CN103388014A - 一种亚铁螯合抗菌肽制备方法 - Google Patents

一种亚铁螯合抗菌肽制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种亚铁螯合抗菌肽的制备方法，尤其是带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的制备方法。该方法包括以下步骤：1)将带鱼下脚料加入蒸馏水，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为5.5～6.5；2)将氯化亚铁加入到所述酶解液中，螯合温度为30～50℃，震荡螯合30～60min，离心，去沉淀，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物。为了得到带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的精制品，对所述粗提物进行以下纯化步骤：1)冷冻干燥所述带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物经葡聚糖凝胶层析洗脱分离，有抗菌活性的层析组分再经反向高效液相色谱洗脱，收集洗脱液；2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽。本发明方法具有操作简单、分离提取率高、成本低的特点，可以使带鱼加工废弃物得到高值化利用。

Description

一种亚铁螯合抗菌肽制备方法
技术领域
本发明涉及一种亚铁螯合抗菌肽的制备方法，特别是关于一种带鱼蛋白酶解亚铁螯合抗菌肽的制作方法。
背景技术
带鱼是我国最主要的海产经济鱼类之一，带鱼营养丰富味道鲜美，除直接食用外还可以加工成罐头、即食食品等，但是在加工过程中带鱼的鱼头、鱼骨、内脏等会弃之不用，这部分约占带鱼重量的一半以上。目前对这些脚料的利用多集中于生产动物饲料、制作鱼露、水解蛋白等，但这些下脚料中含有丰富不饱和脂肪酸及优质蛋白质资源，这样的处理方法不仅浪费优质蛋白资源，且生产成本高，若随意的处理也会造成环境的污染。
富含铁元素的食物如动物肝脏中的铁均为三价铁，三价铁是不能为人体所吸收的，必须在体内转化为二价铁之后，人体才能够吸收利用。据世界卫生组织统计，缺铁性贫血已成为一种威胁人类健康的全球性疾病。目前使用的补铁制剂有两种，化学合成的补铁制剂和生物制剂，前者副作用大，而后者价格昂贵。天然蛋白质经水解后可以生成不同大小的小肽和氨基酸，小肽和游离氨基酸与微量元素结合形成的小分子络合物，这些小分子螯合物可通过小肠粘膜上皮细胞直接被机体吸收。近年来关于蛋白水解产物小肽及游离氨基酸与铁离子结合能力评价及促进铁元素吸收等方面的研究已受到普遍关注。在前人的科学研究中还发现亚铁螯合肽具有明显的抗菌抗氧化作用。因此，利用带鱼下脚料蛋白制备有抗菌抗氧化功效的功能性食品或食品配料，既可为带鱼等富含蛋白质的海洋低值鱼资源的深度开发和利用提供理论依据，也为实现带鱼资源的综合利用、提高其附加值开辟新的途径。
发明内容
本发明的目的是提供一种带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的制备方法。
为达到上述目的，本发明包括以下步骤：
1)将带鱼下脚料加入蒸馏水，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为5.5～6.5，酶解8～10h后灭酶，离心，去除沉淀；
2)将氯化亚铁加入到所述酶解液中，螯合温度为30～50℃，震荡螯合30～60min，离心，去沉淀，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物。
对所述粗提物进行一下纯化步骤，可得到纯化的带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽：
1)真空浓缩、冷冻干燥所述带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物分级超滤，抗菌活性高的超滤组分经葡聚糖凝胶层析洗脱分离，有抗菌活性的层析组分再经反向高效液相色谱洗脱，收集洗脱液；
2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽。
在上述过程中，所述带鱼下脚料与木瓜蛋白酶的重量份数比为100∶2～5；所述木瓜蛋白酶酶解温度为30～50℃，酶解时间为8～10h；灭酶温度为90～100℃，灭酶时间为10～20min。
亚铁螯合过程中，所述氯化亚铁与酶解液体积份数之比为1～30∶40(mg∶mL)；螯合温度为30～50℃，震荡螯合30～60min。
真空浓缩带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽粗提物的温度为30～50℃，浓缩时间为6～8h；冷冻干燥温度为-60～-70℃，冷冻时间为24～36h。
葡聚糖凝胶层析柱为Sephadex G25，所述洗脱液为pH 6.8，0.1mol/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为18mL/h。
反向高效液相色谱为XBrigeTMPrep-C18；冷冻干燥温度为-60～-70℃，冷冻时间为24～36h。
本发明研究了带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的分离纯化技术，并对分离纯化的亚铁螯合抗菌肽的活性进行了研究。结果表明：带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度为0.20mg/ml，最小杀菌浓度为0.26mg/ml，扫描电镜结果表明：带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽主要作用金黄色葡萄球菌细胞膜，随着培养时间的延长，原本清晰可见的细胞之间的界限变模糊，菌体细胞粘结在一起，结成团块状；单个细菌细胞表面出现明显的模糊、粗糙区域。说明带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽对金黄色葡萄球菌是通过破坏细胞膜、抑制细菌菌体分裂达到杀菌作用的。
本发明具有以下优点：1、本发明方法实现了制备具有较强抗菌活性的带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽，为生产抗菌肽提供了一个新的途径和方法。2、采用本发明方法生产的抗菌肽，属于天然提取物，具有天然、无毒、无污染、高效抗菌等特点，是一种新型的绿色抗微生物物质。3、本发明操作方便、分离提取率高。4、实施本发明方法的原料带鱼下脚料丰富，可以满足大规模深加工的需要。5、本发明可以使带鱼加工废弃物得到高值化利用，因此本发明具有重要的公共卫生学意义。
附图说明
图1是带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽粗提物的Sephadex G25层析曲线及对应的抑菌活性
图2是带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽反向高效液相色谱XBrigeTMPrep-C18洗脱曲线图及对应的抑菌活性
图3是带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽抑制金黄色葡萄球菌的扫描电镜图
具体实施方式
实施例1  带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的制备
1、带鱼下脚料经碎肉粉碎机粉碎，取10g加入蒸馏水100mL，然后加200mg入木瓜蛋白酶，40℃条件下进行酶解8～10h，加热到90～100℃，灭酶10～20min，3000g离心10min后用滤纸滤去表层油脂，再滤去沉淀。
2、向酶解液中加入氯化亚铁，氯化亚铁与酶解液体积份数之比为1～30∶40(mg∶mL)，在30～50℃下，震荡螯合30～60min，离心，去沉淀，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物。
3、真空浓缩带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽粗提物，40℃，浓缩8h；浓缩物-60℃冷冻干燥24h，得粗提物冻干粉。
4、将螯合抗菌肽粗提物冻干粉经葡聚糖凝胶Sephadex G25过柱分离，洗脱液为pH 6.8，0.1mol/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为18mL/h，收集约180mL洗脱液。
见图1所示，带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物经葡聚糖凝胶Sephadex G25层析柱后有四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100uL进行抗菌实验，抑菌试验显示第一个洗脱峰(F1)有抑菌活性。
5、洗脱峰F1经反向高效液相色谱为XBrigeTMPrep-C18分离出现四个洗脱峰，将各洗脱峰取约100uL进行抗菌实验，抑菌试验显示第二个洗脱峰(见图2F1-2)有抑菌活性。
6、收集洗脱峰F1-2，-60℃真空冷冻干燥24h，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽纯品，在-20℃下保存带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽。
实施例2  带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的抗菌实验
采用牛津杯法，对实施例1带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽进行抗菌活性实验。细菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923。
带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽对金黄色葡萄球菌的最低抑菌浓度如表1所示，最低杀菌浓度结果如表2所示.
表1  带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的最低抑菌浓度
Figure BSA00000724939100031
注：“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长；
表2  带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的最低杀菌浓度
Figure BSA00000724939100041
注：“+”表示有菌落生长，“-”表示无菌落生长。

Claims (7)

1.一种带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
1)将带鱼下脚料加入蒸馏水，然后加入木瓜蛋白酶进行酶解，调整酶解液的pH为5.5～6.5，酶解8～10h后灭酶，离心，去除沉淀；
2)将氯化亚铁加入到所述酶解液中，螯合温度为30～50℃，震荡螯合30～60min，离心，去沉淀，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：对所述粗提物进行一下纯化步骤：
1)真空浓缩、冷冻干燥所述带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽的粗提物，并将所述粗提物经葡聚糖凝胶层析洗脱分离，有抗菌活性的层析组分再经反向高效液相色谱洗脱，收集洗脱液；
2)对所述洗脱液进行真空冷冻干燥，成为带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述木瓜蛋白酶酶解温度为30～50℃，酶解时间为8～10h；灭酶温度为90～100℃，灭酶时间为10～20min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述氯化亚铁与酶解液体积份数之比为1～30∶40(mg∶mL)；螯合温度为30～50℃，震荡螯合30～60min。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述真空浓缩带鱼酶解蛋白亚铁螯合抗菌肽粗提物的温度为30～50℃，浓缩时间为6～8h；冷冻干燥温度为-60～-70℃，冷冻时间为24～36h。
6.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述葡聚糖凝胶层析柱为Sephadex G25，所述洗脱液为pH 6.8，0.1mol/L的磷酸缓冲液，洗脱速度为18mL/h。
7.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述反向高效液相色谱为XBrigeTMPrep-C18；冷冻干燥温度为-60～-70℃，冷冻时间为24～36h。
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Application publication date: 20131113

Assignee: Zhejiang Weihai Food Ingredient Co., Ltd.

Assignor: Zhejiang Ocean University

Contract record no.: 2016330000018

Denomination of invention: Preparation method for ferrous chelated antibacterial peptide

Granted publication date: 20151125

License type: Common License

Record date: 20160309

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Granted publication date: 20151125

Termination date: 20180511