CN109160939A - 一种生物抗菌肽及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种从紫斑谷螟(Pyralis farinalis Linnaeus)老熟幼虫中筛选获得的抗菌肽，其氨基酸序列为LLVYLHYPLNCPGSLCR；本发明所提供的抗菌肽对食品保藏领域中常见的腐败菌具有明显的抗性，可用作食品保存用的添加剂来使用，从而避免对健康有害的防腐剂的使用量。

Description

一种生物抗菌肽及其应用

技术领域

本发明属于功能活性物质筛选应用技术领域，具体涉及一种生物抗菌肽及其应用。

背景技术

抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，又被称做肽抗生素或抗微生物肽。其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性和阳离子特点使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。

目前已经从多种生物中筛选获得了抗菌肽，例如抗菌肽cecropin P1是Lee等(1989)首先从猪小肠分离出得到的，其含有31个氨基酸残基，分子量是3339Da，不含半胱氨酸，不能形成分子内二硫键，有强碱性的N端和强疏水性的C端，其中酰胺化的C端对其广谱抗菌作用极为重要。cecropin P1氨基酸序列与昆虫cecropin A有64％相似性，与cecropinB有75％的相似性。对其二级结构的理论预测及CD谱和二维核磁共振数据表明，其分子内含有两亲水性α-螺旋和疏水性α-螺旋，中间是形成柔性弯曲的谷氨酸-甘氨酸(Glu-Gly)卷曲序列。研究表明，其螺旋-卷曲-螺旋结构对保持高抗菌活性具有特殊的重要性。cecropinP1对革兰氏阴性菌和一部分革兰氏阳性菌都有抗菌活性。

虫茶在我国的生产和饮用有悠久的历史，属我国湘桂黔山区特有的林业昆虫产品，深受东南亚、港澳华侨的青睐，已经成为我国传统出口的名牌特种茶。虫茶是昆虫食叶后排泄的虫粪粒泡制的奇特饮料，入口清香凉爽，余味怡思，润喉益腑，其味甚佳，且具保健功能，是闻名国内外的特种饮用佳茶。

虫茶是利用谷雨前后采集的当地野生苦茶叶，或是化香树、糯米藤、黄连木、野山楂、钩藤等野生植物的鲜嫩叶，稍加蒸煮去除涩味后，待晒至八成干，再堆放在木桶里，隔层均匀地浇上淘米水，再通过制备虫茶的昆虫幼体来食用腐熟清香的叶子，虫体排出的代谢物加工后就成为虫茶。因此，虫茶制备的环境是一种高密度细菌的环境。

目前虫茶制备的过程中使用的昆虫包含有鳞翅目夜蛾科的化香叶蛾、黄纹淡黄蛾、雪疽夜蛾；螟蛾科的米缟螟、黄条谷螟、紫斑谷螟等；通过研究不同昆虫蛋白酶解获得的多肽的抗菌活性，最终筛选获得特定序列的抗菌肽用于进一步研究。

发明内容

本发明提供一种从紫斑谷螟(Pyralis farinalis Linnaeus)老熟幼虫中筛选获得的抗菌肽，并将该抗菌肽用于食品制备研究中。

本发明所提供的抗菌肽，其氨基酸序列为LLVYLHYPLNCPGSLCR(SEQ ID NO:1)；

本发明所提供的抗菌肽，是从紫斑谷螟老熟幼虫中筛选获得的；

本发明的抗菌肽，其制备方法如下：

1)制备匀浆液；将紫斑谷螟老熟幼虫进行清洗，加水进行匀浆，匀浆液酶解后，离心超滤后获得匀浆液；

2)抗菌肽的分离纯化：将步骤1)所制备得到的过滤液经过Sephadex凝胶色谱柱层析，再进行高效液相色谱分离纯化获得本发明的抗菌肽。

本发明所制备的抗菌肽可用于食品领域，用于食品的保存及保鲜。

本发明所提供的抗菌肽对食品保藏领域中常见的腐败菌具有明显的抗性，可用作食品保存用的添加剂来使用，从而避免对健康有害的防腐剂的使用量。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来进一步描述本发明，但本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的技术方案的情况下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，这些修改和替换均落入本发明保护范围内。

实施例1抗菌肽的筛选

1)紫斑谷螟幼虫匀浆液的制备

选取紫斑谷螟的老熟幼虫，老熟幼虫体长22-26mm，头部红褐色，前胸盾片呈褐色，臀板黄褐色，胸部至腹部第一节和腹末2-3节灰黑色且多褶皱，其余各节黄白色。头部可见明显单眼4个，上颚有明显端齿2个。颅中沟与额沟长度比为1:1.气门9对，椭圆形，气门片黑褐色，气门分别位于前胸盾片下和1-8腹节，其中以第8腹节的气门最大，直径约为第7腹节气门的1.5-2倍。5对腹足趾钩前4对全序全环，末一对臀足双序环形或眉形。

选取紫斑谷螟的老熟幼虫，用蒸馏水进行清洗，然后加入2-3倍幼虫质量的水进行匀浆；再加入老熟幼虫重量1～8％的胰蛋白酶，在45℃下酶解12h；然后酶解液在4℃、8000r/min条件下离心30min；然后将上清液以分子量为5000Da的超滤膜对其进行超滤处理，收集超滤液备用。

2)具有抗菌活性多肽的分离纯化

将步骤1)收集的超滤液稀释成蛋白浓度为120mg/ml的溶液，用Sephadex LH-20凝胶色谱柱1.0cm×60cm进行分离纯化，流动相为蒸馏水，洗脱速度为0.4ml/min，220nm测定吸光度，收集每一个洗脱峰，冻干备用。

将收集的每一个洗脱峰的冻干物用PBS缓冲液稀释成100mg/mL的浓度后，用牛津杯法在涂布有大肠杆菌的平板上进行抑菌实验；在37℃培养12h。根据抑菌圈的直径，判断抗菌活性；从而确定具有抗菌活性的洗脱峰。

3)高效液相色谱的分离纯化

用高效液相色谱对具有抗菌活性的洗脱峰的多肽样品进一步分离纯化。色谱条件如下：色谱柱为反相C18键合硅胶柱；流动相：A水(含1％的三氟乙酸)，B乙腈，梯度洗脱条件如表1所示；洗脱的条件如下：流速1.0ml/min，柱温25℃，检测波长为214nm，收集主要色谱峰，冻干备用得到短肽样品，收集活性肽，冷冻干燥后，进行氨基酸序列分析。

表1：高效液相色谱分离条件

4)序列测定

利用氨基酸序列分析仪及质谱仪，对所收集所得组分进行氨基酸序列分析。利用Edman降解法和质谱分析，对所制备的活性肽段进行氨基酸序列分析和分子量测定，其氨基酸序列为LLVYLHYPLNCPGSLCR(SEQ ID NO:1)，分子量为1960Da，命名为PFL-AP。

实施例2抗菌肽PFL-A抗菌活性的测定

检测实施例1筛选的抗菌肽PFL-AP的抗菌性能，其中待检测的菌株为常见的使食物发生腐败的菌株，包含有芽孢杆菌属的枯草芽孢杆菌(革兰氏阳性)、假单胞菌属的荧光假单胞菌(革兰氏阴性)、变形杆菌属的普通变形杆菌(革兰氏阴性)、葡萄球菌属的金黄色葡萄球菌(革兰氏阴性)和大肠埃希氏菌属的大肠杆菌(革兰氏阴性)。

检测的具体步骤如下：

1)菌株处理：将菌种复苏，在固体LB培养基平板中划线，在培养箱中37℃过夜培养。

2)将过夜培养的细菌挑单菌落于含有25ml液体MHB培养基的三角瓶中，将三角瓶放于摇床37℃培养12-18h。将培养后的菌液在OD600的条件下测其吸光度值，用MHB培养基调节菌液浓度，使其处于0.6-0.8之间。之后将菌液稀释成浓度为5×10⁵CFU/mL，依次取90μl加入到96孔板的各孔内。

3)抗菌肽定量后用MHB培养基依次做倍比稀释。

将稀释好的抗菌肽PFL-A各取10μl依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μl。96孔板盖盖后，37℃振荡培养24h后，观察并用酶标仪在600nm处测量并记录实验结果。抗菌肽样品经过二倍稀释后，成一系列浓度，以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)；利用菌液和MHB培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100％。

4、)用微量稀释法测定抗菌肽对多种细菌的最低抑菌浓度，结果如表2所示，

表2：抗菌肽的最低抑菌浓度表

菌株名称	MIC(μg/mL)
		枯草芽孢杆菌	8.126
荧光假单胞菌	3.245
		普通变形杆菌	2.702
金黄色葡萄球菌	9.157
		大肠杆菌	1.245

有上述的结果可看出，本发明所筛选的抗菌肽PFL-AP对常见的食品腐败菌都有抑制效果，其中对于革兰氏阴性菌的抑菌效果明显好于革兰氏阳性菌；

本发明所筛选的抗菌肽PFL-AP可用作食品保存的防腐剂来使用。

序列表

<110> 铜仁职业技术学院

<120> 一种生物抗菌肽及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Leu Val Tyr Leu His Tyr Pro Leu Asn Cys Pro Gly Ser Leu Cys

1 5 10 15

Arg

Claims (5)

1.一种抗菌肽，所述的抗菌肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.如权利要求1所述的抗菌肽其特征在于，所述的抗菌肽是从紫斑谷螟老熟幼虫中筛选获得的。

3.权利要求1所述的抗菌肽，其制备方法如下：

1)制备匀浆液；将紫斑谷螟老熟幼虫进行清洗，加水进行匀浆，匀浆液酶解后，离心超滤后获得匀浆液；

2)抗菌肽的分离纯化：将步骤1)所制备得到的过滤液经过Sephadex凝胶色谱柱层析，再进行高效液相色谱分离纯化获得本发明的抗菌肽。

4.权利要求1所述的抗菌肽在食品领域中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的应用是作为食品保鲜剂的应用。