PBS 용액 9mL를 혼합했다. 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 당해 혼합액으로부터 상청을 제거했다. 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포에 제조예 5에서 얻어진 5U/mL 디스파제액 1mL를 첨가한 후, 피펫을 이용하여, 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포를 교반했다. 다음으로, 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포를 함유하는 혼합액을 셀 스트레이너[메시 사이즈: 40㎛, 코닝사 제조, 상품명: Falcon(등록상표) 40㎛ 셀 스트레이너, 블루, 멸균, 개별 포장]에 통과시켜 응집한 세포를 제거함으로써, 해리 땀샘 세포의 부유액을 얻었다.
2 질량％ FBS/PBS 용액 9mL를 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포의 부유액과 혼합했다. 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 당해 혼합액으로부터 상청을 제거해, 세포 함유액을 얻었다. 세포 함유액의 일부와 혈구 계산반을 이용하여, 세포 함유액의 세포수를 산출했다. 해리 땀샘 세포의 농도가 1×103∼7×103개/mL가 되도록 상기 튜브에 제조예 2에서 얻어진 배지 (Ⅱ)를 첨가하여, 해리 땀샘 세포를 함유하는 혼합액을 얻었다. 얻어진 혼합액을 저접착 플레이트[코닝사 제조, 상품명: 초저접착 플레이트 24 웰]에 넣었다. 상기 플레이트 중의 배지 (Ⅱ)에 부유시킨 상태에서 상기 해리 땀샘 세포를 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트했다.
배양 개시 후, 스피어가 형성된 시점에서, 상기 스피어를 15mL 용량 튜브로 옮겼다. 상기 스피어를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 액체 성분을 제거했다. 다음으로, 세포 회수용 용액(코닝사 제조, 상품명: 셀 리커버리 솔루션) 1mL를 상기 튜브 중의 스피어와 혼합하여, 스피어 함유액을 얻었다. 그 후, 얻어진 스피어 함유액이 들어간 튜브를 빙상(氷上)에서 1∼2시간 정치(靜置)했다.
(3) 바이러스 감염
GFP 재조합 바이러스 입자 용액[어플라이드 바이오로지컬 머티리얼즈(Applied Biological Materials)사 제조, 상품명: GFP Control Lentivirus, GFP재조합 바이러스 입자 농도: 1×106U/mL]을 폴리에틸렌글리콜 침전법에 따라 농축했다. 얻어진 농축물을 상기 바이러스 감염용 배지로 GFP 재조합 바이러스 입자 농도가 1×108U/mL가 되도록 희석함으로써, GFP 재조합 바이러스 희석액을 얻었다.
상기 (2) 「스피어 배양」에서 얻어진 스피어 함유액과 PBS 9mL를 혼합했다. 다음으로, 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다. 원심 분리 후의 스피어 4∼10개와 제조예 3에서 얻어진 바이러스 감염용 배지 90μL를 혼합했다. 얻어진 혼합액에 상기 GFP 재조합 바이러스 희석액 10μL를 첨가하여, 스피어-바이러스 혼합액을 얻었다. 상기 스피어-바이러스 혼합액을 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트하여 스피어를 구성하는 땀샘 세포에 재조합 바이러스를 감염시킴으로써, 스피어를 구성하는 세포에 GFP 유전자를 도입했다. 바이러스 감염 개시 시부터 24시간 경과 후, 바이러스 감염 땀샘 스피어를 회수했다.
참고예 2
참고예 1의 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포와 PBS 9mL를 혼합했다. 다음으로, 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다. 원심 분리 후의 해리 땀샘 세포 5×102∼1×105개와 제조예 3에서 얻어진 바이러스 감염용 배지 90μL를 혼합했다. 얻어진 혼합액에, 상기 GFP 재조합 바이러스 희석액 10μL를 첨가하여, 스피어-바이러스 혼합액을 얻었다. 상기 스피어-바이러스 혼합액을 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트하여 해리 땀샘 세포에 재조합 바이러스를 감염시킴으로써, 해리 땀샘 세포에 GFP 유전자를 도입했다. 바이러스 감염 개시 시부터 24시간 경과 후, 바이러스 감염 땀샘 세포를 회수했다.
시험예 1
참고예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어 및 참고예 2에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 세포에 있어서의 GFP에 의거하는 형광을 형광 현미경하에 관찰했다. 또, 참고예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어 및 참고예 2에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 세포를 공초점 현미경하에 관찰했다.
참고예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 있어서의 GFP에 의거하는 형광을 형광 현미경하에 관찰한 결과를 도 1(A), 참고예 2에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 세포에 있어서의 GFP에 의거하는 형광을 형광 현미경하에 관찰한 결과를 도 1(B), 참고예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 공초점 현미경하에 관찰한 결과를 도 1(C), 참고예 2에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 세포를 공초점 현미경하에 관찰한 결과를 도 1(D)에 나타낸다. 도면 중, 스케일바는 153㎛를 나타낸다. 또, 도 1(A)에 있어서의 화살표 머리는 바이러스 감염 땀샘 스피어, 도 1(B)에 있어서의 화살표 머리는 바이러스 감염 땀샘 세포를 나타낸다.
도 1(A) 및 (C)에 나타난 결과로부터, 참고예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에서는, 표면에 존재하는 세포 전체에 GFP가 발현하고 있는 것을 알 수 있다. 이에 반해, 참고예 2에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 세포는, GFP를 발현하고 있는 세포가 거의 존재하고 있지 않은 것을 알 수 있다. 이들의 결과로부터, 배지 중에 스피어를 부유시킨 상태에서 당해 스피어에 포함되는 땀샘 세포에 바이러스를 감염시킴으로써, 해리한 상태의 땀샘 세포에 바이러스를 감염시키는 경우에 비해, 높은 효율로 유전자를 땀샘 세포에 도입할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 1
참고예 1의 (2) 「스피어 배양」에서 얻어진 스피어 함유액과 PBS 9mL를 혼합했다. 다음으로, 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다. 원심 분리 후의 스피어 4∼10개와 제조예 3에서 얻어진 바이러스 감염용 배지 100μL를 혼합했다. 얻어진 혼합액에, hTERT 재조합 바이러스 입자 용액[어플라이드 바이오로지컬 머티리얼즈사 제조의 상품명: High Titer Lentivirus containing hTERT, hTERT 재조합 바이러스 입자 농도: 1×109U/mL] 0.5μL와 SV40Tt 재조합 바이러스 입자 용액[어플라이드 바이오로지컬 머티리얼즈사 제조의 상품명: High Titer Lentivirus expressing SV40 large and small T antigens, SV40Tt 재조합 바이러스 입자 농도: 1×109U/mL] 0.5μL를 첨가하여, 스피어-바이러스 혼합액을 얻었다. 상기 스피어-바이러스 혼합액을 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트하여 스피어를 구성하는 땀샘 세포에 재조합 렌티바이러스를 감염시킴으로써, 스피어를 구성하는 세포에 불사화 유전자를 도입했다. 바이러스 감염 개시 시부터 24시간 경과 후, 바이러스 감염 땀샘 스피어를 회수했다.
비교예 1
참고예 1의 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」 및 (2)의 「스피어 배양」과 마찬가지의 조작을 행함으로써, 스피어를 얻었다.
시험예 2
(1) 스피어 계대 배양
이하의 (1-1) 및 (1-2)를 행하는 것을 「1회의 계대 배양」이라고 정의했다.
(1-1) 해리 땀샘 세포의 제조
실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어와, 제조예 4에서 얻어진 0.5 질량％ 트립신-EDTA 용액 1mL를 15mL 용량 튜브 중에서 혼합했다. 피펫을 이용하여, 상기 튜브 중의 땀샘을 3분간 교반함으로써, 땀샘을 구성하는 땀샘 세포를 서로 해리시켜, 해리 땀샘 세포를 얻었다.
또, 상기에 있어서, 실시예에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용하는 대신에 비교예 1에서 얻어진 스피어를 이용한 것을 제외하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행하여, 해리 땀샘 세포를 얻었다.
(1-2) 스피어 배양
상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포와, 2 질량％ FBS/PBS 용액 9mL를 혼합했다. 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다. 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포에 제조예 5에서 얻어진 5U/mL 디스파제액 1mL를 첨가한 후, 피펫을 이용하여, 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포를 교반했다. 다음으로, 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포를 함유하는 혼합액을 셀 스트레이너[메시 사이즈: 40㎛, 코닝제, 상품명: Falcon(등록상표) 40㎛ 셀 스트레이너, 블루, 멸균, 개별 포장]에 통과시켜 응집한 세포를 제거함으로써, 해리 땀샘 세포의 부유액을 얻었다.
2 질량％ FBS/PBS 용액 9mL를 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포의 부유액과 혼합했다. 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다. 다음으로, 해리 땀샘 세포의 농도가 2.3×103∼2.7×103개/mL가 되도록 상기 튜브에 제조예 2에서 얻어진 배지 (Ⅱ)를 첨가하여, 해리 땀샘 세포를 함유하는 혼합액을 얻었다. 얻어진 혼합액을 저접착 플레이트[코닝사 제조, 상품명: 초저접착 플레이트 24 웰]에 넣었다. 상기 플레이트 중의 배지 (Ⅱ)에 부유시킨 상태에서 상기 해리 땀샘 세포를 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트했다.
배양 개시 후, 스피어가 형성된 시점에서, 상기 스피어를 15mL 용량 튜브로 옮겼다. 상기 스피어를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 액체 성분을 제거했다. 다음으로, 세포 회수용 용액(코닝사 제조, 상품명: 셀 리커버리 솔루션) 1mL를 상기 튜브 중의 스피어와 혼합하여, 스피어 함유액을 얻었다. 그 후, 얻어진 스피어 함유액이 들어간 튜브를 빙상에서 1∼2시간 정치했다.
(1-3) 스피어 형성능의 평가
상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」 및 (1-2) 「스피어 배양」에서 이루어지는 일련의 조작을 반복하고, 상기 (1-2) 「스피어 배양」에 있어서의 스피어의 형성 유무에 의거하여, 스피어 형성능을 조사했다.
실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 도 2(A), 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 도 2(B)에 나타낸다. 도면 중, 화살표 머리는, 스피어를 나타낸다.
도 2에 나타난 결과로부터, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 땀샘 세포는, 9회의 계대 후여도 스피어 형성능을 갖고 있는 것을 알 수 있다. 이에 반해, 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포는, 4회의 계대 후에 스피어 형성능을 갖고 있지 않은 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 땀샘 세포는, 20회 이상 계대한 경우여도 스피어를 형성하는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 배지 중에 스피어를 부유시킨 상태에서 당해 스피어에 포함되는 땀샘 세포에, 불사화 유전자를 갖는 렌티바이러스를 감염시킴으로써, 불사화 땀샘 세포가 얻어지는 것을 알 수 있다.
(2) 불사화 땀샘 세포의 동정
항(抗)판사이토케라틴 항체, 항판사이토케라틴 항체에 대한 형광 표식 2차 항체, 항α-SMA 항체 및 당해 항α-SMA 항체에 대한 형광 표식 2차 항체를 이용하여 상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포 및 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포의 형광 면역 염색을 행하였다. 다음으로, 면역 염색 후의 해리 땀샘 세포에 있어서의 판사이토케라틴에 의거하는 형광의 강도[이하, 「형광 강도 A」라고 한다] 및 α-SMA에 의거하는 형광의 강도[이하, 「형광 강도 B」라고 한다]를 측정했다.
다음으로, 평가 대상의 세포에 있어서의 형광 강도 A로부터 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포에 있어서의 형광 강도 A를 뺌으로써, 평가 대상의 세포에 있어서의 판사이토케라틴 발현량을 산출했다. 또, 평가 대상의 세포에 있어서의 형광 강도 B로부터 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포에 있어서의 형광 강도 B를 뺌으로써, 평가 대상의 세포에 있어서의 α-SMA 발현량을 구했다.
세포의 종류와 판사이토케라틴 발현량과의 관계를 조사한 결과를 도 3(A), 세포의 종류와 α-SMA 발현량과의 관계를 조사한 결과를 도 3(B)에 나타낸다. 도 3(A) 중, 레인 1은 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포에 있어서의 판사이토케라틴 발현량, 레인 2는 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포에 있어서의 판사이토케라틴 발현량을 나타낸다. 도 3(B) 중, 레인 1은 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포에 있어서의 α-SMA 발현량, 레인 2는 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포에 있어서의 α-SMA 발현량을 나타낸다.
도 3(A) 및 (B)에 나타난 결과로부터, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포(레인 1 참조)는, 근상피 세포 마커인 판사이토케라틴 및 α-SMA의 양쪽을 발현하고 있는 것을 알 수 있다. 이들의 결과로부터, 상기 불사화 땀샘 세포는, 불사화 땀샘 근상피 세포인 것을 알 수 있다. 따라서, 배지 중에 스피어를 부유시킨 상태에서 당해 스피어에 포함되는 땀샘 세포에 바이러스를 감염시킴으로써, 불사화 땀샘 근상피 세포가 얻어지는 것을 알 수 있다.
(3) 불사화 땀샘 근상피 세포에 있어서의 땀샘 세포 마커의 발현의 검토
상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포로부터 전(全) RNA를 추출했다. 얻어진 전 RNA를 그 농도가 1㎍/μL가 되도록 DN아제/RN아제프리의 정제수[invitrogen사 제조, 상품명: UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water]를 첨가했다. 역전사 키트[QIAGEN사 제조, 상품명: Quatitect Reverse Transcription Kit]를 이용하여, 상기 전 RNA로부터 cDNA를 합성해 측정 시료를 얻었다.
얻어진 측정 시료를 주형(鑄型)으로 하고, PCR용 키트[도요보(주) 제조, 상품명: THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix]와 리얼타임 PCR 장치[어플라이드 바이오 시스템즈(Applied bio systems) 제조, 상품명: VⅱA7]와, ATP1a1 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 이용하여, ATP1a1 유전자의 cDNA를 주형으로 하는 뉴클레오티드 합성량이 역치에 도달하기까지의 사이클수(이하, 「CtA치」라고 한다)를 측정했다. 또, 상기에 있어서, ATP1a1 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 이용하는 대신에 대조 유전자인 GAPDH 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 쌍을 이용한 것을 제외하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행하여, 대조 유전자의 cDNA를 주형으로 하는 뉴클레오티드 합성량이 역치에 도달하기까지의 사이클수(이하, 「CtB치」라고 한다)를 측정했다. 리얼타임 RT-PCR법에 있어서의 서멀 프로파일은, 95℃에서 1분간의 처리 후, 95℃에서 5초간의 변성과 55℃에서 10초간의 어닐링과 72℃ 20초간의 신장을 1 사이클로 하는 40 사이클의 반응이다.
CtA치 및 CtB치를 이용하여, 식 (Ⅰ)에 따라, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 근상피 세포에 있어서의 ATP1a1 유전자의 발현치를 구했다:
[수학식 1]
Figure pct00001
(Ⅰ).
또, 상기에 있어서, 상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포를 이용하는 대신에 대조 세포로서 ATP1a1 유전자를 발현하고 있지 않은 피부 표피 세포를 이용한 것을 제외하고, 상기와 마찬가지의 조작을 행하여, 대조 세포에 있어서의 ATP1a1 유전자의 발현치를 구했다.
불사화 땀샘 근상피 세포에 있어서의 ATP1a1 유전자의 발현치로부터 대조 세포에 있어서의 ATP1a1 유전자의 발현치를 뺌으로써, 불사화 땀샘 근상피 세포에 있어서의 ATP1a1 유전자의 보정 발현치를 구했다. 다음으로, 상기 보정 발현치에 의거하여, 이하의 평가 기준에 따라, 불사화 땀샘 근상피 세포가 ATP1a1 유전자를 발현하고 있는지 여부를 평가했다.
＜평가 기준＞
「불사화 땀샘 근상피 세포가 ATP1a1 유전자를 발현하고 있다」
…보정 발현치가 「양(正)의 값」이다.
「불사화 땀샘 근상피 세포가 ATP1a1 유전자를 발현하고 있지 않다」
…보정 발현치가 「0」 또는 「음(負)의 값」이다.
그 결과, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 근상피 세포에 있어서의 ATP1a1 유전자의 발현치가 양의 값이었던 점에서, 불사화 땀샘 근상피 세포가 ATP1a1 유전자를 발현하고 있는 것을 알았다. ATP1a1은, 땀샘 근상피 세포 마커의 하나이다. 따라서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 근상피 세포는, 땀샘 근상피 세포 마커를 발현하고 있는 것을 알 수 있다.
실시예 2
(1) 땀샘 함유 조직의 제조
피부 조직으로서, 생체(41세의 사람)로부터 절제 후 바로 4℃에서 냉장 보존되고, 절제 후 48시간 이내의 눈꺼풀의 피부 조직을 이용했다. 피부 조직을 10μM 뉴트럴 레드 함유 PBS에 담금으로써, 상기 피부 조직 중의 땀샘에 뉴트럴 레드를 도입시켰다. 다음으로, 광학 현미경하에서 핀셋과 가위를 이용하여, 상기 피부 조직으로부터 땀샘을 포함하는 조직편을 분리했다. 분리된 조직편을 15mL 용량 튜브 중의 무균 PBS 내에 모았다. 상기 조직편을 함유하는 PBS를 가볍게 진탕시킨 후, 당해 PBS를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거함으로써, 상기 조직편을 세정했다.
제조예 1에서 얻어진 배지 (Ⅰ) 10mL를 상기 튜브 중의 상기 조직편과 혼합했다. 다음으로, 콜라게나제 Ⅱ를 그 농도가 600U/mL가 되도록 상기 튜브 중의 배지 (Ⅰ)에 첨가했다. 그 후, 상기 튜브 중의 상기 조직편을 로테이터로 회전시키면서 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트함으로써, 상기 조직편으로부터 교원 섬유를 제거했다.
인큐베이션 개시 시부터 4시간 경과 후, 상기 튜브 중의 배지 (Ⅰ) 및 교원 섬유 제거 후의 조직편을 직경 10cm의 디시로 옮겼다. 광학 현미경하에서 피펫을 이용하여, 상기 디시 위의 상기 조직편을 채취했다. 채취된 조직편을 15mL 용량 튜브 중의 무균 PBS 내에 모았다. 상기 조직편을 함유하는 PBS를 가볍게 진탕시킨 후, 당해 PBS를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거함으로써, 상기 조직편을 세정했다.
세정 후의 조직편과 배지 (Ⅰ) 10mL를 15mL 용량 튜브 중에서 혼합했다. 얻어진 혼합액에 디스파제를 그 농도가 1U/mL가 되도록 첨가했다. 얻어진 혼합액을 직경 10cm의 디시로 옮긴 후, 상기 혼합액을 정치 상태에서 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트했다. 인큐베이션 개시 시부터 8시간 경과 후, 상기 혼합액에 2 질량％ FBS/PBS 용액 10mL를 첨가하여 혼합액을 희석해 효소 반응을 정지시켰다.
광학 현미경하에서 피펫을 이용하여, 상기 디시 위의 땀샘을 포함하는 조직편을 채취했다. 채취된 조직편을 15mL 용량 튜브 중의 무균 PBS 내에 모았다. 상기 조직편을 포함하는 PBS를 가볍게 진탕시킨 후, 당해 PBS를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거함으로써, 땀샘 함유 조직을 얻었다.
(2) 바이러스 감염
hTERT 재조합 바이러스 입자 용액과 SV40Tt 재조합 바이러스 입자 용액을 상기 바이러스 감염용 배지로 hTERT 재조합 바이러스 입자 농도가 1×108U/mL 및 SV40Tt 재조합 바이러스 입자 농도가 1×108U/mL가 되도록 희석하여 불사화 유전자 함유 재조합 바이러스 희석액을 얻었다.
상기 (1) 「땀샘 함유 조직의 제조」에서 얻어진 땀샘 함유 조직과 PBS 9mL를 혼합했다. 다음으로, 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다. 원심 분리 후의 4∼10개의 땀샘을 함유하는 땀샘 함유 조직과 제조예 3에서 얻어진 바이러스 감염용 배지 100μL를 혼합했다. 얻어진 혼합액에 상기 불사화 유전자 함유 재조합 바이러스 희석액 2μL를 첨가하여, 조직-바이러스 혼합액을 얻었다. 상기 조직-바이러스 혼합액을 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트하여 땀샘을 구성하는 땀샘 세포에 재조합 렌티바이러스를 감염시켰다. 또한, 바이러스 감염 개시부터 30분∼12시간마다 상기 불사화 유전자 함유 재조합 바이러스 희석액 2μL를 첨가하여 상기 땀샘 함유 조직에 포함되는 땀샘 세포에 재조합 바이러스를 감염시킴으로써, 땀샘 세포에 불사화 유전자를 도입했다. 바이러스 감염 개시 시부터 33시간 경과 후, 바이러스 감염 조직을 회수했다.
시험예 3
시험예 2의 (1) 「스피어 계대 배양」에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용하는 대신에 실시예 2에서 얻어진 바이러스 감염 조직을 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1) 「스피어 계대 배양」과 마찬가지의 조작을 행하여, 스피어 계대 배양을 행하였다.
실시예 2에서 얻어진 바이러스 감염 조직에 포함되는 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 도 4(A), 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포의 스피어 형성능과 계대수와의 관계를 조사한 결과를 도 4(B)에 나타낸다. 도면 중, 화살표 머리는, 스피어를 나타낸다.
도 4에 나타난 결과로부터, 실시예 2에서 얻어진 바이러스 감염 조직에 포함되는 땀샘 세포는, 7회째의 계대 배양 후에 있어서도 스피어를 형성할 수 있는 것에 반해, 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포는, 4회째의 계대 배양 후에 스피어를 형성할 수 없는 것을 알 수 있다.
또한, 실시예 2에서 얻어진 바이러스 감염 조직에 포함되는 땀샘 세포는, 12회 이상 계대한 경우라도 스피어를 형성하는 것이 확인되었다. 또, 실시예 2에서 얻어진 바이러스 감염 조직에 포함되는 땀샘 세포에 있어서의 판사이토케라틴 및 α-SMA의 발현 유무를 조사한바, 판사이토케라틴 및 α-SMA가 발현하고 있는 것이 확인되었다.
이상의 결과로부터, 배지 중에 땀샘 함유 조직을 부유시킨 상태에서 당해 땀샘 함유 조직에 포함되는 땀샘 근상피 세포에 바이러스를 감염시킴으로써, 불사화 땀샘 근상피 세포가 얻어지는 것을 알 수 있다.
참고예 3∼7
(1) 해리 땀샘 세포의 제조
참고예 1의 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」에 있어서, 68세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직을 이용하는 대신에 20세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직(참고예 3), 71세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직(참고예 4), 74세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직(참고예 5), 51세인 사람의 복부의 피부 조직(참고예 6) 또는 55세인 사람의 복부의 피부 조직(참고예 7)을 이용한 것을 제외하고, 참고예 1의 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」와 마찬가지의 조작을 행하여, 해리 땀샘 세포를 얻었다.
(2) 스피어 배양
참고예 1의 (2) 「스피어 배양」에 있어서, 참고예 1의 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포를 이용하는 대신에 참고예 3∼7의 (1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 각 해리 땀샘 세포를 이용한 것을 제외하고, 참고예 1의 (2) 「스피어 배양」과 마찬가지의 조작을 행하여, 스피어 함유액을 얻었다.
실시예 3∼7
실시예 1에 있어서, 참고예 1의 (2) 「스피어 배양」에서 얻어진 스피어 함유액을 이용하는 대신에 참고예 3에서 얻어진 스피어 함유액(실시예 3), 참고예 4에서 얻어진 스피어 함유액(실시예 4), 참고예 5에서 얻어진 스피어 함유액(실시예 5), 참고예 6에서 얻어진 스피어 함유액(실시예 6) 또는 참고예 7에서 얻어진 스피어 함유액(실시예 7)을 이용한 것을 제외하고, 실시예 1과 마찬가지의 조작을 행하여, 바이러스 감염 땀샘 스피어를 얻었다.
비교예 3∼7
참고예 1의 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」에 있어서, 68세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직을 이용하는 대신에 20세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직(비교예 3), 71세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직(비교예 4), 74세인 사람의 눈꺼풀의 피부 조직(비교예 5), 51세인 사람의 복부의 피부 조직(비교예 6) 또는 55세인 사람의 복부의 피부 조직(비교예 7)을 이용한 것을 제외하고, 비교예 1의 (1) 「해리 상태의 땀샘 세포의 제조」와 마찬가지의 조작을 행하여, 해리 땀샘 세포를 얻었다.
시험예 4
시험예 2의 (1) 「스피어 계대 배양」에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용하는 대신에 실시예 3∼7에서 얻어진 바이러스 감염 조직을 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1) 「스피어 계대 배양」과 마찬가지의 조작을 행하여, 스피어 계대 배양을 행하였다.
또, 시험예 2의 (1) 「스피어 계대 배양」에 있어서, 비교예 1에서 얻어진 해리 땀샘 세포를 이용하는 대신에 비교예 3∼7에서 얻어진 해리 땀샘 세포를 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1) 「스피어 계대 배양」과 마찬가지의 조작을 행하여, 스피어 계대 배양을 행하였다. 스피어 형성능을 갖는 세포의 계대수를 표 1에 나타낸다.
[표 1]
Figure pct00002
표 1에 나타난 결과로부터, 실시예 3∼7에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어에 포함되는 땀샘 세포는, 적어도 18회의 계대 후여도 스피어 형성능을 갖고 있는 것을 알 수 있다. 이에 반해, 비교예 3 및 5∼7에서 얻어진 해리 땀샘 세포는, 2회의 계대 후에 스피어 형성능을 잃는 것을 알 수 있다. 또, 비교예 4에서 얻어진 해리 땀샘 세포는, 3회의 계대 후에 스피어 형성능을 잃는 것을 알 수 있다.
이들 결과로부터, 배지 중에 스피어를 부유시킨 상태에서 당해 스피어에 포함되는 땀샘 세포에 바이러스를 감염시킴으로써, 피부 조직의 공급원의 종류의 여하를 불문하고, 불사화 땀샘 세포가 얻어지는 것을 알 수 있다.
실시예 1 및 3∼7에서 이용된 스피어 그리고 실시예 2에서 이용된 땀샘 함유 조직은, 모두, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 구조를 갖고 있다. 따라서, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 포함하는 바이러스를 당해 세포 구조체에 감염시킴으로써, 불사화 유전자를 근상피 세포에 도입할 수 있는 것을 알 수 있다.
시험예 5
(1) 스피어 계대 배양
이하의 (1-1) 및 (1-2)를 행하는 것을 「1회의 계대 배양」이라고 정의했다.
(1-1) 해리 땀샘 세포의 제조
시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용하는 대신에 실시예 3∼7에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」와 마찬가지의 조작을 행하여, 해리 땀샘 세포를 얻었다.
(1-2) 스피어 배양
상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포의 일부(세포수 A의 해리 땀샘 세포)와, 2 질량％ FBS/PBS 용액 9mL를 혼합했다. 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다. 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포에 제조예 5에서 얻어진 5U/mL 디스파제액 1mL를 첨가한 후, 피펫을 이용하여, 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포를 교반했다. 다음으로, 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포를 함유하는 혼합액을 셀 스트레이너[메시 사이즈: 40㎛, 코닝제, 상품명: Falcon(등록상표) 40㎛ 셀 스트레이너, 블루, 멸균, 개별 포장]에 통과시켜 응집한 세포를 제거함으로써, 해리 땀샘 세포의 부유액을 얻었다.
2 질량％ FBS/PBS 용액 9mL를 상기 튜브 중의 해리 땀샘 세포의 부유액과 혼합했다. 얻어진 혼합액을 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 상청을 제거했다.
다음으로, 얻어진 해리 땀샘 세포를 제조예 2에서 얻어진 배지 (Ⅱ)에 2.5×103개/mL가 되도록 첨가하여, 해리 땀샘 세포를 함유하는 혼합액을 얻었다. 얻어진 혼합액을 저접착 플레이트[코닝사 제조, 상품명: 초저접착 플레이트 24 웰]에 넣었다. 상기 플레이트 중의 배지 (Ⅱ)에 부유시킨 상태에서 상기 해리 땀샘 세포를 37℃의 5 체적％ 이산화탄소 분위기 중에서 인큐베이트했다.
배양 개시 후, 스피어가 형성된 시점에서, 상기 스피어를 15mL 용량 튜브로 옮겼다. 상기 스피어를 350×g 및 4℃에서 5분간의 원심 분리에 공급하여 액체 성분을 제거했다. 다음으로, 세포 회수용 용액(코닝사 제조, 상품명: 셀 리커버리 솔루션) 1mL를 상기 튜브 중의 스피어와 혼합하여, 스피어 함유액을 얻었다. 그 후, 얻어진 스피어 함유액이 들어간 튜브를 빙상에서 1∼2시간 정치했다.
(1-3) 세포 증식능의 평가
상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」 및 (1-2) 「스피어 배양」으로 이루어지는 일련의 조작을 스피어 형성이 정지할 때까지 반복했다.
상기 세포수 A와, 계대수 n(n은 양의 정수를 나타낸다)의 스피어 계대 배양 시에 상기 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포의 수(이하, 「세포수 B」라고 한다)를 이용하여, 식 (Ⅱ)에 따라, 각 계대간에서의 세포 증식 배율(KX)을 구했다:
[각 계대간에서의 세포 증식 배율(KX)]＝[세포수 B]/[세포수 A] 　(Ⅱ).
각 계대간에서의 세포 증식 배율(KX)을 이용하여, 식 (Ⅲ)에 따라, 실시예 3∼7에서 얻어진 스피어에 포함되는 땀샘 세포의 총 세포 증식 배율을 구했다:
[총 세포 증식 배율]＝K1×K2…×KX　　　(Ⅲ)
(식 중, X는 양의 정수를 나타낸다).
그 결과를 표 2에 나타낸다.
[표 2]
Figure pct00003
표 2에 나타난 결과로부터, 실시예 3∼7에서 얻어진 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포의 총 세포 증식 배율은, 2.6×1013배 이상인 것을 알 수 있다. 이에 반해, 불사화되어 있지 않은 땀샘 세포의 총 세포 증식 배율은 2.1배 이하였다. 이들의 결과로부터, 실시예 3∼7에서 얻어진 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포의 세포 증식능은, 불사화되어 있지 않은 땀샘 세포의 세포 증식능과 비교하여 향상되어 있는 것을 알 수 있다.
시험예 6
(1) 해리 땀샘 세포의 제조
시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용하는 대신에 실시예 3에서 얻어진 스피어(실험 번호 1), 실시예 4에서 얻어진 스피어(실험 번호 2) 또는 실시예 5에서 얻어진 스피어(실험 번호 3)를 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」와 마찬가지의 조작을 행하여, 해리 땀샘 세포를 얻었다. 또한, 상기에 있어서, 실시예 3에서 얻어진 스피어로서 계대수 5회의 스피어, 실시예 4에서 얻어진 스피어로서 계대수 8회의 스피어, 실시예 5에서 얻어진 스피어로서 계대수 14회의 스피어를 이용했다.
(2) 해리 땀샘 세포의 동결 보존
시험예 6의 (1) 「해리 완성 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포를 표 3에 나타나는 농도가 되도록 동결 보존액[다카라 바이오(주) 제조, 상품명 CELLBANKER(등록상표) 1plus] 1mL에 현탁했다. 얻어진 현탁액을 -80℃로 유지된 프리저로 동결시켜, 동결 세포를 얻었다. 얻어진 동결 세포를 -80℃로 유지된 프리저 또는 액체 질소 중에서 표 3에 나타나는 기간 보존했다. 그 후, 동결물을 해동하여 실험 번호 1∼3의 해동 세포를 얻었다. 얻어진 해동 세포의 수를 측정했다. 이하에 있어서, 해동 세포의 수를 세포수 C로서 이용했다.
[표 3]
Figure pct00004
(2) 스피어 형성
시험예 2의 (1-2) 「스피어 배양」에 있어서, 시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포를 이용하는 대신에 시험예 6의 (2) 「해리 땀샘 세포의 동결 보존」에서 얻어진 해동 세포를 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1-2) 「스피어 배양」과 마찬가지의 조작을 행하여, 실험 번호 1∼3의 스피어 함유액 A를 얻었다.
(3) 스피어 계대 배양
이하의 (3-1) 및 (3-2)를 행하는 것을 「1회의 계대 배양」이라고 정의했다.
(3-1) 해리 땀샘 세포의 제조
시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용하는 대신에 시험예 6의 (2) 「스피어 형성」에서 얻어진 스피어 함유액 A 중, 실험 번호 3의 스피어 함유액 A를 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」와 마찬가지의 조작을 행하여, 실험 번호 3의 해리 땀샘 세포를 얻었다.
(3-2) 스피어 배양
시험예 2의 (1-2) 「스피어 배양」에 있어서, 시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포를 이용하는 대신에 시험예 6의 (3-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에서 얻어진 해리 땀샘 세포(실험 번호 3)를 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1-2) 「스피어 배양」과 마찬가지의 조작을 행하여, 실험 번호 3의 스피어 함유액 B를 얻었다.
(3-3) 세포 증식능의 평가
시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」에 있어서, 실시예 1에서 얻어진 바이러스 감염 땀샘 스피어를 이용하는 대신에 실험 번호 1의 스피어 함유액 A에 포함되는 스피어, 실험 번호 2의 스피어 함유액 A에 포함되는 스피어 및 실험 번호 3의 스피어 함유액 B에 포함되는 스피어(실험 번호 1∼3의 스피어)를 이용한 것을 제외하고, 시험예 2의 (1-1) 「해리 땀샘 세포의 제조」와 마찬가지의 조작을 행하여, 계대 배양 세포를 얻었다. 얻어진 계대 배양 세포의 수(이하, 「세포수 D」라고 한다)를 측정했다.
다음으로, 세포수 C와 세포수 D를 이용하여, 식(Ⅳ)에 따라, 실험 번호 1∼3의 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포를 동결 보존했을 때의 세포 증식 배율을 구했다:
[세포 증식 배율]＝[세포수 D]/[세포수 C]　　　(Ⅳ).
세포 증식능의 평가 결과를 표 4에 나타낸다. 표 중, 세포 증식능 및 스피어 형성능의 평가 기준은, 이하와 같다.
＜세포 증식능의 평가 기준＞
＋: 식 (Ⅳ)에 따라 산출된 세포 증식률이 1보다 크다.
－: 식 (Ⅳ)에 따라 산출된 세포 증식률이 1 이하이다.
＜스피어 형성능의 평가 기준＞
＋: 광학 현미경하에서 스피어의 형성이 확인된다.
－: 광학 현미경하에서 스피어의 형성이 확인되지 않는다.
[표 4]
Figure pct00005
표 4에 나타난 결과로부터, 실험 번호 1∼3의 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포는, 양호한 세포 증식능 및 양호한 스피어 형성능을 갖는 것을 알 수 있다. 이들의 결과로부터, 실험 번호 1∼3의 스피어에 포함되는 불사화 땀샘 세포는, 동결 보존을 한 경우라도, 세포 증식능 및 스피어 형성능이 뛰어난 점에서, 보존 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
이상 설명한 바와 같이, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 땀샘 근상피 세포에 도입함으로써, 불사화 땀샘 근상피 세포가 얻어지는 것을 알 수 있다. 또, 상기 조작을 행함으로써 얻어진 불사화 땀샘 근상피 세포는, 생체내에 있어서의 땀샘 근상피 세포와 마찬가지의 기능 및 성질을 가지며, 당해 기능 및 성질을 갖는 세포를 장기간에 걸쳐 증식시킬 수 있는 것을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 불사화 땀샘 근상피 세포 및 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법은, 제한제, 데오도런트제 등의 외용제, 땀샘 기능의 개선제 등의 개발 등에 이용되는 것이 기대되는 것이다.

Claims (6)

  1. α-평활근 액틴 및 판사이토케라틴을 발현하고, 적어도 5회의 계대 후에 스피어 형성능을 갖고 있는 것을 특징으로 하는 불사화(不死化) 땀샘 근상피 세포.
  2. 제 1 항에 있어서,
    ATP1a1을 추가로 발현하고 있는 불사화 땀샘 근상피 세포.
  3. 불사화 땀샘 근상피 세포를 제조하는 방법으로서,
    (Ⅰ) 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 세포 구조체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하면서, 불사화 유전자를 당해 땀샘 근상피 세포에 도입하여 유전자 도입체를 얻는 공정, 및
    (Ⅱ) 상기 공정 (Ⅰ)에서 얻어진 유전자 도입체를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여 불사화 땀샘 근상피 세포를 얻는 공정을 포함하는 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상기 공정 (Ⅰ)에 있어서, 바이러스 벡터를 개재하여 불사화 유전자를 상기 땀샘 근상피 세포에 도입하는 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 공정 (Ⅰ)을 행하기 전에, 채취된 피부 조직으로부터 적어도 교원 섬유의 전부 또는 일부를 제거하여 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 땀샘 함유 조직을 얻는 공정을 추가로 포함하고, 상기 공정 (Ⅰ)에 있어서, 상기 세포 구조체로서 상기 땀샘 함유 조직을 이용하는 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법.
  6. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상기 공정 (Ⅰ)을 행하기 전에, 땀샘 세포를 배지 중에 부유시킨 상태에서 배양하여, 땀샘 근상피 세포가 표면에 노출되어 있는 스피어를 형성시키는 공정을 추가로 포함하고, 상기 공정 (Ⅰ)에 있어서, 상기 세포 구조체로서 상기 스피어를 이용하는 불사화 땀샘 근상피 세포의 제조 방법.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113025661A (zh) * 2021-01-12 2021-06-25 重庆市药物种植研究所 一种永生化林麝香腺上皮细胞的构建方法
CN114181889B (zh) * 2021-11-24 2023-10-10 中国人民解放军总医院 一种原代汗腺细胞条件培养基及原代汗腺细胞培养方法

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080175828A1 (en) * 2002-02-08 2008-07-24 Freeman Thomas B Proliferated cell lines and uses thereof
JP2014503190A (ja) * 2010-11-02 2014-02-13 ヘルムホルツ−ツェントルム フュア インフェクツィオンスフォルシュンク ゲーエムベーハー 細胞不死化のための方法及びベクター

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AT321680B (de) * 1973-10-29 1975-04-10 Voest Ag Dreiwalzenbiegemaschine
DE69623109T2 (de) * 1996-04-19 2002-12-12 Nestle Sa Menschliche immortalisierte Colon-Epithelialzellen
CN100575481C (zh) * 2006-09-20 2009-12-30 中国人民解放军第三军医大学第三附属医院 一种人外泌汗腺上皮细胞培养方法
US20160075995A1 (en) 2014-09-17 2016-03-17 Krzysztof Kobielak Sweat gland-derived stem cells and methods of use

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20080175828A1 (en) * 2002-02-08 2008-07-24 Freeman Thomas B Proliferated cell lines and uses thereof
JP2014503190A (ja) * 2010-11-02 2014-02-13 ヘルムホルツ−ツェントルム フュア インフェクツィオンスフォルシュンク ゲーエムベーハー 細胞不死化のための方法及びベクター

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Catherine M. LEE et al., "NCL-SG3: a human eccrine sweat gland cell line that retains the capacity for transepithelial ion transport" , Journal of Cell Science, vol. 92, published in 1989, pp.241-249.
Cell Structure and Function. 2014, vol. 39, pages 101-112.
Nature Protocols. 2013, vol. 8, no. 12, pages 2471-2482. *

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