CN110438092B - 病毒运送培养基及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种病毒运送培养基及其制备方法和应用，涉及培养液领域。本发明的病毒运送培养基，包括以下原料：Hank’s平衡盐、亲水胶、血清白蛋白、双糖、氨基酸、生物缓冲剂和抗生素。本发明的茶品具有广谱抗菌、减缓病毒降解、保持病毒活性以及制备成本低的优点。
Description
技术领域
本发明涉及培养液领域，特别是涉及病毒运送培养基及其制备方法和应用。
背景技术
环境等因素变化可能会引起呼吸道病毒活跃，对人体健康有较大的威胁。目前，人们已认识到病原学检测对诊疗突发性传染病的重要意义，临床病毒检测的需求越来越大，而病毒运送培养基的需求也同步迅猛增长。
病毒由核酸分子与蛋白质构成或仅由蛋白质构成，病毒个体微小、结构简单。病毒自身不能进行复制，而是将基因侵入宿主细胞内，借助宿主细胞的复制系统复制新的病毒。检测病毒前需要先采集病毒样本，采集后将病毒样本放入运送培养基中保存和运输，运送培养基可以维持病毒样本的活性，延长样本中病毒存活的时间。病毒进入运送培养基后，可能会因为温度和pH值的变化，导致蛋白外壳分解，DNA酶或RNA酶沿破裂的外壳进入病毒内部分解核酸。为了保证检测准确性，运送培养基应尽量满足以下要求：抑制细菌生长，减缓病毒降解，保持病毒活性，增强病毒对温度的耐受能力。
目前病毒运送培养基的种类较多，但是许多病毒运送培养基的成分不明，价格昂贵，无法同时保证抑菌、保持活性、减缓降解率等性能。
发明内容
基于此，有必要针对现有的病毒运送培养基价格高、性能参差不齐的问题，提供一种病毒运送培养基，具有广谱抗菌、减缓病毒降解、保持病毒活性的优点。
一种病毒运送培养基，包括以下工作浓度的原料：
上述病毒运送培养基，多种成分配合，使其具有抗菌、保护病毒完整性，防止病毒在保存、运输的过程中迅速降解，延长病毒的生存时间和维持病毒的感染能力的作用；其中，血清白蛋白可以在病毒的蛋白质外壳形成保护膜，使其不易被降解，保持病毒颗粒的完整性，Hank’s平衡盐溶液控制体系中的pH为中性，有利于延长病毒的生存时间和维持病毒的感染能力。
上述工作浓度指该培养基在实际应用时的浓度，可以理解的，为了储存、运输和售卖方便，也可将该培养基以固态形式包装，使用时辅以特定容量的溶剂溶解即可；或以较为浓缩的高浓度溶液保存，使用时稀释一定的倍数使用。
在其中一个实施例中，所述病毒运送培养基的溶剂为水
在其中一个实施例中，所述Hank’s平衡盐包括以下工作浓度的原料：
在其中一个实施例中，所述氨基酸选自：L-半胱氨酸和L-谷氨酸中的一种或两种。
在其中一个实施例中，所述抗生素选自：两性霉素B、多粘菌素B和庆大霉素中的一种或多种。优选地，抗生素为两性霉素B、多粘菌素B和庆大霉素的混合物，多种抗生素联合，使培养基具有广普抗细菌和抗真菌的作用。
在其中一个实施例中，所述亲水胶为明胶，所述血清白蛋白为牛血清白蛋白，所述双糖为蔗糖，所述生物缓冲剂为Hepes，Hepes为4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸。
本发明一方面还提供一种上述病毒运送培养基的制备方法，包括以下步骤：
配制溶液：配制Hank’s平衡盐溶液、双糖溶液、血清白蛋白溶液、氨基酸溶液、生物缓冲液、抗生素溶液以及亲水胶溶液；
配制培养基：将上述溶液混合，定容。
该制备方法简单易操作，得到的病毒运送培养基成本低，同时还具有抑制细菌生长，减缓病毒降解，保持病毒活性，增强病毒对温度的耐受能力的优点。
在其中一个实施例中，还包括除菌步骤。
在其中一个实施例中，所述除菌步骤中，所述除菌步骤中，对Hank’s平衡盐溶液、双糖溶液、血清白蛋白溶液、氨基酸溶液、生物缓冲液和抗生素溶液采用过滤方式除菌，对所述亲水胶溶液采用高压方式除菌。
本发明一方面还提供上述病毒运送培养基在保存病毒中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的病毒运送培养基，多种成分配合，使其具有抗菌、保护病毒完整性，防止病毒在保存、运输的过程中迅速降解，延长病毒的生存时间和维持病毒的感染能力的作用；其中，血清白蛋白可以在病毒的蛋白质外壳形成保护膜，使其不易被降解，保持病毒颗粒的完整性，Hank’s平衡盐溶液控制体系中的pH为中性，有利于延长病毒的生存时间和维持病毒的感染能力，可有效延长病毒活性时间；而且本发明的病毒运送培养基制备方法简单易操作，制作成本低，有利于工业生产和大规模推广。
附图说明
图1为本发明产品在不同浓度时抑制金黄色葡萄球菌的效果图；
图2为本发明产品在不同浓度时抑制大肠杆菌的效果图；
图3为本发明产品在不同浓度时抑制白色念球菌的效果图；
图4为病毒运送培养基对金黄色葡萄球菌的抑菌效果图；
图5为病毒运送培养基对大肠杆菌的抑菌效果图；
图6为病毒运送培养基对白色念珠菌的抑菌效果图。
图中，a表示以实施例1的病毒运送培养基为抑菌剂；b表示以实施例2的病毒运送培养基为抑菌剂；c表示以实施例3的病毒运送培养基为抑菌剂；A表示以对比例1的病毒运送培养基为抑菌剂；B表示以对比例2的病毒运送培养基为抑菌剂；C表示以实施例2的病毒运送培养基为抑菌剂。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
实施例1
一种病毒运送培养基，通过以下方法制备得到：
1)按以下配方配制4×Hank’s平衡盐溶液：
2)按下表配制病毒运送培养基：
表1.实施例1的病毒运送培养基配制表
| 组分名称 | 贮存液浓度 | 用量 | 终浓度 |
| Hank’s平衡盐溶液 | 4× | 125mL | 0.5× |
| 明胶 | 5％ | 20mL | 1g/L |
| BSA | 10％ | 25mL | 2.5g/L |
| 蔗糖 | 5％ | 20mL | 1g/L |
| L-半胱氨酸 | 0.015mmol/mL | 6.6mL | 0.1mM/L |
| L-谷氨酸 | 0.015mmol/mL | 6.6mL | 0.1mM/L |
| Hepes | 1M/L | 5mL | 5mM/L |
| 两性霉素B | 2.5mg/mL | 4mL | 10mg/L |
| 多粘菌素B | 2mg/mL | 5mL | 10mg/L |
| 庆大霉素 | 10mg/mL | 1mL | 10mg/L |
| 水 | / | 定容至1L | / |
其中，4×Hank’s平衡盐溶液、蔗糖、BSA溶液、L-半胱氨酸、L-谷氨酸、Hepes、两性霉素B、多粘菌素B、庆大霉素分别配制完成后，采用滤膜过滤除菌；明胶配制完成后，采用高压除菌。各组分除菌后，按配比混合，用水定容即得病毒运送培养基。
实施例2
一种病毒运送培养基，与实施例1的区别在于，组分和配比如下表所示：
表2.实施例2的病毒运送培养基配制表
| 组分名称 | 贮存液浓度 | 用量(配制1L) | 终浓度 |
| Hank’s平衡盐溶液 | 4× | 250mL | 1× |
| 明胶 | 5％ | 50mL | 2.5g/L |
| BSA | 10％ | 50mL | 5g/L |
| 蔗糖 | 5％ | 50mL | 2.5g/L |
| L-半胱氨酸 | 0.015mmol/mL | 10mL | 0.150mM/L |
| L-谷氨酸 | 0.015mmol/mL | 10mL | 0.150mM/L |
| Hepes | 1M | 10mL | 10mM/L |
| 两性霉素B | 2.5mg/mL | 8mL | 20mg/L |
| 多粘菌素B | 2mg/mL | 10mL | 20mg/L |
| 庆大霉素 | 10mg/mL | 2mL | 20mg/L |
| 水 | / | 定容至1L | / |
实施例3
一种病毒运送培养基，与实施例1的区别在于，组分和配比如下表所示：
表3.实施例3病毒运送培养基配制表
| 组分名称 | 贮存液浓度 | 用量(配制1L) | 终浓度 |
| Hank’s平衡盐溶液 | 4× | 500mL | 2× |
| 明胶 | 5％ | 100mL | 5g/L |
| BSA | 10％ | 100mL | 10g/L |
| 蔗糖 | 5％ | 100mL | 5g/L |
| L-半胱氨酸 | 0.015mmol/mL | 20mL | 0.3mM/L |
| L-谷氨酸 | 0.015mmol/mL | 20mL | 0.3mM/L |
| Hepes | 1M | 20mL | 20mM/L |
| 两性霉素B | 2.5mg/mL | 16mL | 40mg/L |
| 多粘菌素B | 2mg/mL | 20mL | 40mg/L |
| 庆大霉素 | 10mg/mL | 4mL | 40mg/L |
| 水 | / | 定容至1L | / |
对比例1
国内某品牌病毒运送培养基，主要成分为：
Hank’s平衡盐溶液、BSA、氨基酸、庆大霉素、曲古霉素。
对比例2
国外某品牌病毒运送培养基，主要成分为：
Hank’s平衡盐溶液、明胶、BSA、L-半胱氨酸、蔗糖、L-谷氨酸、Hepes、万古霉素、两性霉素B、多粘菌素B。
实验例1(不同浓度产品的抑菌实验)
以金黄色葡萄球菌(ATCC25923标准株)、大肠杆菌(ATCC25922标准株)、白色信念珠菌(临床株)为可能存在的环境干扰试验菌，用纸片法测试实施例1～3的病毒运送培养基的抑菌效果，结果见图1～3，抑菌环尺寸如表4所示：
表4.抑菌环尺寸(cm)
注：“/”表示未做该重复。
从表4可知，本发明产品在低浓度(即实施例1)下依然对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念球菌均具有较好的抑菌作用。
实验例2(不同产品的抑菌作用)
以金黄色葡萄球菌(ATCC25923标准株)、大肠杆菌(ATCC25922标准株)、白色信念珠菌(临床株)为试验菌，测试不同浓度实施例2、对比例1及对比例2的病毒运送培养基的抑菌作用。纸片法测试结果如图4～6所示，抑菌环尺寸如表5所示：
表5.不同浓度产品的抑菌作用(抑菌环单位：cm)
由表5可知，本发明的产品对三种菌均有良好的抑菌效果，尤其是对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有显著的抑制效果，对比例1～2对白色念珠菌和大肠杆菌均无抑菌作用，而产品对该菌具有较好的抑菌效果。本产品与对比例1均对金黄色葡萄球菌，效果相当。因此，本产品相比于市面上进口或国产的运送培养基，具有更好的抑菌效果。
实验例3(保存效果测试)
(1)在实施例2和对比例的病毒运送培养基中分别加入EV71(肠道病毒71型)、CA16(柯萨奇病毒A16)、FB(Influenza B virus，B型流感病毒)、H3N2(甲型流感病毒)、HSV1(1型单纯疱疹病毒)、P1V1(1型副流感病毒)、P1V3(3型副流感病毒)、PR8(甲型流感病毒)、RHV(人鼻病毒)、RSV(呼吸道合胞病毒)，测试以上各病毒在4℃和室温条件下的保存效果，测试保存前和保存3天、5天、7天后的病毒滴度，结果如表6所示：
表6.不同病毒运送培养基对病毒活毒的保存效果
从表6可知，本发明的产品在4℃和25℃下的保存效果整体上均优于国产或进口的病毒运送培养基，而且本产品适用的病毒种类范围较广；本产品在不同温度下，保存3天、5天、7天后，病毒的Log(TCID50/mL)值依然较高，表明本产品能有效减缓病毒活力下降。
(2)分别向实施例1、实施例2、实施例3的培养基中加入PR8、HSV1，测试以上两种病毒在4℃和25℃下的保存效果，测试保存前和保存3天、5天、7天后的病毒滴度，结果如表7所示：
表7.不同浓度的本产品对病毒活毒的保存效果
从表7可知，本产品在低浓度、中浓度和高浓度下Log(TCID50/mL)值相差较小，表明本发明的产品在不同浓度下均能达到很好的保存效果。
实施例4(Real-time PCR检测)
将PR8(甲型流感病毒)分别加入到实施例1、实施例2及实施例3的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表8-14所示。
表8.PCR检测结果
表9. 4℃条件下保存3天不同实施例间Ct值均数比较结果
P＝0.08>0.05，可以认为4℃条件下保存3天不同实施例间Ct值总体平均水平没有差异。
表10. 4℃条件下保存5天不同实施例间Ct值均数比较结果
P<0.01，可以认为4℃条件下保存5天不同实施例间Ct值总体平均水平差异显著。
表11. 4℃条件下保存7天不同实施例间Ct值均数比较结果
P<0.01，可以认为室温条件下保存7天不同实施例间Ct值总体平均水平差异显著。
表12.室温条件下保存3天不同实施例间Ct值均数比较结果
P<0.01，可以认为室温条件下保存3天不同实施例间Ct值总体平均水平差异显著。
表13.室温条件下保存5天不同实施例间Ct值均数比较结果
P<0.01，可以认为室温条件下保存5天不同实施例间Ct值总体平均水平差异显著。
表14.室温条件下保存7天不同实施例间Ct值均数比较结果
P<0.01，可以认为室温条件下保存7天不同实施例间Ct值总体平均水平差异显著。
结果表明，实施例2的培养基无论在4℃或室温条件下，都能有效保护PR8病毒核酸，实施例1和实施例3的对PR8病毒核酸的保存效果较差。
将HSV1(1型单纯疱疹病毒)分别加入到实施例1、实施例2及实施例3的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如附表15-21所示：
表15.PCR检测结果
表16. 4℃条件下保存3天不同实施例间Ct值均数比较结果
P＝0.317>0.05，可以认为4℃条件下保存3天不同实施例间Ct值总体平均水平没有差异。
表17. 4℃条件下保存5天不同实施例间Ct值均数比较结果
P＝0.323>0.05，可以认为4℃条件下保存5天不同实施例间Ct值总体平均水平没有差异。
表18. 4℃条件下保存7天不同实施例间Ct值均数比较结果
P＝0.075>0.05，可以认为4℃条件下保存7天不同实施例间Ct值总体平均水平没有差异。
表19.室温条件下保存3天不同实施例间Ct值均数比较结果
P＝0.164>0.05，可以认为室温条件下保存3天不同实施例间Ct值总体平均水平没有差异。
表20.室温条件下保存5天不同实施例间Ct值均数比较结果
P<0.01，可以认为室温条件下保存5天不同实施例间Ct值总体平均水平差异显著。
表21.室温条件下保存7天不同实施例间Ct值均数比较结果
P＝0.220>0.05，可以认为室温条件下保存7天不同实施例间Ct值总体平均水平没有差异。
将PR8(甲型流感病毒)分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表22-28所示：
表22.PCR检测结果
表23. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.931>0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表24. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.350>0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表25. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.075>0.05，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表26.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.246>0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表27.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.01，可以认为室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表28.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.220>0.05，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
虽然实施例2与对比例在不同保存条件下保存3、5、7天，Ct值总体平均水平基本上没有差异(除了室温下保存5天)，但实施例2检测结果的整体降幅比对比例小，表明对PR8病毒核酸的保存效果优于对比例。
将HSV1病毒分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表29-35所示：
表29.表11PCR检测结果
表30. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.322>0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表31. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.314>0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表32. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.095>0.05，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表33.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.106>0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表34.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.462>0.05，可以认为室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表35.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.001<0.05，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
虽然实施例2与对比例在不同保存条件下保存3、5、7天，Ct值总体平均水平基本上没有差异(除了室温下保存7天)，但实施例2检测结果的整体降幅比对比例小，表明对HSV1病毒核酸的保存效果优于对比例。
将肠道病毒71型分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表36-42所示：
表36.PCR检测结果
表37. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表38. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.001<0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表39. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.034<0.05，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表40.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.249>0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表41.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.843>0.05，可以认为室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表42.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
实施例2对EV71核酸的保存效果略优于对比例。
将柯萨奇病毒A16型分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表43-49所示：
表43.表13PCR检测结果
表44. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.012<0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表45. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.004<0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表46. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表47.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表48.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.003<0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表49.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.005<0.05，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
将甲型流感病毒H3N2分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表50-56所示：
表50.PCR检测结果
表51. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.011<0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表52. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.007<0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表53. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.003<0.05，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表54.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.037<0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表55.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表56.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.001<0.05，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
以上结果表明，实施例2对H3N2病毒核酸的保存效果明显优于对比例。
将乙型流感病毒分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表57-63所示：
表57.PCR检测结果
表58. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表59. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表60. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表61.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表62.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表63.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
将呼吸道合胞病毒分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表64-70所示：
表64.PCR检测结果
表65. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.596>0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表66. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.001<0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表67. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.014<0.001，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表68.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.010<0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表69.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.002<0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表70.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
以上结果表明实施例2的整体保存效果优于对比例。
将鼻病毒分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表71-77所示：
表71.PCR检测结果
表72. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.128>0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表73. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.033<0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表74. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.132>0.05，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表75.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.002<0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表76.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表77.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
以上结果表明实施例2的整体保存效果优于对比例。
将1型副流感病毒分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表78-84所示：
表78.PCR检测结果
表79. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.447>0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表80. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.541>0.05，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表81. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.361>0.05，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表82.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.457>0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表83.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.920>0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表84.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.609>0.05，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
以上结果表明1型副流感病毒在实施例2和对比例中不同条件和保存天数下保存，Ct值总体平均水平均没有差异，但实施例2的整体保存效果优于对比例。
将3型副流感病毒分别加入到对比例1、对比例2及实施例2的培养基中，分别在4℃和25℃下保存，保存0、3、5、7天后进行Real-time PCR检测，结果如表85-91所示：
表85.PCR检测结果
表86. 4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.694>0.05，可以认为4℃条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表87. 4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.001，可以认为4℃条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表88. 4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.075>0.05，可以认为4℃条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表89.室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.166>0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平没有差异。
表90.室温条件下保存5天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P＝0.001<0.05，可以认为室温条件下保存3天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
表91.室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值均数比较结果
P<0.0001，可以认为室温条件下保存7天实施例与对比例之间Ct值总体平均水平差异显著。
结果表明实施例2的整体保存效果优于对比例。
综上所述，本发明的病毒运送培养基在抑菌、保持病毒活毒等方面的性能优于国产和进口的运送培养基；而且，本发明产品在小试阶段的成本价仅需3.6元/支，量产成本将会更低，本发明产品的成本远远低于国内或国外同类产品，有利于工业生产和大规模推广。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (7)
1.一种病毒运送培养基，其特征在于，包括以下工作浓度的原料：
所述氨基酸选用L-半胱氨酸和L-谷氨酸，所述L-半胱氨酸的浓度为0.1～0.3mmol/L，所述L-谷氨酸的浓度为0.1～0.3mmol/L；所述抗生素选用两性霉素B、多粘菌素B和庆大霉素，所述两性霉素B的浓度为10～40mmol/L，所述多粘菌素B的浓度为10～40mmol/L，所述庆大霉素的浓度为10～40mmol/L；所述亲水胶为明胶；所述血清白蛋白为牛血清白蛋白；所述双糖为蔗糖；所述生物缓冲剂为Hepes。
2.根据权利要求1所述的病毒运送培养基，其特征在于，所述病毒运送培养基的溶剂为水。
3.根据权利要求1或2所述的病毒运送培养基，其特征在于，所述Hank’s平衡盐包括以下工作浓度的原料：
4.一种权利要求1～3任一项所述的病毒运送培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
配制溶液：配制Hank’s平衡盐溶液、双糖溶液、血清白蛋白溶液、氨基酸溶液、生物缓冲液、抗生素溶液以及亲水胶溶液；
配制培养基：将上述溶液混合，定容。
5.根据权利要求4所述的病毒运送培养基的制备方法，其特征在于，还包括除菌步骤。
6.根据权利要求5所述的病毒运送培养基的制备方法，其特征在于，所述除菌步骤中，对Hank’s平衡盐溶液、双糖溶液、血清白蛋白溶液、氨基酸溶液、生物缓冲液和抗生素溶液采用过滤方式除菌，对所述亲水胶溶液采用高压方式除菌。
7.一种权利要求1～3任一项所述的病毒运送培养基在保存病毒中的应用。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910753295.2A CN110438092B (zh) | 2019-08-15 | 2019-08-15 | 病毒运送培养基及其制备方法和应用 |
Applications Claiming Priority (1)
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| CN201910753295.2A CN110438092B (zh) | 2019-08-15 | 2019-08-15 | 病毒运送培养基及其制备方法和应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
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