KR102317328B1

KR102317328B1 - 항암 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포의 세포 생존능을 향상시키는 방법

Info

Publication number: KR102317328B1
Application number: KR1020210037660A
Authority: KR
Inventors: 라정찬; 김은영
Original assignee: 주식회사 네이처셀; 주식회사 알바이오; 라정찬
Priority date: 2019-12-13
Filing date: 2021-03-24
Publication date: 2021-10-26
Also published as: WO2021118325A1; KR20210075911A; KR102233568B1; US20230016479A1

Abstract

본 발명은 세포 생존능이 향상된 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 항암 바이러스가 도입된 줄기세포의 보관방법 및 상기 방법으로 제조된 항암 바이러스가 도입된 줄기세포를 함유하는 암 치료용 세포치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 중간엽 줄기세포에 항암 바이러스를 도입한 다음 아스피린 처리를 통해 항암 바이러스의 감염 효율의 증가, 복제시간의 연장 및 바이러스가 줄기세포를 용해시키는 것을 방지함으로써, 줄기세포의 생존능 및 생존기간이 향상된 활성이 우수한 항암 줄기세포를 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 항암 줄기세포치료제는 아스피린 처리로 인해 냉장보존 시 높은 생존율을 유지하므로 의학 및 산업적으로 매우 유용하다.

Description

항암 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포의 세포 생존능을 향상시키는 방법 {Method for Improved Cell Viability of Mesenchymal Stem Cells Infected Oncolytic-Virus}

본 발명은 세포 생존능이 향상된 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 제조방법, 보관방법 및 상기 방법으로 제조된 줄기세포를 함유하는 암 치료용 세포치료제에 관한 것으로, 더욱 자세하게는 중간엽 줄기세포에 항암 바이러스를 도입한 다음 아스피린으로 처리하여 항암 바이러스의 복제시간을 연장시키고, 바이러스가 줄기세포를 용해시키는 것을 방지함으로써, 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생존 기간이 향상된 활성이 우수한 항암 줄기세포치료제의 제조에 관한 것이다.

줄기세포 (stem cell)란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, 만능 줄기세포 (totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포 (multipotent stem cell)로 분류할 수 있다.

만능 줄기세포 (totipotent stem cell)는 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있는 만능의 성질을 가진 세포로 난자와 정자의 수정 이후 8세포기까지의 세포가 이러한 성질을 가지며, 이 세포를 분리하여 자궁에 이식하면 하나의 완전한 개체로 발생해 나갈 수 있다.

전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell)는 외배엽, 중배엽, 내배엽 유래의 다양한 세포와 조직으로 발생할 수 있는 세포로서, 수정 4~5일 후 나타나는 배반포 (blastocyst)의 안쪽에 위치한 내세포괴 (inner cell mass)에서 유래하며, 이를 배아 줄기세포라 하며 다양한 다른 조직 세포로 분화되지만 새로운 생명체를 형성하지는 못한다.

다분화능 (또는 다능성) 줄기세포 (multipotent stem cell)는 이 세포가 포함되어 있는 조직 및 기관에 특이적인 세포로만 분화할 수 있는 줄기세포로서, 태아기, 신생아기 및 성체기의 각 조직 및 장기의 성장과 발달은 물론 성체조직의 항상성 유지와 조직손상시 재생을 유도하는 기능에 관여하고 있으며 조직 특이적 다능성 세포들을 총칭하여 중간엽 줄기세포라 한다.

중간엽 줄기세포 (Rebecca S. Y. Wong, et al., J Biomed Biotechnol 24:2011, 2011)는 심장 질환, 골형성 부전증 및 척수 손상과 같은 다양한 질병 상태에서 세포 기반 치료에 사용되어 왔으며, 그 결과가 주목되고 있다.

한편, "암"이란 '제어되지 않은 세포성장'으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양 (tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다. 학문적으로는 신생물 (neoplasia)이라고도 불린다.

암을 치료하기 위한 방법으로는 수술요법, 방사선 요법 및 항암제를 투여하는 화학요법 등이 있으며, 현재 종양면역요법 (cancer immunotherapy) 개발을 위해 전세계적으로 많은 연구들이 진행되고 있다. 면역체크포인트 억제제 (Immune checkpoint inhibitor)로부터 이중 특이적 T 세포 관여 항체 (Bi-specific T-cell Engager, Bite), CAR-T (Chemeric antigen receptor T-cell or NK cells), 항바이러스 (Oncolytic Virus) 등의 다양한 플랫폼을 활용하여 암정복을 위한 수많은 연구들이 수행되고 있다.

특히, 항암 바이러스 (Oncolytic virus)를 연구하는 전문가들이 주장하는 가장 큰 매력은 바로 기존 치료제와는 다르게 바이러스가 살아있다는 것이다. 이와 함께, 바이러스는 그 자체로의 유전자를 소유하기 때문에 스스로 번식할 수 있어 주사된 부위 외에 인근에 있는 암세포에까지 감염을 일으켜 파괴할 수 있다는 점이 매력이다. 물론, 임상에서 항암 바이러스가 상용화되기 위해서는 스스로 증식된 바이러스 자체가 각종 질병을 유발한다는 원인이라는 고정관념을 극복해야만 하는 큰 장애물을 넘어야 하겠지만, 암 환자에 있어 단순한 생명연장이 아닌 완치의 목적을 위해 항바이러스 (Oncolytic virus) 기술의 발전 필요성이 매우 크다.

아울러, 기존의 암 치료 방법들은 치료시 부작용이 항암 분야의 주요한 장애물이 되어 왔으며, 치료 후 재발의 위험성으로부터 자유로울 수 없다. 또한, 암으로부터 자유로울 수 없는 환경, 예를 들어 가족력이 있거나 여러 질병으로 인해 면역력이 저하된 사람에게 암을 예방할 수 있는 대안책이 필요하다.

이에, 본 발명자들은 암에만 특정하게 반응하기 때문에 부작용이 적고, 항암 효능은 우수한 항암 바이러스가 도입된 줄기세포를 이용하여 암 치료제를 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 중간엽 줄기세포에 항암 바이러스를 도입한 다음 아스피린으로 처리하면 항암 바이러스의 복제시간이 연장되고, 바이러스가 줄기세포를 용해시키는 것을 방지함으로써, 줄기세포의 생존율 및 생존 기간이 향상되어 활성이 우수한 항암 줄기세포치료제를 제조할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 목적은 항암 바이러스 (oncolytic viruses)가 도입된 중간엽 줄기세포에 아스피린 처리를 통해 항암 바이러스 (oncolytic viruses)의 복제시간은 연장시키고, 바이러스가 줄기세포를 용해시키는 것을 방지함으로써, 줄기세포의 생존능 및 생존 기간을 향상시킨 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 제조방법, 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포의 보관방법 및 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 세포치료제를 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 중간엽 줄기세포를 펠렛 (pellet) 상태로 제조하는 단계; (b) 상기 펠렛 상태의 중간엽 줄기세포에 항암 바이러스를 감염시키는 단계; (c) 상기 항암 바이러스가 감염된 중간엽 줄기세포를 원심분리하는 단계; 및 (d) 상기 항암 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 세포 생존능이 향상된 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 아스피린을 포함하는 자가혈청을 이용한 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포의 보관방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 세포치료제를 제공한다.

본 발명에 따른 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 제조방법 및 보관방법은 아스피린 처리를 통해 항암 바이러스의 감염 효율의 증가, 복제시간의 연장 및 바이러스가 줄기세포를 용해시키는 것을 방지함으로써, 줄기세포의 생존능 및 생존기간이 향상된 활성이 우수한 항암 줄기세포를 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 항암 줄기세포치료제는 아스피린 처리로 인해 냉장보존 시 높은 생존율을 유지하므로 의학 및 산업적으로 매우 유용하다.

도 1a는 지방 유래 줄기세포에 홍역 바이러스 감염 후 MVeGFP를 FITC 형광으로 확인한 형광 현미경 사진이다.
도 1b는 지방 유래 줄기세포에 홍역 바이러스 감염 후 전자 현미경으로 확인한 결과이다 (화살표: 줄기세포 안의 홍역바이러스).
도 2는 암 세포주에서 CD46, CD150, nectin-4 발현을 FACS로 확인한 것이다.
도 3은 암 세포주 및 줄기세포에서의 MVeGFP 사멸능력을 CPE (cytopathic effect) assay로 확인한 것이다.
도 4는 1000TCID50/ml의 유방암 세포주에서 MVeGFP 사멸 능력을 CPE assay로 확인한 것이다.
도 5는 MCF7 유방암 세포주에 MVeGFP를 감염시켜 FACS로 감염정도를 정량한 것이다.
도 6은 플라스크 및 펠렛 상태의 세포에서 홍역 바이러스 감염을 CPE 정도로 확인한 것이다.
도 7은 펠렛 상태의 세포에서 홍역 바이러스 감염 시간 및 농도를 다르게 한 후 CPE 정도로 확인한 것이다.
도 8a는 홍역 바이러스 감염 후 배양하지 않은 바이로스템의 생존율을 확인한 것이다.
도 8b는 홍역 바이러스 감염 후 4일 동안 배양한 바이로스템의 생존율을 확인한 것이다.
도 9a는 30% 자가혈청이 포함된 생리식염수에 아스피린을 농도별로 처리한 다음 냉장보관하여 바이로스템의 생존율을 확인한 것이다.
도 9b는 30% 자가혈청이 포함된 생리식염수에 50㎍/ml 농도의 아스피린을 처리한 다음 3일간 냉장보관하여 바이로스템의 생존율을 각각의 대조군과 비교한 것이다.
도 10은 아스피린이 포함된 자가혈청으로 바이로스템을 80시간가지 냉장보관한 다음 형광 현미경으로 바이로스템의 생존율을 확인하고, 각각의 대조군과 비교한 것이다.
도 11은 바이로스템의 유효기간을 qPCR로 확인한 것이다.
도 12는 전이성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)에 대한 아스피린 처리된 바이로스템의 항암 효과를 확인한 것이다.

다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.

본 발명에서는 중간엽 줄기세포에 항암 바이러스를 도입한 다음 아스피린으로 처리하여 항암 바이러스의 복제시간 (replication time)을 연장시키고, 바이러스가 줄기세포를 용해시키는 것을 방지함으로써, 항암 바이러스가 감염된 중간엽 줄기세포의 생존율 및 생존기간을 향상시켜 활성이 우수하고, 냉장보관 기간이 증가된 항암 줄기세포치료제를 제조하였다. 이에, 본 발명의 방법으로 제조된 홍역 바이러스가 감염된 줄기세포는 냉장상태에서 80% 생존율을 나타내는 기간이 80시간까지 증가된 것을 확인하였다.

따라서, 본 발명은 일관점에서, (a) 중간엽 줄기세포를 펠렛 (pellet) 상태로 제조하는 단계; (b) 상기 펠렛 상태의 중간엽 줄기세포에 항암 바이러스를 감염시키는 단계; (c) 상기 항암 바이러스가 감염된 중간엽 줄기세포를 원심분리하는 단계; 및 (d) 상기 항암 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계를 포함하는 세포 생존능이 향상된 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 중간엽 줄기세포는 아스피린을 함유하는 배지에서 배양된 것이 바람직하며, 상기 아스피린의 농도는 0.1mM 내지 1mM인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 아스피린을 함유하는 배지는 비타민 C를 추가로 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 5~10% FBS 및 NAC (N-acetyl Cystein)을 함유하는 DMEM 또는 K-SFM인 것이 바람직하며, 추가로 칼슘, rEGF, 인슐린 및 하이드로코티손을 함유하는 것이 더욱 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (a) 단계의 중간엽 줄기세포는 비타민 C로 전처리된 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 비타민 C 함유 배지에서 배양된 지방 유래 중간엽 줄기세포를 아스피린을 함유하는 배지에서 배양하여, 개선된 암세포 증식 억제능을 가지는 중간엽 줄기세포를 제조하였다. 즉, 비타민 C를 전처리하여 배양한 지방 유래 중간엽 줄기세포를 아스피린을 함유하는 배지에서 배양하여 제조된 항암 기능을 가지는 줄기세포일 수 있으며, 비타민 C와 아스피린을 함께 함유하는 배지에서 지방 유래 중간엽 줄기세포를 배양하여 제조된 항암 기능을 가지는 줄기세포일 수 있으며, 또한, 비타민 C를 전처리하여 배양한 지방 유래 중간엽 줄기세포를 비타민 C와 아스피린을 함께 함유하는 배지에서 배양하여 제조된 항암 기능을 가지는 줄기세포일 수 있다. 본 발명자들은 이러한 세포를 모두 "Angel-Stem Cell" (WO/2018/021879)로 명명하였다.

본 발명의 일 실시예에서는 상기 줄기세포의 펠렛 상태 및 플라스크 상태에서의 항암 바이러스 감염 정도를 분석하였으며, 펠렛 상태의 줄기세포에서 홍역 바이러스 감염 정도가 우수한 것을 확인하였다.

특히, 감염 정도를 높이기 위해서는 홍역 바이러스를 감염시킨 줄기세포를 원심분리하여 물리적 변화를 주는 것이 바람직하다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 중간엽 줄기세포는 1 x 10⁵~ 1 x 10⁶ 세포인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는　　1 x 10⁵~ 3 x 10⁵ 세포인 것이며, 가장 바람직하게는 2 x 10⁵세포인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 중간엽 줄기세포는 지방, 자궁, 골수, 근육, 태반, 제대혈, 소변, 모낭 및 피부로 구성된 군에서 선택된 조직 유래인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "줄기세포(stem cell)"이란 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말하며, "성체 줄기세포"는 발생과정이 진행되어 배아의 각 장기가 형성되는 단계 혹은 성체단계에서 나타나는 줄기세포를 의미한다.

본 발명에서 사용하는 용어 "중간엽 줄기세포"는 인간 또는 포유류의 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 줄기세포로서, 다양한 조직에서 유래할 수 있다. 특히, 제대 유래 중간엽 줄기세포, 제대혈 유래 중간엽 줄기세포, 골수 유래 중간엽 줄기세포, 지방 유래 중간엽 줄기세포, 근육 유래 중간엽 줄기세포, 신경 유래 중간엽 줄기세포, 피부 유래 중간엽 줄기세포, 양막 유래 중간엽 줄기세포 및 태반 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으며, 각 조직에서 줄기세포를 분리하는 기술은 당해 업계에 이미 공지되어 있다.

본 발명에서 사용하는 용어 "지방 유래 줄기세포"란 지방조직에서 분리해 낸 미분화 줄기세포로, 그 분리 방법은 예를 들어 다음과 같을 수 있다. 즉, 지방흡입술로부터 얻어지는 생리 식염수에 부유된 지방 함유 suspension을 배양한 다음, 플라스크 등 배양용기에 부착된 줄기세포 층을 트립신으로 처리한 다음 회수하거나, 스크래퍼로 긁어서 소량의 생리 식염수에 부유되는 것을 직접 회수하거나 하는 방법 등을 통해 지방 유래 중간엽 줄기세포를 분리할 수 있다.

이러한, "지방 조직 유래 성체 줄기세포" 또는 "지방 조직 유래 중간엽 줄기세포"는 지방 조직으로부터 분리해 낸 미분화된 성체 줄기세포로서, 본 명세서에서는 축약하여 "지방 줄기세포"라고 지칭하기도 한다. 이는 당업계에 공지된 통상의 방법을 통해 수득할 수 있다.

상기 지방 줄기세포의 획득에 사용되는 배지로서는 당업계에서 줄기세포 배양에 적합하다고 알려져 있는 통상적인 배지를 사용할 수 있는데, 바람직하게는 DMEM (Dulbecco's modified Eagle medium) 또는 Keratinocyte-SFM (Keratinocyte serum free medium)을 사용할 수 있으며, IMDM (Iscove's Modified Dulbecco's Medium), a-MEM (Alpha Modification of Eagle's Medium), F12 (Nutrient Mixture F-12) 및 DMEM/F12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12) 배지를 혼합한 배지도 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

지방 줄기세포 배양용 배지는 지방 줄기세포의 미분화된 표현형의 증식을 촉진하면서 분화는 억제하는 첨가제로 보충될 수 있다. 또한, 배지는 일반적으로, 등장액 중의 중성 완충제(예컨대 인산염 및/또는 고농도 중탄산염) 및 단백질 영양분(예를 들면 혈청, 예컨대 FBS, 혈청 대체물, 알부민, 또는 필수 아미노산 및 비필수 아미노산, 예컨대 글루타민)을 함유할 수 있다. 나아가, 지질(지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물) 및 이 종류의 대부분의 보존액 배지에서 발견되는 기타 성분(예컨대 인슐린 또는 트랜스페린, 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의 이온화 형태 또는 염인 당원, 예컨대 글루코스, 셀레늄, 글루코코르티코이드, 예컨대 히드로코르티존 및/또는 환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올)을 함유할 수 있다.

또한, 배지는 세포가 서로 유착하거나, 용기벽에 유착하거나, 너무 큰 다발을 형성하는 것을 방지할 목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이 판매하는 것들(Cat # 0010057AE)을 포함하는 것이 유익할 수 있다.

특히, 본 발명의 일 구체예에서 사용되는 지방 줄기세포를 수득 또는 배양하기 위한 배지는 DMEM, Defined Keratinocyte-SFM, α-MEM, IMDM, F12 및 DMEM/F12로 구성된 군에서 선택되는 기본 배지, L-아스코르브산 2-인산 (비타민 C), 우태아혈청 및 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine)을 함유하는 중간엽 줄기세포 배양을 위한 배지 조성물에 아스피린을 함유하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 배지는 0.05~1 mM의 아스코르브산 2-인산, 2~20% 우태아혈청, 0.2~20mM의 N-아세틸-L-시스테인(N-acetyl-L-cysteine) 및 0.1 내지 1mM 아스피린을 함유하는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 항암 바이러스는 홍역 바이러스 (measles virus)인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 MV (Edmonston strain)인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

홍역 바이러스는 악성 종양 (Msaouel P et al., Curr Pharm Biotechnol. 13(9):1732-41, 2012), CSC (cancer stem cell) (Fang Huang et al., World J Gastroenterol. 22(35):7999-8009, 2016), 폐암 (Zhao D et al., Oncol Rep. 29(1):199-204, 2013; Ong HT et al., J Hepatol. 59(5):999-1006, 2013), 혈액종양 (D Grote et al., Blood. 97(12):3746-54, 2001), 난소암 (Zhou S et al., Cancer Lett. 318(1):14-25, 2012), 골수종 (Peng KW, et al. Blood. 98(7):2002-2007, 2001), 유방암 (McDonald CJ et al., Breast Cancer Res Treat. 99(2):177-84, 2006), 뇌암 (Phuong LK, et al., Cancer Res. 63(10):2462-2469, 2003), 직장 결장 선암 (Nicolas Boisgerault et al., Biomed Res Int. 11, 2013), 골육종 (Evidio Domingo Musibay et al., Cancer Gene Ther. 21(11): 483-490, 2014)에 항암효능이 있다고 알려져 있다. 이러한 항암 바이러스를 태운 줄기세포가 암에 특정하게 반응하기 때문에 부작용은 줄어들고 항암 효능은 증가되는 효과를 유도할 수 있으며, 또한 최종 목표인 건강 수명 연장에도 그 역할을 할 수 있을 것이라 생각한다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 항암 바이러스는 약독화 홍역백신 바이러스인 것을 특징으로 할 수 있다. 상기 약독화 바이러스는 상용화된 것을 사용할 수도 있으며, 야생형 바이러스 또는 상용화된 약독화 바이러스를 약독화 및 추가 약독화시켜 사용할 수도 있다.

본 발명의 일 실시예에서는, GFP가 tagging된 홍역 바이러스인 MVeGFP를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 항암 바이러스는 1 x 10⁵~ 1 x 10⁷ TCID50인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 1 x 10⁵~ 5 x 10⁶ TCID50인 것이고, 가장 바람직하게는 1 x 10⁶ TCID50인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계의 감염은 36~37℃에서 30분~2시간 동안 수행되는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30분인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 (c) 단계의 항암 바이러스가 감염된 중간엽 줄기세포에 추가로 아스피린을 처리하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 자가혈청이 포함된 부형제에 아스피린을 첨가하여 처리하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서, 아스피린의 농도는 10㎍/ml 내지 100㎍/ml로 처리하였으며, 가장 효과가 좋은 농도는 50㎍/ml 농도의 아스피린이다. 상기 아스피린은 자가혈청이 포함된 부형제에서 처리하였다.

상기 자가혈청의 함량은 10% 내지 50%인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30% 자가혈청인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 부형제는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 본 발명의 일 실시예에서는 생리식염수를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 아스피린의 처리는 냉장상태로 처리하는 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 0.1~10℃에서 수행하는 것이며, 가장 바람직하게는 4℃에서 수행하는 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

일반적으로 중간엽 줄기세포에 홍역 바이러스를 1.0 MOI로 감염시킬 경우, 바이러스 감염된 중간엽 줄기세포의 생존율이 80% 이상인 시간은 48시간에 불과하다 (Mader EK et al., Clin Cancer Res. 1;15(23):7246-55, 2009). 하지만, 본 발명의 홍역 바이러스가 감염된 줄기세포에 아스피린을 처리를 할 경우, 중간엽 줄기세포의 생존율이 80% 이상인 시간이 80시간 이상으로 증가하였다.

본 발명의 일 실시예에서는, 항암 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포인 "바이로스템"의 세포 생존율을 감염 직후와 배양 후에 확인하였다. 그 결과, 바이로스템의 세포 생존율은 추가 배양하지 않는 것이 더 우수하였다.

따라서, 본 발명에 있어서, 상기 (d) 단계의 중간엽 줄기세포는 항암 바이러스가 도입된 후 추가로 배양을 하지 않는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 방법으로 제조된 "항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포"는 아스피린 및 자가혈청이 포함된 조성물로 보관 및 처리를 동시에 수행할 수 있으며, 80시간까지 항암 활성이 우수하다, 따라서, 이렇게 제조된 세포치료제는 추가 배양 또는 다른 추가의 조작 없이 바로 환자에 직접 투여가 가능하다.

본 발명은 다른 관점에서, 아스피린을 포함하는 자가혈청을 이용한 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포의 보관방법에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 상기 아스피린을 포함하는 자가혈청은 추가로 부형제를 포함하는 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 부형제는 생리식염수, 하트만-D 용액 및 PBS로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이 바람직하며, 본 발명의 일 실시예에서는 생리식염수를 사용하였다.

본 발명에 있어서, 상기 아스피린의 농도는 10㎍/ml 내지 100㎍/ml인 것이 바람직하나, 더욱 바람직하게는 50㎍/ml 농도인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 상기 자가혈청의 함량은 10% 내지 50%인 것이 바람직하며, 더욱 바람직하게는 30% 자가혈청인 것이나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 또 다른 관점에서, 상기 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 세포치료제에 관한 것이다.

일반적으로 중간엽 줄기세포에 홍역 바이러스를 1.0 MOI로 감염시킬 경우, 바이러스 감염된 중간엽 줄기세포의 생존율이 80% 이상인 시간은 48시간에 불과하다 (Mader EK et al., Clin Cancer Res. 1;15(23):7246-55, 2009). 즉, 바이러스가 줄기세포를 용해시키기 때문에 바이러스가 감염된 줄기세포의 생존기간이 짧다. 이런 이유로 항암 바이러스에 감염된 줄기세포를 세포치료제로 완제품하여 제품화하는 것이 불가능하다.

하지만, 본 발명의 홍역 바이러스가 감염된 줄기세포에 아스피린을 처리할 경우, 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 생존율이 80% 이상인 시간이 80시간 이상으로 증가하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 제조된 항암 줄기세포치료제는 실질적 제품형태로 투여가 가능하다.

특히, 본 발명의 항암 줄기세포치료제는 펠렛 상태의 줄기세포에 항암 바이러스를 감염시켜 원심분리한 다음, 추가로 배양 단계를 거치지 않고 제품화할 수 있다. 즉, 아스피린 및 자가혈청이 포함된 조성물로 보관 및 처리를 동시에 수행할 수 있으며, 80시간까지 항암 활성이 우수하므로, 이렇게 제조된 세포치료제는 추가 배양 또는 다른 추가의 조작 없이 바로 환자에 직접 투여가 가능하다.

본 발명에 있어서, 상기 암은 폐암, 혈액종양. 난소암, 골수종, 유방암, 뇌암, 직장암, 결장암, 직결장 선암, 골육종 또는 암줄기세포인 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 실시예에서는 유방암 세포에서 항암 바이러스의 항암 효과가 우수하였으며, 에스트로겐 의존성 유방암 세포주 (MCF-7) 및 에스트로겐 비의존성 유방암 세포주 (MDA-MB-231) 모두 효과가 동일하였다.

"암"이란 제어되지 않은 세포성장으로 특징지어지며, 이러한 비정상적인 세포성장에 의해 종양(tumor)이라고 불리는 세포 덩어리가 형성되어 주위의 조직으로 침투하고 심한 경우에는 신체의 다른 기관으로 전이되기도 한다.

"항암"이라는 용어는 암 질환의 치료 즉, 암세포 또는 암줄기세포의 증식을 억제하거나 암세포 또는 암줄기세포를 죽이는 것뿐만 아니라, 암 질환의 예방, 즉 암 발병 이전에 암에 대한 저항력을 높이는 것도 함께 포함하는 것으로 해석된다. 따라서, 본 명세서에서 "암 예방 또는 치료" 또는 "암의 증식 억제"라는 용어와 '항암'이라는 용어는 혼재하여 사용되었다.

본 발명에 있어서, "암세포"는 정상세포의 증식 및 생장기전에 유전적인 변형으로 인해 비정상적인 세포생장을 하며, 전이라고 지칭할 수 있는 공격적인 타 기관 이동성을 지니는 세포를 포함한다. 또한, "암줄기세포"는 종양 내 존재하는 것으로 알려져 있으며 정상 줄기세포의 유전적인 정보의 비정상적인 전이로 인해 발생하는 것으로 생각되고 있다. 암줄기세포는 그들이 생존하기 위한 미세환경, 니쉬(niche)의 존재로 인해 유지, 증식되며 주변에 존재하는 정상 세포, 면역관련 세포 또는 분화된 암세포가 이들 특성 유지와 증식에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다.

본 발명에서 용어 "세포치료제 주사제품" 또는 "세포치료제"란 조직의 결함을 치료하기 위해 줄기세포를 함유하여 비경구투여, 즉 주사의 형태로 결함부위 또는 그 인접부위에 주사되어, 결함을 교정할 수 있는 약학 조성물을 의미한다.

"치료하는"이란 용어는, 달리 언급되지 않는 한, 상기 용어가 적용되는 질환 또는 질병, 또는 상기 질환 또는 질병의 하나 이상의 증상을 역전시키거나, 완화시키거나, 그 진행을 억제하거나, 또는 예방하는 것을 의미한다.

본원에서 사용된 바와 같이, "치료"란 용어는 "치료하는"이 상기와 같이 정의될 때 치료하는 행위를 말한다.

따라서, 포유 동물에 있어서 암의 "치료" 또는 "치료요법"은 하기의 하나 이상을 포함한다:

(1) 암의 성장을 저해함, 즉, 그 발달을 저지시킴,

(2) 암의 확산을 예방함, 즉, 전이를 예방함,

(3) 암을 경감시킴, 즉, 암의 퇴행을 야기시킴,

(4) 암의 재발을 예방함, 및

(5) 암의 증상을 완화함(palliating).

암은 수술, 방사선 및 화학요법으로 치료를 하더라도 많은 경우에 근본적인 치유가 되지 못하고 환자에게 고통을 주며 궁극적으로는 죽음에 이르게 하는 난치성 만성질환이다. 지난 수십 년간의 수술요법, 화학요법(항암제치료), 방사선요법 등은 많은 발전에도 불구하고 암에 대한 궁극적인 해결책이 되지 못하고 있다.

본 발명에서는 중간엽 줄기세포에 항암바이러스를 감염 환경, 시간 및 농도를 조절하여 항암바이러스가 줄기세포에 안전하고 효과적으로 도입되고, 잠복시간은 연장시키고, 바이러스에 의한 줄기세포의 용해를 방지함으로써, 중간엽 줄기세포의 생존능 및 생존기간이 향상된 항암 효능을 가지는 항암 줄기세포를 제조할 수 있고, 이렇게 제조된 항암줄기세포치료제는 아스피린을 이용하여 냉장보존 기간 중 현저히 높은 생존율을 유지하는 장점이 있다.

또한, 약독화 홍역 바이러스를 줄기세포에 감염시켜 아스피린을 처리함으로써 바이러스 복제시간을 연장시키고, 바이러스가 줄기세포를 용해시키는 것을 억제하였다. 따라서, 본 발명의 방법으로 제조된 홍역 바이러스가 감염된 줄기세포는 80% 생존율을 나타내는 기간이 80시간 이상으로 현저히 증가되어, 실질적 줄기세포치료제 제품형태로 투여가 가능하다. 이러한 항암 바이러스와 줄기세포를 접목시킨 항암 줄기세포치료제를 본 발명자들은 "바이로스템 (ViroSTEM)"이라고 명명하였다.

[실시예]

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 이에 의해 본 발명의 기술적 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 인간 지방조직 유래 중간엽 줄기세포의 분리 및 배양

지방흡입술(Liposuction)에 의해 복부지방으로부터 얻어진 인간 지방조직을 분리하여 PBS로 세척하였다. 조직을 잘게 자른 후 collagenase type1 (1mg/ml)을 첨가한 DMEM 배지를 이용하여 37℃에서 2시간 동안 digestion하였다. PBS로 세척 후 1000rpm에서 5분간 원심분리 하였다. 상층액은 suction하고 바닥에 남은 펠렛은 PBS로 세척한 후, 1000rpm으로 5분간 원심분리하였다. 100㎛ mesh에 필터링하여 debris를 제거하고 PBS로 세척한 후, 10% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid를 함유하는 DMEM 배지에 배양하였다.

하룻밤 지난 후 부착되지 않은 세포들은 PBS로 세척하고, RKCM-N 배지인 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5ng/ml rEGF, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM 배지를 2일마다 교체하면서 계대배양하여 지방조직 유래 다분화능 중간엽 줄기세포를 분리하였다.

상기와 같이 분리한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 비타민 C를 함유하는 배지에서 배양한 줄기세포로, 즉 비타민 C 전처리 중간엽 줄기세포이다.

실시예 2: 아스피린 함유 배지에서 중간엽 줄기세포의 배양

실시예 1의 비타민 C를 함유하는 배지에서 배양한 줄기세포를 96-웰 세포배양 플레이트에 1x10⁴ cells/plate 농도로 접종한 후, 하룻밤 배양하여 부착 및 안정화시킨다. 그 다음, RKCM-N 배지인 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM ascorbic acid, 0.09mM calcium, 5ng/ml rEGF, 5㎍/ml 인슐린 및 74ng/ml Hydrocortisone를 함유한 Keratinocyte-SFM에 아스피린을 0.5mM의 농도로 첨가한 배지로 교환 후, 24시간 동안 배양하였다.

상기와 같이 배양하여 수득한 지방조직 유래 중간엽 줄기세포는 Angel-Stem Cell (WO/2018/021879)로 명명하였으며, 암세포와의 직접 공배양 및 간접 공배양을 통해 항암 효과가 우수한 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 줄기세포에 홍역 바이러스 감염 확인

실시예 1 또는 실시예 2에서 분리한 지방 유래 줄기세포에 MVeGFP (GFP가 tagging된 홍역 바이러스)의 감염을 확인하였다. Limanis사에서 판매하는 Measles-GFP를 구매한 후 MVeGFP를 증폭하고 titer를 계산하여 MVeGFP를 정량하고, 본 발명의 배양 field에 맞는 증폭 방법 및 titer 확인 방법을 구축하였다

구체적으로 살펴보면, 펠렛 (Pellet) 또는 플라스크 (flask) 상태의 지방 유래 줄기세포 (2X10⁵ 세포)에 홍역백신 바이러스(10⁶ TCID50)를 37℃에서 30분마다 gently shake 하면서 감염시켰다. 37℃에서 배양하여 얻어진 홍역백신 바이러스의 줄기세포 감염여부를 형광 현미경과 전자 현미경으로 확인하였다 (도 1a 및 1b).

실시예 4: 암 세포주에서 홍역 바이러스의 사멸 능력 확인

다양한 암 세포주에서 홍역 바이러스의 사멸 능력은 CD46, CD150, nectin-4로 측정할 수 있다. 3개의 표면 마커의 발현이 있으면 홍역 바이러스로 인한 사멸 능력이 높아진다고 간접적으로 확인할 수 있으므로, FACS assay로 각 암 세포주의 표면 마커를 확인하였다 (도 2).

그 다음, CPE (cytopathic effect)로 암세포 사멸을 확인하였다 (도 3). CPE는 암세포를 24-well plate에 2X10⁵ cells/well로 도말한 다음 TCIE50 홍역 바이러스로 2시간 동안 감염시킨 후, 바이러스 접종물을 제거하였다. 세포 배양배지 1ml을 추가하여 96시간 동안 감염시킨 다음 PBS로 2회 세척하고, 남아있는 세포를 4% 포름알데하이드로 10분간 상온에서 고정하였다. 다시 PBS로 세척 후, 0.1% crystal violet solubilized in 2% EtOH-DW로 염색하고 DW로 2회 세척한 다음 air dry하고 사진 촬영하였다.

암 세포주에 MVeGFP를 감염시켜 항암효과 확률이 높은 암 세포주로 유방암 세포주를 선정하고, 1000TCID50/ml에서의 유방암 세포주 (MCF-7: 에스트로겐 의존성 세포주 및 MDA-MB-231: 에스트로겐 비의존성 세포주) CPE로 MVeGFP의 유방암 사멸 능력을 확인하였다 (도 4). 그 결과, 1000TCID50/ml로 진행하였을 때 양성 대조군은 2일차부터 CPE를 나타내고 3일차에 거의 80% 이상이 CPE를 형성하였고, MCF-7 및 MDA-MB-231 모두 3일차부터 CPE를 형성하기 시작하였다.

또한, 유방암세포에 MVeGFP를 감염시켜 감염정도를 정량적으로 확인할 수 있는 방법을 FACS assay로 구축하였다 (도 5).

실시예 5: 바이로스템의 감염 스펙 확인

실시예 3에서 제조한 홍역 바이러스가 도입된 줄기세포를 "바이로스템 (ViroSTEM)"으로 명명하였다. 홍역 바이러스는 홍역백신 바이러스를 사용하거나, 홍역백신 바이러스를 다시 한번 약독화시킨 다음 사용하였다.

사람에서 안전한 홍역백신 바이러스 및 줄기세포 수 (Myo clinic의 세포수 및 홍역 바이러스 농도 참고)를 토대로 감염 환경, 감염 시간 및 농도 시험을 통해 바이로스템 (ViroSTEM)의 감염 스펙을 설정하였다 (표 1). 줄기세포에 홍역 바이러스 감염 정도를 높이고자 감염 환경을 다양하게 변화시켜 확인하였다.

먼저, 세포를 플라스크 또는 펠렛 상태에서 감염을 진행한 후, CPE 정도를 확인하였다. 그 결과, 펠렛 상태의 세포 환경에서 감염 정도가 높았으며 (도 6), 감염 후 원심분리로 물리적 변화를 주어 감염 정도를 높일 수 있었다.

그 다음 펠렛 상태의 세포 환경에서 감염 시간 및 농도를 다르게 한 후, CPE 정도를 확인하였다 (도 7). 그 결과, 중간엽 줄기세포 수는 2 x 10⁵, 홍역 바이러스 농도는 1 x 10⁶ TCID50에서 가장 감염 정도가 우수한 것을 알 수 있었다.

또한, 감염 시간을 다르게 하여 홍역 바이러스를 감염시킨 줄기세포의 생존율을 감염 직후와 감염 4일 후에 분석하였다. 그 결과, 감염 시간은 30분이 가장 효과적이였으며, 홍역 바이러스 감염 후 배양 단계를 거치지 않는 것이 감염 정도가 우수하였다 (도 8a 및 8b).

이렇게 설정된 바이로스템 (ViroSTEM)의 감염 스펙은 하기 표 1에 나타내었다.

실시예 6: 아스피린 처리에 의한 홍역 바이러스가 감염된 줄기세포의 냉장 상태에서의 생존율 및 안정성 (stability)증가

홍역 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포인 바이로스템은 아스피린 및 자가혈청 30%를 포함하는 생리식염수에서 5일간 냉장보관하면서, 10㎍/ml 내지 100㎍/ml 농도의 아스피린을 처리하였다.

그 결과, 아스피린이 전혀 처리되지 않은 대조군에 비해 아스피린이 처리된 줄기세포의 생존율이 현저히 증가한 것을 확인하였다. 아무런 처리도 하지 않은 항암 바이러스가 감염된 줄기세포는 자가혈청 30%를 포함하는 생리식염수에서 3일간 냉장보관시 세포 생존율이 28.6% 정도였으나, 홍역 바이러스가 감염된 항암 줄기세포 치료제의 자가혈청 30%를 포함하는 생리식염수에서 냉장보관시 50㎍/ml 농도의 아스피린 처리를 하면 세포 생존율은 88% 이상으로 증가하였다 (도 9a 및 9b).

이렇게 50㎍/ml 아스피린 및 30% 자가혈청을 포함하는 생리식염수에서 냉장보관한 바이로스템의 생존율 유지 기간은 80시간 이상으로 증가하였으므로, 80시간 냉장보관된 바이로스템 내의 바이러스 안정성을 확인하였다. 80시간 동안 바이로스템을 냉장보관한 다음 줄기세포를 배양한 다음 형광 현미경으로 줄기세포를 확인하였다.

그 결과, GFP가 tagging된 항암바이러스가 80시간까지 증폭되어 발현되고 있음을 확인할 수 있었다 (도 10).

다음으로, 항암 줄기세포 Angel-Stem Cell에 홍역 바이러스를 감염시킨 "바이로스템 (ViroSTEM)"의 안정성을 시험하고자, 줄기세포에 MVeGFP를 2시간 감염시킨 후 50㎍/ml 아스피린 및 자가혈청 30%를 포함하는 생리식염수에서 냉장보관하였다. 냉장 상태에서 바이로스템 내의 홍역 바이러스가 얼마나 유지되는지를 qPCR로 정량하였다.

그 결과, 자가혈청 30%를 포함하는 생리식염수에 50㎍/ml 아스피린이 포함된 경우, 바이로스템 (ViroSTEM)은 냉장 상태에서 80시간까지 바이로스템 내에서 홍역백신 바이러스가 유지되고 있는 것을 확인할 수 있었다 (도 11).

실시예 7: 아스피린 처리에 의한 홍역 바이러스가 감염된 줄기세포의 항암 효과 향상

아스피린을 처리하여 배양한 항암 줄기세포 Angel-Stem Cell에 홍역 바이러스를 감염시킨 "바이로스템 (ViroSTEM)"의 항암효과를 확인하였다.

다양한 암세포 또는 암줄기세포가 각각 부착 배양된 세포배양 접시에 "아스피린이 처리된 바이로스템 (ViroSTEM)"을 추가 접종하여 암세포에 대한 "바이로스템 (ViroSTEM)"의 항암 효과를 확인하였다. 아스피린이 처리된 바이로스템을 접종한 전이성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)를 PKH67 Fluorescent Cell Linker Kits (SIGMA MIDI67)를 이용하여 염색하였다.

그 결과, 아스피린이 처리된 바이로스템의 전이성 유방암 세포주 (MDA-MB-231)에 대한 우수한 항암 효과를 확인할 수 있었다 (도 12).

이상으로 본 발명의 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시예일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다. 본 발명의 단순한 변형 내지 변경은 이 분야의 통상의 지식을 가진 자에 의하여 용이하게 이용될 수 있으며, 이러한 변형이나 변경은 모두 본 발명의 영역에 포함되는 것으로 볼 수 있다.

Claims

아스피린을 포함하는 자가혈청을 이용한 하기 방법으로 제조된 세포 생존능이 향상된 항암 바이러스를 함유하는 중간엽 줄기세포의 보관방법;
(a) 중간엽 줄기세포를 펠렛 (pellet) 상태로 제조하는 단계;
(b) 상기 펠렛 상태의 중간엽 줄기세포에 홍역 바이러스(measles virus)를 감염시키는 단계;
(c) 상기 홍역 바이러스가 감염된 중간엽 줄기세포를 원심분리하는 단계; 및
(d) 상기 홍역 바이러스가 도입된 중간엽 줄기세포를 수득하는 단계.
제1항에 있어서, 상기 아스피린의 농도는 10㎍/ml 내지 100㎍/ml인 것을 특징으로 하는 보관방법.
제1항에 있어서, 상기 자가혈청의 함량은 10% 내지 50%인 것을 특징으로 하는 보관방법.
제1항에 있어서, 0.1℃ 내지 10℃에서 보관하는 것을 특징으로 하는 보관방법.