CN108251362A - 一种蜕膜间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种蜕膜间充质干细胞的制备方法：步骤1、分离；步骤2、初处理；步骤3、过滤；步骤4、接种和培养；步骤5、传代；步骤6、细胞冻存；步骤7；细胞复苏。本发明拟从原料采集开始直至细胞制备完成的全过程进行统一、系统监控，从胎盘采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。

Description

一种蜕膜间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学领域，特别是涉及一种间充质干细胞的制备方法。
背景技术
干细胞(stem cell)是一类具有自我复制能力的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞(embryonic stemcell，ES细胞)和成体干细胞(somatic stem cell)。根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞(totipotent stem cell，TSC)、多能干细胞(pluripotent stem cell)和单能干细胞(unipotent stem cell)(专能干细胞)。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。干细胞存在所有多细胞组织里，能经由有丝分裂与分化来分裂成多种的特化细胞，而且可以利用自我更新来提供更多干细胞。干细胞的来源有很多，包括胎盘、脐带、脐带血与骨髓等。
间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells，MSCs)是一类具有多向分化潜能、低免疫原性的成体干细胞，具粘附性，呈纺锤型、成纤维细胞样形态，在胚胎发育中来源于中胚层，具有分化为多种中胚层细胞系的潜能，包括骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、成纤维细胞、肌腱细胞等。MSCs广泛地存在于人体的骨髓、脂肪、牙周膜、新生儿的脐带、胎盘、羊膜、羊水等组织中，来源广泛且没有伦理限制，易于分离和体外扩增，在经过多次分裂传代后仍保持多向分化潜能，至今为止的临床试验研究未发现MSCs有严重副作用，是一种非常理想的细胞治疗和再生医学的种子细胞。
从细胞表型特征来看，目前并没有发现MSCs有某种特异性的细胞表型标记，而通常认为MSCs不表达造血干细胞的表面标记如CD45、CD14、CD11，及一些共刺激分子如CD80、CD86、CD40和CD31。一般认为MSCs表达CD105、CD73、CD44、CD90、CD106、CD29等。2006年国际细胞治疗协会(ISCT)间充质组织干细胞委员会对间充质干细胞的最低标准做了规定：第一，MSCs必须是可以在塑料培养器皿中贴壁生长的细胞；第二，MSCs流式检测必须≥95％表达CD105，CD73，CD90抗原，同时必须≤2％表达CD45，CD34，CD14，CD11b，Cd79α和HLA II；第三，MSCs必须具备在体外诱导称为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞的能力。因此，一般通过以上三点综合鉴定MSCs。
蜕膜间充质干细胞(Decidua-derivedmesenchymalstemcells，DMSCs)除了具有间充质干细胞一般表型及分化潜能外,还具有低免疫原性等独特性质,是一种多能基质细胞。蜕膜间充质干细胞不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境,而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用,如T细胞、NK细胞及DC等,发挥其在胚胎植入、免疫耐受建立及正常妊娠维持中的重要作用。目前蜕膜间充质干细胞已经应用于再生治疗,具有较高的临床应用价值。
胎盘来源间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSC)与骨髓间充质干细胞相比，具有来源充足、免疫原性低、病毒污染率较低，且无社会伦理争议等方面的优点，使其具有更好的临床应用前景。胎盘组织不但包括来自母体的绒毛膜组织、羊膜组织，还包括来自母体的底蜕膜组织，但底蜕膜来源间充质干细胞生物学特性还需要进一步研究探讨。蜕膜间充质干细胞(DMSC)与人脐带间质干细胞UCMSC相比，都来源于废弃组织，取材方便、不对人体造成伤害、不涉及伦理道德问题，且免疫原性低、具有免疫抑制性，可以抑制其他细胞引起的免疫反应，减缓移植物抗宿主病，分泌多种细胞因子，抑制炎症反应、细胞凋亡，具有造血支持作用，表达间充干细胞标记。但DMSC具有更强的跨系分化能力，能分化成外、中、内胚层细胞，表达部分胚胎干细胞标记(SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、COT4、REX-1、TRA-1-61)，有人称DMSC为亚全能干细胞，其发育阶段上与胚胎干细胞接近。相对于骨髓间充质干细胞(BMMSC)，DMSC增殖迅速、更强的长期增殖能力、多系分化能力更佳。并且，DMSC可以和UCMSC一样进行深低温保存，可用于建立细胞库，而骨髓来源MSC却很难实现。
胎盘壁脱膜中含有丰富的间充质干细胞，易于体外分离培养，细胞数量更多，体外可大量扩增，缩短细胞培养的时间，取材方便，且具有多向分化潜能，因而具有更大的临床应用价值，是细胞移植治疗和组织工程学的良好来源。
壁蜕膜作为母胎组成部分之一，跟其他间充质干细胞一样，符合2006年国际干细胞协会发表的间充质干细胞的特性。贴壁生长，流式指标合格，具有成骨、成脂、成软骨的能力。此外壁脱膜细胞还能产生某些免疫抑制因子而使其具有免疫抑制效应，不但为妊娠期间胚胎植入提供适宜环境，而且通过表达免疫调控因子与多种免疫细胞相互作用，从而对胎儿成长发育免疫受排斥起着至关重要的作用。
目前，间充质干细胞体外培养采用培养瓶或培养皿进行培养，为了培养大量的细胞，需要很大的表面积，因此需要大量的培养瓶和培养空间。但是，实际生产中受场地等因素限制，导致难以实现大规模生产。综上，如何使间充质干细胞能够大规模生产，是本领域技术人员亟待解决的技术问题。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明提供一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，本发明的方法是一种节约成本、安全可控的方法。
本申请采用了以下技术方案：
本发明提供一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：分离：将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离脐带和胎盘底蜕膜组织，将脐带和底蜕膜组织分开操作。
步骤2：初处理：分别将步骤1中的脐带和胎盘底蜕膜组织剪成小组织块，洗去两者中的血液成分，再加入胶原酶和胰酶消化小组织块。
步骤3：过滤：将消化后得到的混合液体经过滤网过滤掉不溶物质。
步骤4：接种和培养：将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、3～8％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：待细胞生长至70～85％融合时，加入胰酶消化细胞，进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得蜕膜间充质干细胞，按照需求使用即可。
所述的蜕膜间充质干细胞具有强大的免疫调节作用，能应用在制备治疗自身免疫性疾病药物中。
所述的自身免疫性疾病是指包括系统性红斑狼疮、系统性硬化、多发性肌炎和皮肌炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、1型糖尿病等在内的一大类疾病。
所述自身免疫性疾病尤其指系统性红斑狼疮、多发性硬化、1型糖尿病、类风湿性关节炎。
优选地，步骤2中，所述加入的胶原酶为Ⅰ型或者Ⅱ型。
优选地，步骤3中的滤网为200目滤网。
优选地，步骤4中，胎牛血清的含量为6～15％，更优选地为10％。
优选地，步骤4中，CO2的浓度为4～6％，更优选地为5％。
优选地，步骤5中，加入胰酶的时机是细胞生产至70～80％，更优选地为80％。
优选地，步骤5中，进行传代的比例为1:3。
优选地，步骤6中，冷冻保存所用的细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度8％。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
1.全过程全面质量监控，从胎盘采集前的筛选开始直至细胞制备成成品中间品及终产品的质量全部受控。
2.通过此法收集得到蜕膜间充质干细胞的耗时短、成本低。
3.无血清培养基，不使用抗生素，避免异源蛋白及抗生素可能引起的疾病或过敏风险。
4.低浓度冻存保护剂，保持细胞的活性及干细胞的干性，使复苏后的细胞尽可能地保证各种生物学特性不受损伤。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
本实施例提供一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：分离：将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离脐带和胎盘底蜕膜组织，将脐带和底蜕膜组织分开操作；
步骤2：初处理：分别将步骤1中的脐带和胎盘底蜕膜组织剪成小组织块，洗去两者中的血液成分，再加入Ⅱ型胶原酶和胰酶消化小组织块。
步骤3：过滤：将消化后得到的混合液体经过200目滤网过滤掉不溶物质。
步骤4：接种和培养：将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、5％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：待细胞生长至80％融合时，加入胰酶消化细胞，按1:3进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入完全培养基和8％的二甲基亚砜配制的冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得蜕膜间充质干细胞，按照需求使用即可。
实施例2
本实施例提供一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：分离：将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离脐带和胎盘底蜕膜组织，将脐带和底蜕膜组织分开操作；
步骤2：初处理：分别将步骤1中的脐带和胎盘底蜕膜组织剪成小组织块，洗去两者中的血液成分，再加入Ⅰ型胶原酶和胰酶消化小组织块。
步骤3：过滤：将消化后得到的混合液体经过200目滤网过滤掉不溶物质。
步骤4：接种和培养：将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、6％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：待细胞生长至75％融合时，加入胰酶消化细胞，按1:3进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入完全培养基和8％的二甲基亚砜配制的冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得蜕膜间充质干细胞，按照需求使用即可。
实施例3
本实施例提供一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，具体包括如下步骤：
步骤1：分离：将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离脐带和胎盘底蜕膜组织，将脐带和底蜕膜组织分开操作；
步骤2：初处理：分别将步骤1中的脐带和胎盘底蜕膜组织剪成小组织块，洗去两者中的血液成分，再加入Ⅱ型胶原酶和胰酶消化小组织块。
步骤3：过滤：将消化后得到的混合液体经过200目滤网过滤掉不溶物质。
步骤4：接种和培养：将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、4％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：待细胞生长至80％融合时，加入胰酶消化细胞，按1:3进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入完全培养基和8％的二甲基亚砜配制的冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得蜕膜间充质干细胞，按照需求使用即可。
性能测试
对实施例1～3制备的间充质干细胞进行临床标准检测，检测结果如表1和表2所述：
表1冷冻前检测结果
表2冷冻复苏后的检测结果
检测结果显示，本发明制备方法制备所得的间充质干细胞的各项标准均符合临床应用要求。且冷冻后的细胞数和细胞活率较冷冻前无明显下降。
以上内容是结合具体的实施方式对本申请所作的进一步详细说明，不能认定本申请的具体实施只局限于这些说明。对于本申请所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本申请的保护范围。

Claims (10)

1.一种蜕膜间充质干细胞的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
步骤1：分离：将胎盘组织用无菌盐水冲洗后，小心分离脐带和胎盘底蜕膜组织，将脐带和底蜕膜组织分开操作；
步骤2：初处理：分别将步骤1中的脐带和胎盘底蜕膜组织剪成小组织块，洗去两者中的血液成分，再加入胶原酶和胰酶消化小组织块。
步骤3：过滤：将消化后得到的混合液体经过滤网过滤掉不溶物质。
步骤4：接种和培养：将过滤后的混合液体分别接种于细胞培养瓶中，用含胎牛血清的DF12培养液于37℃、3～8％CO2、饱和湿度的培养箱中培养。
步骤5：传代：待细胞生长至70～85％融合时，加入胰酶消化细胞，进行传代。
步骤6：细胞冻存：收集细胞并计数和活率，按3×107/ml/管放入细胞冻存管，加入冷冻保护液，放入液氮罐中进行冷冻保存；
步骤7：细胞复苏：将细胞冻存管从液氮罐中取出，迅速放入37℃水浴中，不断摇动，2min中之内解冻，离心洗涤弃上清，获得蜕膜间充质干细胞，按照需求使用即可。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述加入的胶原酶为Ⅰ型或者Ⅱ型。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤3中的滤网为200目滤网。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中胎牛血清的含量为6～15％。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中胎牛血清的含量为10％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤4中，CO2的浓度为5％。
7.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，加入胰酶的时机是细胞生产至70～80％。
8.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，加入胰酶的时机是细胞生产至80％。
9.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤5中，进行传代的比例为1:3。
10.根据权利要求1所述的的制备方法，其特征在于，步骤6中，冷冻保存所用的细胞冷冻保护液由完全培养基和二甲基亚砜配制而成，其中二甲基亚砜终浓度8％。
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