HU230661B1 - Terápiás felhasználásra szánt Wharton kocsonya eredetű mesenchymális őssejtek (WJ-MSC) enzimes előkezelés nélküli izolálása - Google Patents

Abstract

A találmány köldökzsinór eredetű mesenchymális őssejt (WJ-MSC) izolálási eljárás, amely a köldökzsinór ereinek eltávolításával, de az amnionmembrán megtartásával és így az éretlenebb sejtformák megőrzésével, morfológiájukban és funkciójukban sértetlen, terápiás alkalmazásra megfelelő minőségű és mennyiségű sejtet eredményez. A találmány tárgya olyan enzimes előkezelést nem igénylő WJ-MSC izolálási technika/eljárás, amelyre jellemző, hogy az amnionmembrán megtartásával, a köldökzsinór ereinek eltávolításával morfológiájukban és funkciójukban sértetlen, terápiás alkalmazásra megfelelő minőségű és mennyiségű sejtek kerüljenek izolálásra és fagyasztva tárolásra.

Description

I. A találmány címe:

Terápiás felhasználásra szánt Wharton kocsonya eredetű mesenehymális őssejtek (WJ-MSC) enzimes előkezelés nélküli izolálása

11« A műszaki terület pontos meghatározása, amelyre a találmány vonatkozik, a technika állásának bemutatása:

Őssejtek: Őssejteknek nevezzük azokat a sejteket, amelyek aszimmetrikus osztódásuk révén képesek egyrészt fenntartani eredeti differenciálatlan Tonnájukat, másrészt olyan utódsejteket is létrehoznak, amelyek egy vagy többféle unipotens sejtté differenciálódhatnak.

Szöveti őssejtek: A szöveti őssejtek a szervezet folyamatos megújulását biztosító muhipotens sejtformák, amelyek az egyedfejlődés során egyre csökkenő számban, de végig fellelhetőek egyes szöveteinkben, szerveinkben. Felhasználásuk, vizsgálatuk nem vet fel etikai aggályokat, jóval differenciáltabbak, mint az embrionális őssejtek totipotens, plnripotens sejtformáí,

Mesenehymális őssejtek (MSC):.....Feltételezhetően az embrió primer mesenchymájából megmaradó sejtformák, amelyek a felnőtt, szervezetben elsődlegesen a vérképzés helyén fordulnak elő nagyobb mennyiségben, ahol a vérképző őssejtek működéséhez nélkülözhetetlen mikrokörnyezetet hozzák létre, de egyéb helyen pl. zsírszövetben, perifériás vérben ts fellelhetőek. Olyan multipotens sejtformák, amelyek elsődlegesét: porc-, osont-, zsírszövet, valamint a vérképzést támogató csontvelői stomasejtekké képesek differenciálódni, de sikeresen dífferenciáltatták már - a csíralemezek által determinált korlátokat is átlépve (in váró plasztikusság) - pl. ideg-, szívizom-, harántesíkoltizorn-, máj-, vese sejtekké, valamint tnzuiintermelö bétasejtekké, Tlipoimmunogének, vagyis allogén transzplantáció esetén sern váltanak ki immunválaszt, amely feltételezhetően a CT)8Ö, CD86 felületi antigének hiányának tulajdonítható; valamint immunszupresszív hatásúak, amely hátterében feltehetően a dendriűkus sejtek érésének és antigénbemutató funkciójának gátlása, illetve a regulator T-sejtek klonális expanziójának serkentése áll. így egy beteg kezeléséhez nem kell feltétlenül a saját (autolog) őssejtje, hanem elvileg bármilyen egészséges donor MSC-je felhasználható, MSC sejteket terápiás célokra már jelenleg is nagy mennyiségben használ a regeneratív orvoslás, bár ebben az esetben a forrása elsődlegesét: a zsírszövet h

(Markov el al., 2007; Seshareddy et al., 2008; Monlanucci et al., 2011).

MSC. sejtek azonosítása: Könnyen izolálható és fenntartható, in vitro körülmények között is jói szaporítható sejtformák, amelyek legjellemzőbb tulajdonsága az adhereneia (letapadás) képessége műanyag felöletekhez. Ez a tulajdonságuk a laboratóriumi gyakorlatban jó megkülönböztető bélyeg, a nem adherens sejtekhez viszonyítva. A kitapadí sejtek először fibroblast-szerü morfológiával rendelkező sejtekből álló telepeket képeznek, majd egy összefüggő réteggé alakulnak. Ezek a tenyészetek azonban heterogének, mind morfológiailag, mind plasztícitásuk tekintetében: egyesek valóban muítípofensek, míg mások már dífíerenciáitabb sejtfonnák (Markov et al., 2007). 2006-ban a Mesenchymal and Tíssue Stem (Jeli Commíttee of the 1SCT a következő minimum kritériumokat javasolta a humán MSC sej tek azonosítására:

- adhézió a műanyag felületekhez,

- speciális felületi antigének (markerek) kifejeződése: CD .105 (endoglin receptor). Cl) 73 (SÍ 13 glikoproteinj, CD 90 (Ihy-1),

- nem hordozhatnak olyan felületi .markereket, amelyek vérképző Őssejtekre vagy vérsejt fejlődési vonalakra jellemzőek: CD 45, CD 34, CD 14, CD 19,

- multipotens differenciálódási potenciál jellemzi őket: ö? vtiro körülmények között mesoderma eredetű sejtekké (porc-, csont-, zsír- sejtekké) képesek differenciálódni.

Á felületi markerek terén azonban a mai napig nincs teljes konszenzus, hiszen csak általánosságban mondható el az MSC sejtekről, hogy mely markereket fejeznek ki és melyeket nem, de ebben igen nagy különbségek ís lehetnek (Taglüzadeh et ab, 2011),

Köldökzsinór eredetű MSC sejtek (WJ-MSC): 1656«ban Thomas Whurton figyelte meg azt a kocsonyás állományt - alapvetően kollagén, hialuronsav, proteoglikán mátrix amely olyan differenciáltság! fokú MSC sejteket tartalmaz, amelyek átmenetet képeznek az újszülött születés előtti extraembrionális pluripotens őssejtjei és az újszülött muhi potens MSC-je között (Semenov et Breymann, 2011). Bár nem pluripotens embrionális őssejtek, de kis mennyiségben kifejeznek embrionális (Tra-1-60, Tra-1-81. SSEA-1, SSEA-4) ill. pluripotens markereket (Oct-4, Sox-2, Nanog) is, így nem közönséges muhi potens sejtformák. A csontvelő ül. zsírszövet eredetű MSC sejtek nem fejeznek ki ilyen markereket, vagyis azok egy későbbi fejlődési fokot reprezentálnak, hosszabb generációs idővel, rövidebb telemerrel, és kisebb telomeráz aktivitással (Tagbizadeh et al., '2011; Ouillot et al.., 2007). Továbbá az is bizonyítási nyeri, hogy a WJ-MSC sejtek jobban szaporíthatnak laboratórium: körülmények •T <>

között (akár IÖ^}> sejtszám is elérhető), immunszupresszív hatásuk jobban érvényesül, HLA identitásuk meg kevésbé kialakult (Troyer et Weiss, .2008), ill. jobban differenciáltathatók más sejtekké (Karahuseyinoglu et al., 2007), mint a felnőtt szervezetből izolált sejtek Terápiás felhasználásuk jelenleg egyes autoimmun betegségek kezelésében (Noel et a!., 2007), köldökzsinónérrel együtt alkalmazva vérképzőszervi eredetű leukémiák, anémiák kezelésében, valamint csontvelő- tik szer vtranszpkintál raknál jelentkező GVHD reakció megelőzésében, kezelésében bizonyait hatékonynak, A jelenleg elfogadott álláspont szerint, a beültetett MSC őssejtek kedvező élettani hatásai nem a szöveti integrációjuknak köszönhető, hanem az általuk termelt írofikus, amiapoptoúkus, endogén regenerációt segítő és immunmodttláló faktoroknak (Noort et al., 2002; Cardoso et. ah, 2012),

WJ-MSC sejtek izolálást módszereinek áttekintése (Seshareddy et ah, 2008; Salehinejad et al.. 2012; Anzalone et ab, 2011; Koliakos et ak, 2011; Wuug et ah, 2004; Montanucci ei al.. 2011)

Á WJ-MSC sejtek köldökzsinórból történő izolálására jelenleg nines standard eljárás. Az egyes módszerek mintaigénye többnyire azonos: friss (max. 24 órával korábban gyűjtött), 510 cm-es köldökzsinór darabból indulnak ki, amelyet az izolálás megkezdéséig foszfát pufférben vagy fiziológiás só oldatban, 4-30 °C között tárolnak. A tároló közeg kiegészítésre kerülhet penicillinnel vagy streptomyeínnel.

f Enzimes előkezelést alkalmazó seitizolálási módszerek áttekintése:

A módszer legfontosabb lépése a Wharton-kocsonya kollagén, hiaiuronsav, proteoglíkán aíapáiíományának prateoiíükus enzimekkel történő emésztése, amely arra a feltételezésre épül, hogy a kezelést követő eentrifugálással és szűréssel a mesenchymáiís sejtek könnyebben és nagyobb mennyiségben vonhatóak ki a szövetből. Az emésztés ideje meglehetősen tág intervallumban mozoghat - 30 pere és egy éjszakás kezelés között-, az alkalmazott enzimkoncentrációk függvényében.

Gyakori enzimek, enzímkoktélok:

* koiiagenáz * koiiagenáz - hialuronidáz - tripszín • koiiagenáz - tripszin • koiiagenáz; - hialuronidáz - díszpáz - tripszín - pronáz

Mintaelőkészüés általános gyakorlata ~ enzimes előkezelés módszer:

A köldökzsinór minta enzimes kezelést megelőző előkészítése többnyire csak a minta nagyobb darabokra történő feldarabolásai jelenti, ami általában nem jár együtt a véredények eltávolításával. Néhány esetben arra is találunk példát, hogy a véredények eltávolítása után a szikével kikapart Wharíon-koesonya enzimes feltárása zajlik, amit egy trípszínes (vagy trípszin - EDTA) kezelés, majd a trípszin leállítása követ a későbbi tenyésztéshez is használt közeggel. Az emésztett szövetdarabok tenyesztőközegbe kerülnek, további 4-5 napra, majd ebből az oldatból történik a sejtek kinyerése eentriíugatással, szűréssel, fia a véredények nem kerülnek eltávolításra, akkor a maradék vér, íll. az erek endothel sejtjeinek zavaró hatása miatt sokkal inhomogénebb sejtkultúra nyerhető, ami további tisztítást fog igényelni (Sernenov et öreymann, 2(51i).

Az enzimes módszerekkel szemben általánosságban megfogalmazott legfőbb kritika azonban az, hogy számolni kell a túiemésztés lehetőségével, amely károsíthatja a sejtek állapotát, életképességét, felületi fehérje markereiket és igy végső soron a funkciójukat (Dover et ab, 2008).

II. Nem enzimes előkezelést alkalmazó sejtizolálási módszerek áttekintése:

Az enzimes módszerek gyors kivitelezhetőségével ellentétben, meglehetősen hosszadalmas (4-5 hét) izolálási technika, amely szelektív közegben, kontrollált körülmények között zajló folyamatos ellenőrzést jelent. Óriási előnye azonban az enzimes módszerrel szemben, hogy a sejtek természetes módon („kimásznak”) kerülnek kinyerésre abból a szöveti állományból, amelyben eredetileg is jelen vannak, így a sejtek közötti kapcsolatok nem sérülitek, és a sejtek végig hozzájutnak azokhoz a faktorokhoz, amelyekre szükségük van a megfelelő fenotípus kialakításához (Troyer et Weíss, 2ÖÖ8).

A 2009-ben publikált első nem enzimes izolálást technika óta számos módszer került már kidolgozásra, amelyek az igényelt köldökzsinór darab mérete, a daraboltsúg mértéke, az izolálási folyamat időtartama szempontjából jelentős eltérést mutatnak (La Rocca et ab, 2009.) Gyakorlatilag minden kutatócsoportnak saját eljárása létezik, de jelenleg szabványos technika még nem került elfogadásra, sem kutatási céllal, sem terápiás céllal történő WJ-MSC sejtek kinyerésére. A terápiás céllal izolált sejtek esetén azonban minimum elvárásként kell megfogalmazódnia a sejtek morfológiai és funkcionális sértetlenségének.

Miniaelőkéssdtés általános gyakorlata- nem enzimes módszer (Venugopal el al., 2011):

I, Hosszanti vágás: a köldökzsinór minta 5-10 em-es darabja hosszában kerül felnyitásra, majd keresztben újabb metszéseket ejtenek rajta, így segítve elő, hogy a műanyag felülettel nagyobb területen kerülhessen közvetlen kontaktusba a megfelelő izoláló közegben.

11. Apró darabokra vágás: a minta kb, 5 cm~es darabját ügy dolgozzák fel, hogy felnyitják, majd a Wharton-koesonyát szikével leválasztják a borító amnionbómról, a vérerekről, majd kb, 1-3 mnrí~es darabokra aprítják. A véredények nem minden esetben kerülnek az aprítás előtt eltávolításra, arra hivatkozva, hogy az érfalak közvetlen környezetében olyan már differenciálódott őssejt alakok vannak, amelyek az erek eltávolításával elvesznének (Troyer et Weíss, 2008).

Leggyakrabban használt tápközegek enzimes és nem enzimes módszerek esetén t'Salehlneíad et al., 2012; Venugopal et ah, 2011):

* Dulbeceo’s modiíied Eagle’s médium (DMEM) 15% FBS, 2 mM L-glutamin. 0,?% antibiotikumos-antímikotikumos oldat * DMEM-F12 r 12% (v/v) FBS, penicillin (löOlJ/ml), streptomyein (100pg/ml), amphoteríein B (2,5pg/mi) * DMEM-K.0 4500 mg/ mL glükóz, 2 mM L-glutamin -r 10% FBS

Az Izolálás COj inkubátorban (37 °C, 85%' nedvességtartalom, 5% CO?) többnyire 4-6 hétig tart. Amennyiben a raesenehymális sejtek tenyésztése a cél, akkor az időtartam tovább növekszik újabb 4-6 héttel,

Π1, A találmánnyal megoldandó feladat megjelölése:

A WJ-MSC izolálás! folyamatra jelenleg még nincs standard eljárás, de a terápiás felhasználást lehetőségek folyamatos bővülése miatt folyamatos igény mutatkozik egyszerű és egyben hatékony módszerek kidoígozására.

Az általunk fejlesztett WJ-M.SC izolálás! technológia kidolgozásával, olyan terápiás felhasználásra alkalmiig - morfológiájukban és funkciójukban is sértetlen - sejteket nyerhetünk, amelyek hatékony alkalmazhatóságára (pb csontvelő átültetés után jelentkező kilökődés! folyamat kezelése) már eddig is töbh sikeres példa említhető (Transpíantatk.m

Clinics In Wroeiaw and Katowice. Poíand; részletek; w w w. fa na i cord. e n).

IV, A feladat megoldása összhangban az igénypontokkal:

A köldökzsinór Wharton kocsonyából történő MSC izolálást folyamatra eddig kidolgozott eljárások többsége enzimes feltárásra épük annak ellenére, hogy számos tanulmány bizonyítja, hogy a szövetek nem megfelelő emésztése csökkenti a sejtek életképessé géb degradálja a sejtek felületi receptorait, így károsíthatja a sejtek funkcióját, .Ennek ellenére napjainkban az enzimes kezeléssel történő izoíálási folyamatnak van a legnagyobb publicitása, elsődlegesen azért, mert az enzimek használata jelentősen lerövidíti a folyamat időigényét, másrészt meri az enzimek használatával elvileg jelentősen megnövelhető az izolált sejtek mennyisége. Összehasonlításra került azonban az enzimes és nem enzimes módszerrel nyerhető sejtek mennyisége és arra a következtetésre jutottak, hogy enzimes emésztéssel sem lehet jobb eredményt, vagyis lényegesen nagyobb sejtszámot elérni, csak abban az esetben, ha egy második tenyésztéses lépést is beiktatnak, amely 4-6 hét után eredményezhet 10⁸ - iO¹³ MSC seitszámot,

Saját példa a módszer

656 darab saját feldolgozást! köldökzsinór minta, 4-5 hetes W.I-M8C izolálása után kapott átlagos sejtszám (az első izolálást követően) 1,22.·χ·.0,48* 1Ö⁶ darab MSC sejt. Közleményekben meglelem adatokkal végzett összehasonlítás alapján elmondhatjuk, hogy az izolált sejtek mennyíssége az általunk alkalmazott módszerrel meghaladja az átlagosan közölt 10⁴ - 2* 10'b cm értéket (Montanucci et ah, 2011), A gyűjtött köldökzsinór minták között azonban lényeges különbségek lehetnek, amely tapasztalatunk szerint nem kizárólag abban nyilvánul meg, hogy egyes mintákból kevesebb sejt izolálható, hanem abban is, hogy az esetek 3%-ában sikertelen a WJ-MSC izolálás.

A köldökzsinór amnionmembránjának megtartásával lehetőség van azoknak a kevésbé diftérenciálódott, nagy piasztleitással jellemzett WJ-MSC sejteknek a kinyerésére, amelyek legnagyobb mennyiségben közvetlenül az arnmonmembrán alatt találhatóak, és amelyeknek a terápiás (elhasználása is szélesebb körben valósulhat meg, mint a már differenciálódott sejlformáké. A köldökzsinór ereinek eltávolításával a már előrehaladottabb differenciáeiöt i

mutató és így terápiás felhasználásra csak szükebb körben alkalmazható sejtformák kerülnek kizárásra. Az általunk kidolgozott módszer egyrészt az izoláló közeg összetételéből fakadóan, másrészt a darabolás folyamatos folyadék közegben, történő megvalósulása miatt, gyakorlatilag kizárja a beíertőződés lehetőségét. Az általunk kidolgozott módszer igy annyiban új a korábban kidolgozott nem enzimes izolálásokhoz képest, hogy ötvözi azokat a kutatási eredményeket, amelyek a terápiás gyakorlatban szélesebb körben alkalmazható WJMSC preparátumok előállítása felé mutatnak,

A második un. tisztítási lépés indításával lehetőségünk van egy olyan sejtpopuláció kialakítására, amely már nem tartalmaz endothel sejteket, igy az MSC sejtek tiszta sejtállománya kerülhet eltárolásra. Irodalmi hivatkozások szerint az első izolálást folyamatban még igen nagy mennyiségben lehetnek jelen pl. endothel sejtek, amelyek a második tenyésztési szakaszban szinte teljesen eltűnnek és így az MSC sejtek tiszta tormában kerülhetnek pl, mélyfagyasztásra vagy szaporításra.

V, Megvalósítás módjának részletes ismertetése:

A £öfdök&tnór mióta tárokba

A köldökzsinór min, 20 em-es darabja kerül orvos vagy szülésznő által, steril eszközökkel gyűjtésre. A gyűjtött mintát steril gyűjtőszettbe helyezik, amely 20 ml steril fiziológiás só oldatot tartalmaz, A mintát az izolálás kezdetéig 4-30 °C között kell tartani és 24 órán belül feldolgozni, hogy a szöveti állománya ne sérüljön.

2. ,4 sejt/zotákfa /epések

1. Mintaelökészítés (erek eltávolítása, darabolás.)

2. A sej tek spontán 1 eta pad ása

3. A letapadt sejtek összegyűjtése

4. A letapadt sejtek tisztítása

Alkalmazott oldatok:

(1) fiziológiás só oldat antibiotikummal: 100 ml 0,9 %-os nátrium-ki őri d oldat -»· 1 ml antibiotikum oldat (Gibeo® Antíbiotic«Antimycotic, 100X) (2) izoláló médium oldat: 45 ml MesenCult® MSC Hasal Médium (Humán) + 5 ml MesenCult® Stimulafory Suppíements (Humán) + 0,5 ml antibiotikum (Gibeodé AnuhlodeAntimycotic, 100X), pH' 7,2-7,6 tripszin oldat: 0,25 % l'rypsín-EDTA, (Phenol Red Gibeo®)

2. A zl /cáldd&zsíftár at/ota efabászítdse terek eltávolítása, darabolás)

A .fiziológiás só oldatból kiemelt köldökzsinórt 15 ml antibiotikummal kevert fiziológiás só oldatba (I) tesszük, majd a vértől alaposan megtisztítjuk, abból a gyakorlati tapasztalatból kiindulva, hogy a vérsejtek zavarhatják a WJ-MSC sejtek kitapadását.

A köldökzsinórból 1-2 ern-es darabot vágunk, ágy hogy a vágott végeken a vérerek jól láthatóak legyenek. A levágott darabot csipesszel steril Petri csészébe helyezzük, amely kh, 15 ml antibiotikummal kiegészített fiziológiás só oldatot (l) tartalmaz. Ebben történik - végig folyadék alatt - a minta feltárása; csipesszel a vérereket finoman kihúzzuk a szövetből, majd szikével a köldökzsinór tunnionmembránját nyitjuk fel. A. felnyitott köldökzsinór darabot az amnionmembránnal felfelé kiterítjük és feldaraboljuk a szövetet (a membránt és a Wharton kocsonyát együtt). 60 db kb. 2*2*2 mm-es darabot alakítunk ki, majd az izoláló médiumot tartalmazó 6?) Petri-csészébe helyezzük., úgy hogy a darabok folyadékkal teljesen fedettek lepvenek.

2,2.

Sejtek spontán letapadása a tenyésztőlesnezfalához;

A 2*2*2 mm-es darabokat tartalmazó Petrí-csésze tartalmat steril Pasteur pipetta segítségével áthelyezzük 6 lyukú tenyészíölemezek izoláló médiumot f'2) 1,5 ml-nyí mennyiségben tartalmazó mélyedéseibe úgy, hogy egy lyukba 10 darab kerüljön. A tenyésztőlemezeket Cö-> inkubátorba (37 ^UC, 85% nedvességtartalom, 5% Cö>) helyezzük, majd 3 nap elteltével ellenőrizzük az esetleges fertőződést, amire a médium színének, állagának megváltozásából, valamint az edény aljának opálosodásáhól lehet következtetni.

7-10 nap elteltével inverz mikroszkóp alatt ellenőrizzük az első sejtek megjelenését valamint a sejtek fibroblasi-szerü letapadását, Kb, 2 hét után frissítjük a médiumot, úgy hogy a folyadék egy részét steril pipettával leszívjuk és friss izoláló médiumra cseréljük. A frissítés bármikor elvégezhető, amennyiben az izoláló közeg eredeti színe jelentősen ki világosodik.

A teljes izolálást folyatnál átlagosan 4-5 hétig tart és a Íenyésztöiemez 80%-os boritottsága jelenti a folvamat végét.

2,3, /1 letapadt sejtek összegyűjtése:

A tenyésztöedények lyukaiból Pasteur pipettával eltávolítjuk az izoláló médiumot, majd a lyukakat kétszer átmossuk 1,5-2 ml fiziológiás só oldattal (/(, majd lyukanként 0,3 ml tripszin oldattal (3j 5 percig CO> termosztátban inkuháijuk (37 °C, 85¾ nedvességtartalom, 5% C(P). Inverz mikroszkópban ellenőrizzük a sejtek elszakadását az aljzattól, majd 10 ml médium oldattal (2.1 leállítjuk a tripszin oldatot, és a kapott sojtszuszpenziót eentrifugaesobe helyezzük. Centrifugálás 7 percig, RCF^:::d40 g értéken történik. A felülőszót Pasteur pipettával eltávolítjuk úgy, hogy 2 ml sejtszuszpenzió a esőben maradjon, majd Malassezkamrában megszámoljuk a sejteket.

Á letapadt sejtek tisztítása

A ún. tisztítási lépés indításával lehetőségünk van egy olyan sejtpopuláció kialakítására, amely már nem tartalmaz, endothel sejteket, igy az MSC sejtek tiszta sejtállományához jutunk. A megszámolt sejteket Izoláló médiumban (2) felszuszpendáljnk és ventillációs kupakkal, rendelkező tenyésztoedényekben szétosztjuk, amit CCP termosztátban inkubálunk (37 °C, 85% nedvességtartalom, 5% CO?) további 6-8 napig. A letapadt sejtek összegyűjtése megegyezik az 2.3. pontban szereplő leírással.

o,

Az izolálást WJ~MSC sejtek fövá&hr v/zsgw/a/«

Az izolálást technológia kidolgozása során a módszer szelektivitásának ellenőrzésére tájékoztató jelleggel a következő markerek kerültek felhasználásra; CD 14, CD 19, CD 34, C'E 45, CD 73, CD 90, CD 105, Anti-HLA-DR.

VL A találmányhoz fűződő előnyös hatások bemutatása:

A W.I-MSC izolálást folyamatra jelenleg még nincs standard eljárás, de a terápiás felhasználási lehetőségek folyamatos bővülése miatt igény mutatkozik egyszerő, hatékony és a sejteket eredeti, formájukban megőrző módszerek kidolgozására. Az eddig kidolgozott eljárások többsége enzimes feltárásra épül, annak ellenére, hogy számos tanulmány bizonyítja, hogy a szövetek nem megfelelően kivitelezett emésztése csökkenti a sejtek életképességét, degradálja a sejtek felületi receptorait és így a sejtek funkcióját, terápiás hatékonyságát is károsíthatja.

* Az általunk kidolgozott kíméletes eljárás részben azokra a kutatásokra épük amelyek feltárták, hogy a köldökzsinór különböző részei nem teljesen egyenlő értékűek (Troyer et Weiss, 2008). Az arnníonmembrán megtartásával lehetőség van azoknak a kevésbé differenciálódott, nagy plaszticitással jellemzett WJ-MSC sejteknek a kinyerésére» amelyek legnagyobb mennyiségben közvetlenül az arnníonmembrán alatt találhatóak, és amelyeknek a terápiás felhasználása is szélesebb körben valósulhat meg, mint a mar differene iái ódott sejt formáké * Az erek eltávolításával a már előrehaladottabb differeneiációt mutató és igy terápiás felhasználásra csak szükebb körben alkalmazható sejtformák kerülnek kizárásra. így az izolált sejtek terápiás értéke ís nagyobb lehet.

* Az általunk kidolgozott módszer egyrészt az izoláló közeg összetételéből fakadóan, másrészt a darabolás folyamatos folyadék közegben történő megvalósulása miatt gyakorlatilag kizárja a befertózödés lehetőségét.

* Az ún. tisztítási lépés indításával lehetőségünk van egy olyan sejtpopuláció kialakítására, amely már nem tartalmaz endothel sejteket, igy az MSC sejtek tiszta sejtállományához jutunk, * A bemutatott kíméletes módszer nem sérti meg a sejtek azonosítását is szolgáié felületi fehérjék szerkezetét, ezzel szemben az enzimes emésztéseknél ezek a fehérjék sérülhetnek.

VI t Hivatkozások

1) Anzelone R, Farina F, Zumrao G. et ai. Recent patents and advances on isolation and cellular therapy applications of mesenchymai stem eells írom humán umbilícal eord Wbarton’s jelly. Récém Rafe/tts on Regeneratív# Mv/fc/ne, 2011,1, 216-227,

2) Anzateme R, Iacono ML, Loría T, et al. Wharton's Jelly mesenchymai stern eells as eandidates fór béta eells regeneration: extending the differenüative and immunomoduíatory benefits of aduit mesenchymai stem eells fór the treatment of Íype 1 diabeíes. Stem Célt Reviews and Reports, 2011, 7, 342-363.

3) Cardoso TC, Ferrari HF, Gareía AF, et al. isolation and eharaeíerizaüon of Wharton's jeily-deríved multipotent mesenchymai stromal eells obtained írom bovine umbilícal cord and maintained in a deflned serum-free three-dimensional system. BMC Biatechnoiagy, 2012, 12, Ariidé No. 18

4) Guillot PV, Gotherstrom C, Chan 3, et al. Humán first-trimesíer fetal MSC express pinrípoteney markers and grow faster and have Ionger idomérés than aduit MSC, Stem CCS, 2007, 25, 646-654.

5)

6)

7)

8)

9)

10)

Η)

13) ί 4\ I '+)

15)

16)

7)

Karahuseytnoglu S. Cinar Ο, Kílic Ε, et al, Biology of stem eells ín humán umbiiical eord stroma: In sliu and in vitro surveys. .$?<??» CelLs\ 2007, 25, 319-331,

Koliakos 1, Tsagias N, Karagtannís V, Mesenehyrnal eells ísolatíon írom Whartorís jelly, in perspective to clhncal applications, Jettrned qf ffiological Research.. 2011, 16,

194-201.

La Rocca G, Anzalone R, Corrao S., et. al. Isoíation and charaeterization of Ocí~ 4-t7HLA-G+· mesenehyrnal stem eells írom humán umbiiical eord mátrix; Differentiation potential and detecíion of new markéra. líístochemistry and Cell Biology, 2009, 131,267-282.

Markov V, Kusumí K, Tadesse MG, et. al, Identification of eord blood-derived mesenehyrnal stem/stromal eell populations with diáimét growth kínetics, differentiation potentials and gene expression profíles. Stem Cetts and Developmení, 2007, 16. 53-73. Montanucei P, Basta (3, Peseara T, et al. New simple and rapid method fór purílíeation of mesenehyrnal stera eells írom the humán umbiiical eord Wharton jelly, Tissue Engineering, 2011, 17, 2651-2661.

Noel D, Djouad P, Bouffi C, et al, Multípotent mesenehyrnal stromal eells and immuné toleranee. Leukémia and Lymphoma, 2007, 48, 1283-1289.

Noort WA, Rrtfísselbrink AB, in’t Anker PS, et al. Mesenehyrnal stem eells promote engraftment of humán umbiiical eord blood-derived CD34-Í- eells ín NOD/SCIP roíee.

Aferoum/ogy, 2002,30, 870-878.

Salehínejad P, Aíítheen NB, Ali AM, et al. Comparison oí different methods fór the isoíation of mesenehyrnal stem eells Rom huntan umbiiical eord Wharton's jelly- /« R/'mo Celhdar and Devulapmeníal Biofogy - /dumál, 2012, 48, 75-83,

Semenov OV, Breymann C, Mesenehyrnal stem eells derived írom Wharton’s jelly and their polémiái fór cardio-vaséul ar tissue engíneering. The Open 7'A.vue Engineering and Regeneradve Medieíne Journal, 2011,4, 64-71.

Seshareddy K, Troyer 1), Weiss ML. Method to isolate mesenchymal-like eells front Wharton’s jelly oí umbiiical eord. Methods in Ceil Biology, 2008, Vol, 86. 101-119. Taghizadeh R.R, Cetrulo KJ, Cetrulo CL. Wharton’s jelly stem eells; Fulure cimieai applications. Placenta. 2011,32,S311-S315,

Troyer Dl., Weiss ML,. Concise review; Wharton’s jelly-derived eells are a prímitíve stromal eell populatlon. Elem Cells, 2008,26, 591-599.

Venugopai P, Balasubramanian 8, Majumdar ÁS, et al. Isoíation. charaeterization. and gene expression analysís of Wharton’s jelly-derived mesenehyrnal stem eells under χεηο-free euliure eonditions, »%?w Cef/s törd Ctűning: .drówees ow/ ripp/fonnöns,

2011,4, 39-50,

18) Wartg H8, Hong SC, Peng ST, et al. Mesencbyrnal stem eells int he Wharton’s jelly of the humán umbilical eord, Őfom Ce/Z,?_s 2004, 22, 1330-1337.

Claims (5)

1, Eljárás Wharton kocsonya eredetű mesenchymális őssejtek (WJ-MSC) terápiás céllal történő, enzimes előkezelést nem igénylő izolálására, amely módszer során a köldökzsinórtól az ereket eltávolítjuk, az amníonmernbránnal együtt apró darattokra vágjuk, a darabokat izoláló médiumban CCT inkubátorba helyezzük, a spontán kivándorló sejteket a letapadásuk után összegyűjtjük, és ahol az izolálás! módszer magában foglal egy olyan tisztítási lépést is, amelynek célja az endothel sejtek eltávolítása;

2» Az 1, igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sejtizolálás során használt oldatok a következők:

a) fiziológiás só oldat antibiotikummal: 100 ml 0,9 %-os nátrium-kloríd oldat - 1 ml antibiotikum oldat

b) izoláló médium oldat: 45 ml .MSE Basa! Médium -*· 5 ml Stimulatory Supplements 0,5 ml antibiotikum, pH 7,2-7,6

c) tripszin oldat: 0,25 % Trypsin~EDTA

3. Az 1, vagy 2, igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a köldökzsinór minta előkészítése a következő:

a)

b)

e)

A fiziológiás só oldatból kiemelt köldökzsinór 15 ml antibiotikummal kevert fiziológiás só oldatba tesszük, a vértől alaposan megtisztítva;

A köldökzsinórból egy 1 -2 em~es darabot áthelyezünk egy steril Petri csészébe, amely kb, 15 ml antibiotikummal kiegészített fiziológiás ső oldatot tartalmaz: libben történik - végig folyadék, alatt - a minta feltárása: csipesszel a vérereket finoman kihúzzuk a szövetből., majd szikével a köldökzsinór amnionmembránját nyitjuk fel, A felnyitott köldökzsinór darabot az amnionmemhránnal felfelé kiterítjük és feldaraboljuk a szövetet (a membránt és a Wharton kocsonyát együtt), 60 db kb. 2*2*2 mm-es darabot alakítunk ki, majd a kisebb darabokat áthelyezzük az izoláló médiumot tartalmazó Petricsészébe, úgy hogy a darabok folyadékkal teljesen fedettek legyenek.

a)

b)

e)

Az 1-2. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a sejtek spontán fetapasztásat a tenyésztőiemé# falához a kővetkezőképpen történik;

A 2*2*2 mra-es darabokat tartalmazó Petri-csésze tartalmát pipetta segítségével áthelyezzük 6 lyukú tenvésztölemezek izoláló médiumot 1,5 ml-nyi mennyiségben tartalmazó mélyedéseibe úgy, hogy egy lyukba 10 darab kerüljön.

A tenyésztőiemezeket CO? inkubátorba (37 °C, 85% nedvességtartalom. 5% <?C>2) helyezzük, majd 3 nap elteltével ellenőrizzük az esetleges fertőződést,

7-10 nap elteltével inverz mikroszkóp alatt ellenőrizzük az első sejtek megjelenését, valamint a sejtek fi broblast-szerű letapadását.

5. Az 1-4, isénvpontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hoav a letapadt sejtek :ese a következő módon történik:

a) A tenyésztőiemé/ lyukaiból Pasteur pipettával eltávolítjuk az izoláló médiumot, majd a lyukakat kétszer átmossuk 1,5-2 ml fiziológiás só oldattal, majd lyukanként 0,3 ml tripszín oldattal 5 percig, CO₂ termosztátban inkubáijuk (37 °C, 85% nedvességtartalom. 5% GOj), bj Inverz mikroszkópban ellenőrizzük a sejtek elszakadását az aljzattól, majd 10 ml médium oldattal leállítjuk a tripszín oldatot, és a kapott sejtszuszpenzíót centriiugaesöbe helyezzük,

e) Centrifugáljuk 7 percig, RCF~14Ö g értéken történik, A felül úszót Pasteur pipettával eltávolítjuk ügy, hogy 2 ml sejtszuszpenzió a csőben maradjon, majd Malassezkamrában megszámoljuk a sejteket.

6, Az 1-5. igénypontok bármelyike szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a letapadt » tisztítása a következőképpen történik:

a) A megszámolt sejteket izoláló médiumban (2) felszuszpendáljuk és verni liáeiós kupakkal rendelkező tenyésztőedényekben szétosztjuk, amit GO-> termosztátban inkubálunk (37 °C, 85% nedvességtartalom, 5% CO?) további 6-8 napig,

b) A letapadt sejteket az 5. igénypontban leírtak szerint összegyűjtjük.