CN109652362A - 一种脐带膜保存和制备干细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从人脐带最外表面覆盖的羊膜层制备间充质干细胞的方法，分离培养时脐带膜不需要贴壁处理，所分离的间充质干细胞比普通华通氏胶组织块贴壁法纯度更高。华通氏胶含有一定的成纤维细胞，其特性与间充质干细胞非常类似，难以纯化。人羊膜只含有人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞两种细胞类型，上皮细胞贴壁能力强，传代培养过程中容易去掉，从而获得的间充质干细胞纯度更高。本发明从脐带最外表面覆盖的羊膜层中提取间充质干干细胞，可有效的对脐带组织进行长期冷冻保存，冻存液充分接触脐带膜，最大程度维持了脐带膜两侧细胞的活性，且方便复苏使用，尤其是复苏后分离间充质干细胞，不需要脐带膜组织块的贴壁处理。

Description

一种脐带膜保存和制备干细胞的方法
技术领域
本发明属于干细胞制备技术领域，具体涉及一种人脐带来源间充质干细胞的制备方法，尤其涉及从脐带最外层羊膜中分离间充质干细胞。
背景技术
间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)起源于发育早期的中胚层, 是一类具有高度自我更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。MSCs 具有免疫原性低、造血支持、炎症趋化、免疫调节和提供营养支持等生物学特性，在组织损伤，免疫调控和再生医学领域受到了广泛的研究，具有广阔的应用前景。
间充质干细胞具有很强的分化能力，除可分化为脂肪，骨、软骨、骨骼肌和肌腱等中胚层细胞外，无论体内还是体外，在不同的诱导条件下，间充质干细胞还可分化为外胚层的神经细胞和内胚层的肝卵圆性细胞。临床试验表明，间充质干细胞可归巢到组织损伤部位，参与多种组织的损伤修复。
间充质干细胞对固有免疫系统和获得性免疫系统的多种免疫细胞都可以进行免疫调节。间充质干细胞主要通过旁分泌产生细胞因子、趋化因子和生长因子等生物活性物质以及细胞与细胞间的直接接触等方式共同对靶细胞进行免疫调控，调控的细胞类型包括巨噬细胞，天然杀伤细胞，T细胞，B细胞，树突状细胞和单核细胞等多种细胞类型。间充质干细胞的免疫调节作用在移植物抗宿主病，自身免疫性疾病和预防器官移植免疫排斥等方面发挥重要的作用。
间充质干细胞最初在骨髓中发现，目前已经从多种组织中分离提取，例如脐带，脂肪，牙髓，胎盘，羊水，肌肉，肺，肝和胰腺等组织中都能分离到间充质干细胞。脐带来源的间充质干细胞有其独特的优势：增殖能力强，能快速满足临床需要的细胞数量；免疫原性低，异体移植不发生免疫排斥反应；采集方便，对供体无伤害，易于保存和运输；提取和分离简单，病毒污染概率低，细胞分离培养的纯度高。
脐带表面被羊膜覆盖，呈白色，光滑而湿润，有时局部表面会有一些隆起。在妊娠期间人脐带连接母体和胎儿，为胎儿的发育提供营养，脐带主要由三部分构成：羊膜被覆上皮、两条脐带动脉和一条脐带静脉血管以及位于上皮和血管之间的华通氏胶（Wharton'sJelly）结缔组织。华通氏胶的主要成分是胶原、透明质酸、硫酸软骨素（其中胶原占干重的50%以上，以I、II、III型胶原为主），含有丰富的间充质干细胞和少量的成纤维细胞。
脐带间充质干细胞的来源包括：最外层的羊膜，羊膜下层，华通氏胶，脐带动脉和静脉血管周围组织。血管周围为含水量丰富的华通胶有保护脐带血管的作用，也可分离提取到间充质干细胞。目前的制备方法中应用最为广泛的是华通氏胶来源的间充质干细胞。此外，人羊膜所含的细胞类型包括人羊膜上皮细胞（human amniotic epithelial cells）和人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells)两种。
目前从脐带中分离间充质干细胞的方法主要有组织块贴壁法和酶消化法。酶消化法是采用混合酶包括胶原酶、胰蛋白酶、玻璃酸酶中的一种或几种对剪碎的脐带组织进行消化。消化液中的胰蛋白酶是通过对粘蛋白和糖蛋白等细胞骨架成分进行消化，从而使细胞分离，但对细胞间质的蛋白成分及细胞膜蛋白均有很强的破坏作用。 酶消化法虽然短时间内可以获得细胞，但费用高，消化的时间不好掌握，常温消化需要的时间长，容易造成分离的间充质干细胞受到损伤导致活性不佳；37℃消化需要的时间短，但液体粘稠，则难以扩增出理想数目。组织块贴壁法操作简便，对实验条件要求低，易于掌握，该方法的缺点是获得原代细胞周期长，液体的浮力使组织块漂起后，丧失爬出细胞的能力，分离的细胞数量减少。
专利201010528733.4公开了一种从脐带华通氏胶利用组织块贴壁法分离制备间充质干细胞的方法，该方法分离的间充质干细胞可能含有部分来自于华通氏胶的成纤维细胞。
专利201010605542.3公开了一种从脐带华通氏胶利用酶消化法分离制备间充质干细胞的方法，该方法分离的间充质干细胞可能含有部分自于华通氏胶的成纤维细胞。
专利201210159919.6公开了一种冻存和复苏脐带全细胞并分离和扩增干细胞的方法，该方法是用酶消化法，消化整个脐带组织块，分离和扩增的间充质干细胞中会含有血管内皮细胞，上皮细胞和成纤维细胞等细胞类型。
专利201510171887.5公开了一种从脐带羊膜下层组织中分离制备间充质干细胞的方法。该方法不采用消化酶又不同于常规贴壁法，可以制备出高纯度、高活性的间充质干细胞。
发明内容
本发明所提取间充质干细胞来自于脐带最外层的羊膜，丰富了从脐带提取间充质干细胞的来源，此外本发明提取的间充质干细胞纯度更高，具有更强的增殖和分化潜能。华通氏胶中除可提取到丰富的间充质干细胞外，还含有少量成纤维细胞。1991年，McElreavey, KD首次在脐带中发现具有成纤维样的细胞，之后有多位学者从脐带中分离到成纤维细胞。2003年，Mitchell KE，首先证实从脐带提取的间充质干细胞具有多项分化潜能。2016年，Ryan A. Denu通过大量的研究表明成纤维细胞其特性与间充质干细胞非常相似，难以将两种细胞分离开。人脐带最外层的羊膜只含有人羊膜上皮细胞和人羊膜间充质干细胞两种细胞类型，上皮细胞贴壁能力强，传代培养过程中容易去掉，从而克服现有技术存在的问题，提供一种新的脐带制备间充质干细胞的来源。
此外，本发明的发明人发现，运输和制备环节低氧环境对于间充质干细胞干性的维持起到重要作用。冻存前剥离脐带被覆的羊膜上皮，冻存时冻存液充分接触脐带膜，最大程度维持了脐带膜两侧细胞的活性，且方便复苏使用。尤其是复苏后分离间充质干细胞，不需要脐带膜组织块的贴壁处理，该方法操作更为简单。
本发明的一种脐带膜保存和制备干细胞的方法，包括以下步骤。
（1）脐带的采集：经产妇知情同意，在产房无菌条件下，健康产妇胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐的方法截取不少于20cm长的脐带。用脐带清洗液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存盒中于2-8℃医用取血箱恒温保存。从母体抽取4ml外周血，用于病毒检测；从胎盘端抽取4ml脐带血，用于微生物检测。
（2）脐带的运输和接收：将母血检测样本、脐带血检测样本和装有脐带的保存盒通过冷链运输送达生物样本库的实验室。为最大限度保证细胞的活性，样本入库时间越短越好，所有样本要在48h内入库。实验室接收样本后，将脐带血和母血检测样本移交质控实验室进行微生物检测和病毒检测。
（3）脐带膜的制备：采集的脐带血和母血检测样本检测合格后，将脐带移交至制备实验室，进行脐带膜的分离制备。脐带首先用75%的酒精进行消毒，然后用基础平衡盐溶液反复冲洗表面；用手术刀将脐带切成2~3cm的小段，用钝性镊子剥离脐带血管后，手术刀片刮去脐带羊膜下层的华通氏胶，剩下薄薄一层透明的脐带表皮即脐带羊膜，将脐带膜切成0.5cm×0.5cm的片状。
（4）冻存液的配制：所述冻存液包含10%的DMSO（二甲基亚砜），DMEM基础培养液，人血白蛋白，渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜，乙二醇，丙二醇和甘油中的一种或几种的组合。配好的冻存液放置于4℃冰箱低温保存。
（5）脐带膜的程控降温：制备好的脐带膜，浸入2-8℃预冷的冻存保护液中，脐带膜和冻存液按1:1的体积比装入冻存管中。将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。
本发明还包括以下对复苏脐带膜进行间充质干细胞分离、提取和扩增的步骤。
（6）脐带膜的复苏：将装有脐带膜的冻存管从液氮中取出后，置于37℃水浴锅中解冻2-5分钟，将脐带膜使用复苏清洗液洗涤2-4次后接种至含有完全培养基的六孔板中。
（7）间充质干细胞的原代培养：将接种脐带膜组织片的六孔板置于37℃、含5%的CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养5天后首次进行半量换液，之后每3天换液一次，7-12天左右培养板底部可观察到有细胞贴壁生长。
（8）间充质干细胞的传代培养：待原代细胞生长至细胞融合度80-90%后用含0.05~0.25%的胰蛋白酶进行消化，消化液经100目滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带间充质干细胞的滤液。依次传代培养，可获得4-6代的脐带间充质干细胞。
根据本发明所述方法制备的脐带间充质干细胞，按照2006年国际细胞治疗协会（ISCT）制定的标准进行生物学鉴定，表现出如下技术特征：①标准培养条件下粘附于塑料培养器皿，呈长梭形的成纤维样生长；②阳性指标CD73，CD90，CD105表达率≥95%，阴性指标CD34，CD45，CD19，CD11b，HLA-DR的表达率≤2%。③体外诱导分化可分化为成脂细胞和成骨细胞。
本发明提取的间充质干细胞经鉴定符合国际细胞治疗协会制定的标准，可长期冷冻保存，建立脐带间充质干细胞库。干细胞库的检测指标较多，还包括以下安全性检测。
安全性检测指标：①细菌/真菌培养；②病毒检测，包括艾滋病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒螺旋体，人巨细胞病毒等；③内毒素检测；④原癌基因检测，包括不同代次c-myc、Bmi1、H-ras三个基因的表达水平；⑤端粒酶活性的检测；⑥STR图谱分析；⑦染色体核型分析；⑧支原体检测等。所有安全性指标符合要求后，才能入库长期冷冻保存，表明该方法制备的间充质干细胞产品的安全性较高。
本发明提供了一种简单高效的脐带膜制备、冻存、复苏和分离间充质干细胞的方法，完全培养基分为科研级和临床级，提供的间充质干细胞可广泛应用于医药、科研和临床等领域。本发明的方法不采用消化酶，避免了分离过程中，消化酶引入动物源蛋白和动物源病原体的风险，组织块不需要贴壁又不同于常规的组织块培养法，操作起来更加简单。此外本发明所提取的间充质干细胞来源于脐带最外层的羊膜纯度更高，避免了华通氏胶中成纤维细胞和血管内皮细胞的掺入，具有更强的增殖和分化潜能。
附图说明
图1：脐带膜来源的间充质干细胞形态学图片。
图2：脐带膜来源的间充质干细胞流式免疫表型检测。
图3：脐带膜来源的间充质干细胞成脂诱导。
图4：脐带膜来源的间充质干细胞成骨诱导。
图5：脐带膜来源的间充质干细胞第15代染色体核型分析。
图6：脐带膜来源的间充质干细胞原癌基因检测结果。
具体实施方式
实施例一、脐带膜的冻存、复苏及复苏后干细胞的分离和扩增方法。
脐带膜的处理和冷冻保存方法包括以下步骤。
（1）脐带的采集：在产房无菌条件下，经产妇知情同意，健康产妇胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐的方法截取不少于20cm长的脐带。用脐带清洗液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存盒中于2-8℃医用取血箱恒温保存。从母体抽取4ml外周血，用于病毒检测；从胎盘端抽取4ml脐带血，用于微生物检测。
（2）脐带的运输和接收：将母血检测样本、脐带血检测样本和装有脐带的保存盒通过冷链运输送达生物样本库的实验室。为最大限度保证细胞的活性，样本入库时间越短越好，所有样本要在48h内入库。实验室接收样本后，将脐带血和母血检测样本移交质控实验室进行微生物检测和病毒检测。
（3）脐带膜的制备：采集的脐带血和母血检测样本检测合格后，将脐带移交至制备实验室，进行脐带膜的分离制备。脐带首先用75%的酒精进行消毒，然后用基础平衡盐溶液反复冲洗表面；用手术刀将脐带切成2~3cm的小段，用钝性镊子剥离脐带血管后，手术刀片刮去脐带羊膜下层的华通氏胶，剩下薄薄一层透明的脐带表皮即脐带羊膜，将脐带膜切成0.5cm×0.5cm的片状。
（4）冻存液的配制：所述冻存液包含10%的DMSO（二甲基亚砜），DMEM基础培养液，人血白蛋白，渗透性冷冻保护剂包括二甲基亚砜，乙二醇，丙二醇和甘油中的一种或几种的组合。配好的冻存液放置于4℃冰箱低温保存。
（5）脐带膜的程控降温：制备好的脐带膜，浸入2-8℃预冷的冻存保护液中，脐带膜和冻存液按1:1的体积比装入冻存管中。将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存。
对脐带膜的复苏和复苏后进行间充质干细胞分离、提取和扩增的步骤。
（6）脐带膜的复苏：将装有脐带膜的冻存管从液氮中取出后，置于37℃水浴锅中解冻2-5分钟，将脐带膜使用复苏清洗液洗涤2-4次后接种至含有完全培养基的六孔板中。
（7）间充质干细胞的原代培养：将接种脐带膜组织片的六孔板置于37℃、含5%的CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养5天后首次进行半量换液，之后每3天换液一次，7-12天左右培养板底部可观察到有细胞贴壁生长。
（8）间充质干细胞的传代培养：待原代细胞生长至细胞融合度80-90%后用含0.05~0.25%的胰蛋白酶进行消化，消化液经100目滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带间充质干细胞的滤液。依次传代培养，可获得4-6代的脐带间充质干细胞。
安全性检测指标：①细菌/真菌培养；②病毒检测，包括艾滋病病毒，乙型肝炎病毒，丙型肝炎病毒，梅毒螺旋体，人巨细胞病毒等；③内毒素检测；④原癌基因检测，包括不同代次c-myc、Bmi1、H-ras三个基因的表达水平；⑤端粒酶活性的检测；⑥STR图谱分析；⑦染色体核型分析；⑧支原体检测等。所有安全性指标符合要求后，才能入库长期冷冻保存，表明该方法制备的间充质干细胞产品的安全性较高。
实施例二、脐带膜的冻存、复苏及复苏后干细胞的分离和扩增方法
参考实施例1的方法进行，复苏的脐带膜在培养的第7天开始有贴壁细胞爬出，培养至第13天细胞汇合度达70%。汇合度达到80%以上后，胰酶消化细胞，传代至T25培养瓶中培养，第18天汇合度达到90%。传代2次后，细胞纯度达到95%以上。
实施例三、脐带膜的冻存、复苏及复苏后干细胞的分离和扩增方法
参考实施例1的方法进行，复苏的脐带膜在培养的第8天开始有贴壁细胞爬出，培养至第14天细胞汇合度达70%。汇合度达到80%以上后，胰酶消化细胞，传代至T25培养瓶中培养，第19天汇合度达到90%。传代2次后，细胞纯度达到95%以上。
实施例四、脐带膜的冻存、复苏及复苏后干细胞的分离和扩增方法
参考实施例1的方法进行，复苏的脐带膜在培养的第7天开始有贴壁细胞爬出，培养至第14天细胞汇合度达70%。汇合度达到80%以上后，胰酶消化细胞，传代至T25培养瓶中培养，第18天汇合度达到90%。传代2次后，细胞纯度达到95%以上。
实施例五、脐带膜的冻存、复苏及复苏后干细胞的分离和扩增方法
参考实施例1的方法进行，复苏的脐带膜在培养的第9天开始有贴壁细胞爬出，培养至第16天细胞汇合度达70%。汇合度达到80%以上后，胰酶消化细胞，传代至T25培养瓶中培养，第20天汇合度达到90%。传代2次后，细胞纯度达到95%以上。
实施例六、脐带膜来源间充质干细胞的生物学特性鉴定。
1.细胞增殖能力及形态学表型：通过多次具体实施例的分离培养，发现脐带膜复苏培养7-12天左右培养板底部可观察到有呈长梭形细胞贴壁生长，之后形成漩涡状细胞克隆，消化传代后单层贴壁生长，如图1所示。细胞培养过程中，细胞形态均一，排列整齐，贴壁速度快，增殖能力强， 容易被胰酶消化，传代培养5~16代，其形态和生长特点无明显改变。
2.间充质干细胞免疫表型鉴定：取第4代细胞，流式细胞术检测间充质干细胞免疫表型，观察不同代次细胞表面标志表达率的变化。待细胞汇合度达90%左右时，消化收集细胞，计数后按1×106个细胞/管，分装5管；PBS清洗后，1000rpm离心5分钟，弃上清，残留200μl，吹打混匀细胞；分别加入PE标记的CD34，CD73，CD105，CD11b抗体以及FITC标记的CD19，CD45，CD90和HLA-DR抗体，并设计阴性对照；在4℃下，避光反应30分钟，PBS清洗后，1000rpm离心5分钟，弃上清，用 200μl 的PBS吹打混匀细胞后直接上样检测；也可用200μl的1%多聚甲醛固定，置4℃冰箱于3日内上样检测。流式免疫表型检测结果符合间充质干细胞的特征，如图2所示。
3.脐带间充质干细胞多向分化潜能的鉴定。
（1）成脂肪诱导：成脂诱导液为含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加胰岛素、吲哚美辛、黄嘌呤和地塞米松四种诱导试剂。诱导试剂的工作浓度分别为：胰岛素10µmol/L，吲哚美辛100µmol/L，3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mmol/L，地塞米松110µmol/L。取P5，P10和P15代间充质干细胞，生长至80%汇合度后胰酶消化，计数取2.5×105细胞至于15ml离心管1200r/min离心1min，代细胞沉淀形成细胞团块后，用成脂诱导培养基置培养箱中培养。每3天更换成脂诱导培养基1次。诱导培养第7天，倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化，可见明显脂滴出现。随着诱导时间的延长，脂滴逐渐融合而增大，诱导培养10~14天，4%多聚甲醛固定，用油红O染色可见细胞内的脂肪被特异性的染成红色，主要分布在细胞核周围及其附近，如图3所示。
（2）成骨诱导分化：将培养细胞以5×104/ml浓度接种于预置有盖玻片的6孔培养板中。细胞贴壁后，更换为含成骨诱导培养基（含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，添加100nmol/L地塞米松，10mmol/L甘油磷酸钠，50μmol/L维生素C），置37℃，5%CO2，饱和湿度孵箱内孵育，隔日更换成骨诱导培养液；每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化；培养3～4周后，倒置显微镜下观察细胞生长状况和形态变化，可见明显钙化结节形成，茜素红染色可将钙化结节部位特性性染成红色，如图4所示。
4.染色体核型分析：核型分析的检测以筛查所培养的细胞是否有遗传缺陷和染色体畸变和监测体外长期传代培养过程中间充质干细胞是否发生染色体畸变为目的。根据《人类细胞遗传学国际命名体制ISCN2005》建立的G显带法，本发明检测了P5、P10和P15三个代次的间充质干细胞，通过秋水仙素处理，使细胞分裂停留在分裂中期，然后进行染色体数目检查和G显带分析，观察200个分裂相，染色体数目、核型无异常者判为合格。本发明的检测结果表明，本方法所分离培养的脐带间充质干细胞传至15代核型保持稳定，如图5所示。
5.STR图谱分析：对特定供者而言，其遗传基因型是特异的。不同供者的脐带组织来源，它的遗传基因型是不同的。本发明提供的方法，在组织分离、细胞培养过程中，同一供者的组织确保独立分离、传代和保存，严格防止不同产妇脐带组织操作过程中的交叉污染。一个实验室一个操作台同一时间段仅操作一种细胞，最大限度地避免不同细胞间的交叉污染。本发明对P0、P5、P10和P15共四个代次的细胞共16个位点的扩增结果，结果表明样品来源单一，四个代次的细胞来源完全一致，如下表所示。
6.端粒酶活性检测：人类正常体细胞无端粒酶活性，而85%~90%的恶性肿瘤细胞可检测到端粒酶活性，如hela宫颈癌细胞。人类细胞在胚胎发育早期，端粒酶呈活化状态，随后被抑制并一直处于失活状态，因而体细胞无端粒酶活性。当正常细胞发生癌变时端粒酶可再度活化，以逃避正常的细胞衰老过程，获得无限增殖的潜能。因此端粒酶活化是恶性肿瘤一个显著的生物学特征。检测间充质干细胞长期体外传代后端粒酶活性表达情况可以确保间充质干细胞的安全性。
本发明检测方法采用逆转录real-time PCR方法检测其是否表达端粒酶催化亚基基因hTERT。hTERT是端粒酶的核心，只表达与端粒酶阳新细胞，其mRNA表达水平直接决定端粒酶的活性程度。本发明对P1、P6、P11和P16共四个代次的细胞检测端粒酶活性，检测结果表明四个代次细胞均为阴性。
7.原癌基因检测：原癌基因（proto-oncogene）是细胞内与细胞增殖相关的基因，是维持机体正常生命活动所必需的，在进化上高度保守。当原癌基因的机构或调控区发生变异，基因产物增多或活性增强时，细胞增殖与分裂失去控制，从而形成肿瘤。检测体外传代培养的间充质干细胞是否表达原癌基因，可预警发生恶性转化的间充质干细胞，对保证间充质干细胞产品的安全性起到重要作用。
本发明采用real-time PCR方法，测定P1、P6、P11和P16共四个代次的间充质细胞原癌基因c-myc、Bmi1、H-ras的表达情况。本发明的检测结果表明，四个代次表达水平都比较低，没有显著高水平表达的代次，如图6所示，表明本方法提取的脐带间充质干细胞没有发生恶性转化的迹象。
脐带间充质干细胞库的建立：对脐带捐献知情同意书进行存档，档案中详细记录脐带来源信息，脐带膜的制备、冻存、复苏和间充质干细胞培养的信息，冻存细胞的数量和日期，冻存前细胞活性，以及培养过程进行的所有安全性检测信息等等。在储存正常脐带间充质干细胞同时，建立脐带间充质干细胞的数据库，所有资料信息与冻存的脐带组织和冻存的间充质干细胞相关联。
本发明所述方法从脐带膜分离扩增间充质干细胞的方法，来源于脐带最外层的羊膜，操作方法简单，所提取的间充质干细胞纯度更高，具有更强的增殖和分化潜能。本发明所制备脐带膜能长时间冷冻保存而不失其活性，复苏后不需要贴壁即可获得间充质干细胞，增殖能力强，可快速建立脐带间充质干细胞库，细胞可用于科学实验研究和临床试验，在组织损伤修复，免疫调控和再生医学领域具有广阔的应用前景。
以上所述仅为本发明较佳的实施案例，并不用以限制本发明，凡在本发明申请专利范围所做的修改，替换和改进等，均应包括在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种脐带膜保存和制备干细胞的方法，包括以下步骤：
（1）脐带膜的处理和冷冻保存方法：
1）脐带的采集：经产妇知情同意，在产房无菌条件下，健康产妇胎儿娩出后即刻按产科常规结扎断脐的方法截取不少于20cm长的脐带，用脐带清洗液冲洗脐带，再用医用酒精消毒，将脐带置于脐带保存盒中于2-8℃医用取血箱恒温保存，从母体抽取4ml外周血，用于病毒检测；从胎盘端抽取4ml脐带血，用于微生物检测；
2）脐带的运输和接收：将母血检测样本、脐带血检测样本和装有脐带的保存盒通过冷链运输送达生物样本库的实验室，为最大限度保证细胞的活性，样本入库时间越短越好，所有样本要在48h内入库，实验室接收样本后，将脐带血和母血检测样本移交质控实验室进行微生物检测和病毒检测；
3）脐带膜的制备：待步骤2）中脐带血和母血检测样本检测合格后，将脐带移交至制备实验室，进行脐带膜的分离制备，脐带首先用75%的酒精进行消毒，然后用基础平衡盐溶液反复冲洗表面；用手术刀将脐带切成2~3cm的小段，用钝性镊子剥离脐带血管后，手术刀片刮去脐带羊膜下层的华通氏胶，将脐带膜切成0.5cm×0.5cm的片状；
4）脐带膜的冻存：步骤3）中制备好的脐带膜，浸入2-8℃预冷的冻存保护液中，脐带膜和冻存液按1:1的体积比装入冻存管中，将冻存管放入程控降温仪进行预冷，开始冻存程序，将温度降至-90℃后取出冻存样本，放入液氮储存罐长期保存；
（2）脐带膜复苏分离提取间充质干细胞：
5）脐带膜的复苏：将装有脐带膜的冻存管从液氮中取出后，置于37℃水浴锅中解冻2-5分钟，将脐带膜用复苏清洗液洗涤2-4次后接种至含有完全培养基的六孔板中；
6）间充质干细胞的原代培养：将接种脐带膜组织片的六孔板置于37℃、含5%的CO2、饱和湿度的细胞培养箱中培养，培养5天后首次进行半量换液，之后每3天换液一次，7-12天左右培养板底部可观察到有细胞贴壁生长；
7）传代培养：待原代细胞生长至细胞融合度80-90%后用含0.05~0.25%的胰蛋白酶进行消化，消化液经100目滤网过滤，去掉脐带组织片，获得含脐带间充质干细胞的滤液，依次传代培养，可获得4-6代的脐带间充质干细胞。
2.根据权利要求1所述的（1）脐带膜的处理和冷冻保存方法，其特征是：步骤1）中所述脐带清洗液包括磷酸盐缓冲液、1%肝素钠、3mmol/L的还原型谷胱甘肽、青链霉素、庆大霉素、两性霉素B中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的，（1）脐带膜的处理和冷冻保存方法，其特征是：步骤2）中所述脐带保存盒，具有良好的密封性，保证运输过程中低氧环境。
4.根据权利要求1所述的（1）脐带膜的处理和冷冻保存方法，其特征是：步骤3）中所述脐带膜，为脐带羊膜层，具体分离方法为，固定脐带组织片靠表皮一侧，用镊子撕下脐带内侧整齐的羊膜下层组织，再用手术刀挂去残留的华通氏胶，剩下薄薄一层透明的脐带膜即脐带羊膜层组织。
5.根据权利要求1所述的（1）脐带膜的处理和冷冻保存方法，其特征是：步骤4）中所述的冻存程序为：第一步4~12℃，等待；第二步0.8~1.2℃降至0~-4℃；第三步8-12℃降至-20~-30℃；第四步0.8~1.2℃降至-45~-55℃；第五步8~12℃降至-80~-90℃后，取出冻存样本，转移至液氮罐中长期保存。
6.根据权利要求1所述的（2）脐带膜复苏分离提取间充质干细胞，其特征是：步骤5）中所述的脐带膜复苏清洗液包括磷酸盐缓冲液和间充质干细胞培养基。
7.根据权利要求1所述的（2）脐带膜复苏分离提取间充质干细胞，其特征是：步骤5）中所述的完全培养基包括含10%Gibco胎牛血清的低糖DMEM、干细胞因子SCF终浓度5-15ng/ml、成纤维细胞生长因子bFGF终浓度5-15ng/ml、人表皮细胞生长因子EGF终浓度5-15ng/ml、UltroserTMG（血清替代物）、UITRACULTURE(LONZA)基础培养基中的一种或几种的组合。
8.根据权利要求1所述的（2）脐带膜复苏分离提取间充质干细胞，其特征是：步骤5）中所述的完全培养基包括商品化的限定化学成分的培养基，包括Stem cell公司MesenCult®-XF Medium培养液或Lonza公司的 TheraPEAK™ MSCGM-CD™间充质干细胞培养基。
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