CN109593114B - 一种黄蛞蝓抗菌肽、提取方法及其应用 - Google Patents

一种黄蛞蝓抗菌肽、提取方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于活性多肽技术领域，特别涉及一种黄蛞蝓抗菌肽、提取方法及其应用。包括采集活体的黄蛞蝓匀浆，离心后取上清液；用10KDa的超滤管超滤，收集滤出液，然后用3KDa的超滤管超滤，收集截留液，冷冻干燥；高效液相层析色谱后得黄蛞蝓抗菌肽。本发明提取的抗菌肽具有很好的抗菌活性，可以有效的清除伤口中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，极具应用前景。

Description

一种黄蛞蝓抗菌肽、提取方法及其应用
技术领域
本发明属于活性多肽技术领域，特别涉及一种黄蛞蝓抗菌肽、提取方法及其应用。
背景技术
抗生素，是指由微生物(包括细菌、真菌、放线菌属)或高等动植物在生活过程中所产生的具有抗病原体或其他活性的一类次级代谢产物，能干扰其他生活细胞发育功能的化学物质。现临床常用的抗生素有微生物培养液中的提取物以及用化学方法合成或半合成的化合物，目前已知天然抗生素不下万种，广泛应用于临床。由于抗生素的长期不规范使用甚至滥用，导致了细菌耐药性的急剧和大范围出现，尤其近年来，耐药菌株引起的感染性疾病已成为一个世界性的健康难题。作为最普遍的耐药菌之一，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌所引起的皮肤和软组织感染，其治疗变得更加困难。大量研究表明，抗菌肽具有广谱的抗菌活性，对耐药性菌株也同样具有良好的抑制杀灭作用，在应对耐药菌感染上展现出了良好的应用前景，可以作为新型抗菌药物的来源。
蛞蝓(学名Linnaeus)为腹足纲，柄眼目，蛞蝓科动物的统称。黄蛞蝓在我国具有2000多年的药用历史，可用于治疗喘息、痈肿、丹毒等与细菌感染相关的疾病，说明黄蛞蝓中存在抗菌组分。
发明内容
本发明提取的抗菌肽具有很好的抗菌活性，可以有效的清除伤口中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，极具应用前景。
本发明提供了一种黄蛞蝓抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，采集活体的黄蛞蝓并用无菌水清洗，然后用相当于黄蛞蝓3倍重量的无菌水混合后匀浆，离心后取上清液；
S2，将S1中上清液用10KDa的超滤管超滤，收集滤出液，然后用3KDa的超滤管超滤，收集截留液，冷冻干燥后得抗菌肽粗提物；
S3，将S2中抗菌肽粗提物进行高效液相层析色谱，得黄蛞蝓抗菌肽。
优选地，所述匀浆条件为4℃；离心条件为4℃下12000r/min，时间为20min。
优选地，所述高效液相层析色谱的洗脱条件为：流速为1mL/min，时间为60min；起始洗脱液配比为95％的溶液A和5％的溶液B；结束时的洗脱液配比为5％的溶液A和95％的溶液B；
其中，溶液A为含0.1％TFA的去离子水；溶液B为含0.1％TFA的90％乙腈。
优选地，所述高效液相层析色谱的检测波长为230nm。
一种利用上述黄蛞蝓抗菌肽的提取方法制备的黄蛞蝓抗菌肽。
一种上述的黄蛞蝓抗菌肽在抑制抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明提取的抗菌肽具有很好的抗菌活性，可以有效的清除伤口中的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，极具应用前景；该多肽提取物对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和大肠杆菌也都有抑制作用。
附图说明
图1为本发明实施例1中高效液相层析色谱分析图；
图2为本发明实施例2中蛞蝓多肽的体内抗菌活性图；
其中，图2中Negative control：1.5％的羟甲基纤维素凝胶；Murpirocinointment：阳性对照；★★★：显著性差异，p<0.05。
具体实施方式
下面结合附图1-2对本发明的一个具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制，实施例中涉及的试剂均能通过公共渠道获得。
实施例1
一种黄蛞蝓抗菌肽的提取方法，包括以下步骤：
S1，采集活体的黄蛞蝓并用无菌水清洗，然后用相当于黄蛞蝓3倍重量的无菌水混合后匀浆，离心后取上清液；
其中，匀浆条件为4℃；离心条件为4℃下12000r/min，时间为20min；
S2，将S1中上清液用10KDa的超滤管超滤，收集滤出液，然后用3KDa的超滤管超滤，收集截留液，冷冻干燥后得抗菌肽粗提物；
S3，将S2中抗菌肽粗提物进行高效液相层析色谱，得黄蛞蝓抗菌肽；
利用Angilent公司的高效液相层析色谱的洗脱条件为：流速为1mL/min，时间为60min；起始洗脱液配比为95％的溶液A和5％的溶液B；结束时的洗脱液配比为5％的溶液A和95％的溶液B；
其中，溶液A为含0.1％TFA的去离子水；溶液B为含0.1％TFA的90％乙腈；高效液相层析色谱的检测波长为230nm。
一种上述的黄蛞蝓抗菌肽的提取方法制备的黄蛞蝓抗菌肽。
一种上述的黄蛞蝓抗菌肽的提取方法制备的黄蛞蝓抗菌肽在抑制抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌中的应用。如图1所示的高效液相层析色谱分析图，F2即为黄蛞蝓抗菌肽提取物。
实施例2
验证本发明实施例1中提取的黄蛞蝓抗菌肽的体外抗菌活性：
用无菌水将获得的黄蛞蝓抗菌多肽提取物溶解，并利用BCA法测定多肽的含量。通过微量稀释法检测各组分的抗菌活性：将对数生长期的菌液用无菌的LB培养基稀释到105-106cfu/mL；无菌的96孔板中，每孔加入上述稀释后的菌液160μL和以2倍梯度不同程度稀释的不同浓度的黄蛞蝓抗菌多肽提取物40μL；每个浓度设置3个平行；将96孔板于37℃的培养温度和250rpm/min的摇速的摇床中培养16-18h；不能观察到细菌生长的最小浓度即为黄蛞蝓抗菌多肽提取物对细菌的最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)。
用上述方法对多种菌株做了最小浓度检测，结果如表1-表2：
表1黄蛞蝓抗菌多肽提取物的抗菌活性
Figure BDA0001971329830000041
表2黄蛞蝓抗菌多肽提取物的抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌活性
Figure BDA0001971329830000042
实施例3
黄蛞蝓多肽提取物的体内抗菌活性：
感染模型建立：雌性Balb/c小鼠，每只小鼠背部皮肤区域造1个直径10mm的全层皮肤切除的伤口；伤口加浓度为5×108cfu/mL的对数生长期的MRSA P1381的生理盐菌悬液20μL，感染24h。
实验分组：将感染的小鼠分为阴性对照组，黄蛞蝓抗菌多肽提取物多肽处理组(多肽浓度为5mg/mL的1.5％水凝胶)，及阳性对照组(2％的murpirocin软膏，Bactroban：GlaxoSmithKline)，每组6只小鼠。
给药及检测：每个感染的伤口给药20μL，每24h给药一次，连续给药3次；取伤口处皮肤组织并称重，每个皮肤组织样品中加入1mL的生理盐水，并用组织匀浆器将所取组织匀浆；将匀浆后的组织10倍梯度稀释，并涂布在LB固体培养基平板上，然后将平板于细菌培养箱37℃培养18h，统计菌落数并计算组织中的菌落含量[log10(cfu/g)]。结果如图2所示，黄蛞蝓多肽提取物对MRSA P1381具有显著抑制效果。
需要说明的是，本发明权利要求书中采用的步骤方法与上述实施例相同，为了防止赘述，本发明的描述了优选的实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例做出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

Claims (1)

1.黄蛞蝓抗菌肽在制备抑制抗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的药物中的应用，其特征在于，所述黄蛞蝓抗菌肽的制备过程包括以下步骤：
S1，采集活体的黄蛞蝓并用无菌水清洗，然后用相当于黄蛞蝓3倍重量的无菌水混合后于4℃下匀浆，于4℃，12000r/min，离心20min，离心后取上清液；
S2，将S1中上清液用10KDa的超滤管超滤，收集滤出液，然后用3KDa的超滤管超滤，收集截留液，冷冻干燥后得抗菌肽粗提物；
S3，将S2中抗菌肽粗提物进行高效液相层析色谱，得黄蛞蝓抗菌肽；
所述高效液相层析色谱的洗脱条件为：流速为1mL/min，时间为60min；起始洗脱液配比为95％的溶液A和5％的溶液B；结束时的洗脱液配比为5％的溶液A和95％的溶液B；
其中，溶液A为含0.1％TFA的去离子水；溶液B为含0.1％TFA的90％乙腈；
所述高效液相层析色谱的检测波长为230nm。
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