CN105076714A

CN105076714A - 一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法和应用

Info

Publication number: CN105076714A
Application number: CN201410214998.5A
Authority: CN
Inventors: 张宾; 史周荣; 王晓玲; 邓尚贵
Original assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Current assignee: Zhejiang Ocean University ZJOU
Priority date: 2014-05-21
Filing date: 2014-05-21
Publication date: 2015-11-25

Abstract

本发明涉及一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法和应用，取带鱼加工副产物，加入磷酸缓冲液和复合水解酶，控制反应条件制得鱼加工副产物蛋白肽水解液，加入金属元素和少量的V_C保护，形成螯合反应体系，螯合反应结束后，将离心获得的上清液采用超/纳滤截留获得分子量<1500Da水解肽-金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干燥后，得非特异性免疫增强剂。使用时将该非特异性免疫增强剂以800～1500mg/kg的比例加入克氏原鳌虾常规基础营养饲料。该发明利用带鱼加工副产物作为原料，不仅降低了成本，提高了经济效益，且该制备方法操作简单、易控；该免疫增强剂的应用不仅操作简单，且可使虾体更好地摄入和吸收，从而有效增强虾体的免疫机能，更好地抵御各种鳌虾常见病的侵害。

Description

一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法和应用

技术领域

本发明涉及水产养殖技术领域，涉及鳌虾等甲壳类水产动物增强机体免疫功能的方法，尤其涉及一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法和应用。

背景技术

克氏原螯虾（Procambarusclarkii）俗称小龙虾，是目前全世界分布最广的淡水螯虾养殖种类，在我国长江中下游地区均有养殖。克氏原螯虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，具有较高营养和食疗价值，近年来国内外需求量不断上升，致使其养殖总量也逐年增大，2012年，我国克氏原螯虾总产量为55.48万吨，比2011年增加14.09%。近年来，随着现代工业发展，环境污染加剧导致了养殖螯虾虾体免疫机能降低、生长速度变缓、饵料效率下降及病原体疾病频发等问题。

螯虾等甲壳类水产动物抵御外界胁迫因子的最好方法是增强动物机体的免疫功能，如申请号为201310406260.4（申请公告号为CN103431244A）的中国发明专利《一种提供克氏原鳌虾幼虾免疫力的维生素饲料及添加剂》公开了一种维生素饲料，该饲料包括如下按质量百分比计的组分：小麦粉10-30%，玉米粉10-20%，矿物质1-2%，鱼粉10-30%，黄豆粉30-50%，鱼油1-3%，维生素A0.0048-0.0060%，维生素C0.02-0.08%，维生素E0.02-.0.06%，余量为糊精。该饲料及添加剂能提高克氏原鳌虾幼虾的成活率、体重增长率及腮中酚氧化酶的活性，并降低虾肝胰腺中MDA含量，提高其免疫力。

然而，由于鳌虾等甲壳类水产动物的体液中不具有免疫球蛋白，因而其免疫主要为非特异性免疫。蛋白水解肽可与机体必需微量金属元素结合，形成蛋白肽-金属配合物（有机金属化合物），其在提高生物体的生长繁殖、增强抗病免疫力、调节生理代谢等方面都有重要生理作用。Gelinsky等制备了谷胱甘肽及其衍生肽与Zn²⁺的配合物，并证实螯合制备的蛋白肽-Zn²⁺配合物可满足人体对谷胱甘肽的需求。郭存荣等将蛋白肽-Zn²⁺配合物进行罗非鱼养殖试验，发现饲料中添加该配合物显著提高了罗非鱼的生长性能、饲料利用率、血清溶菌酶及SOD活力。Deng等以低值鱼类为原料，经酶解、金属螯合制备了蛋白肽-Fe²⁺配合物，经研究发现制备的配合物具有较强抗氧化和清除自由基活性。目前，关于带鱼加工副产物水解肽-金属配合物，对于克氏原螯虾等甲壳类水产动物生长及非特异性免疫的影响研究，尚未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术而提供一种利用蛋白水解肽-金属配合物的克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法。

本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种上述克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂在增强克氏原鳌虾非特异性免疫方面的应用。

本发明解决第一个技术问题所采用的技术方案为：一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）取带鱼加工副产物，加入磷酸缓冲液，40～50℃保温10～15min，接着经组织打碎、超声处理后，加入2～8g/L复合水解酶，控制温度为水浴恒温37～60℃，水解度为20～30%，前述磷酸缓冲液的浓度为0.05～0.20mol/L，pH值为6.8～7.6，磷酸缓冲液与带鱼加工副产物的体积比为4～6:1，前述复合水解酶为质量比为1～3:1:1的风味蛋白酶、木瓜蛋白酶以及碱性蛋白酶的混合物，前述超声波处理条件为25～40KHZ，时间为1.0～4.0min；

（2）继续升温至85～95℃，保持2.0～3.0min后，冰浴快速冷却至0～4℃，3000～4500r/min离心分离10～20min获得上清液，即为带鱼加工副产物蛋白肽水解液；

（3）调节上述获得的带鱼加工副产物蛋白肽水解液pH值至6.9～7.1，加入终浓度为1.0～3.0g/L的金属元素，同时加入少量的V_C保护，形成螯合反应体系，调节螯合反应体系pH为4.0～7.0，在20～35℃恒温条件下进行水浴振荡，螯合反应20～40min，前述金属元素为Fe²⁺、Ca²⁺、Zn²⁺中的一种或几种混合物；

（4）螯合反应结束后，8000～10000r/min离心分离15～25min，将获得的上清液采用超/纳滤截留获得分子量<1500Da水解肽-金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干燥后，得带鱼加工副产物蛋白水解肽-金属元素配合物，即非特异性免疫增强剂。

本发明解决另一个技术问题所采用的技术方案为：一种如权利要求1所述的克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的应用，其特征在于：所述非特异性免疫增强剂在提高克氏原鳌虾免疫指标的应用。

所述氏原鳌虾免疫指标包括血清以及肝胰腺组织中SOD、PO、LSZ和ACP酶活力，其中SOD（超氧化物歧化酶）是生物体内重要的抗氧化酶，是生物体内清楚自由基的首要物质，可对抗与阻断因氧自由基对细胞造成的损害，并及时修复受损细胞，复原因自由基造成的对细胞伤害；PO（过氧化物酶）主要存在于细胞的过氧化物酶体中，以铁卟啉为辅基，可催化过氧化氢氧化酚类和胺类化合物，具有消除过氧化氢和酚类、胺类毒性的双重作用；LSZ（溶菌酶）主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂，内容物逸出而使细菌溶解，还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活，具有抗菌、消炎、抗病毒等作用；ACP(酸性磷酸酶)主要存在于巨噬细胞，定位于溶酶体内。

本发明中该非特异性免疫增强剂在克氏原鳌虾饲养中的具体应用为：在克氏原鳌虾常规基础营养饲料中，以800～1500mg/kg的比例加入所述非特异性免疫增强剂，作为克氏原鳌虾日常饲喂饵料，通过混加入克氏原鳌虾常规饲料的方式应用该非特异性免疫增强剂，不仅操作简单，并且可使虾体更好地摄入和吸收，从而有效增强虾体的免疫机能，更好地抵御各种鳌虾常见病的侵害。

与现有技术相比，本发明的优点在于：利用带鱼加工副产物（如鱼头、鱼骨、碎肉等）获取蛋白水解肽，再利用螯合反应结合金属元素制备出具有增强克氏原鳌虾免疫功能的蛋白水解肽-金属元素配合物。该发明利用带鱼加工副产物作为原料，不仅降低了成本，提高了经济效益，而且减少了带鱼加工产业对环境的污染，并且该制备方法操作简单、易控，产物得率高；同时该发明中通过添加如鳌虾常规饲料的方式将非特异性免疫增强剂应用于克氏原鳌虾饲养中，不仅操作简单，可使虾体更好地摄入和吸收，从而有效增强虾体的免疫机能，更好地抵御各种鳌虾常见病的侵害。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步详细描述。

实施例1：

取带鱼加工副产物400g，加入1600ml磷酸缓冲液(0.1mol/L，pH7.5)，45℃保温10min，接着组织打碎2.0min，30KHz超声处理2.0min，加入12g复合酶(风味蛋白酶、木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶三者复合比例为1∶1∶1)，将该混合体系置于45℃恒温水浴振荡器中，100r/min充分酶解，控制水解度达到20％后，升温至90℃，保持2.0min后，冰浴快速冷却，4000g离心12min，获得上清液即为带鱼加工副产物蛋白肽水解液。

调节蛋白肽水解液的pH值至7，加入FeCl₂，使Fe²⁺终浓度为1.5g/L，同时加入少量V_C保护，形成螯合反应体系，调节螯合反应体系pH为6.0，在20℃恒温条件下进行水浴振荡，螯合反应30min。螯合反应结束后，9000r/min离心分离20min，将获得的上清液采用实验室纳滤分离设备，纳滤截留获得分子量<1500Da水解肽-金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干燥后，得带鱼加工副产物蛋白水解肽-金属元素配合物，即非特异性免疫增强剂。

实施例2：

取带鱼加工副产物300g，加入1500ml磷酸缓冲液(0.2mol/L，pH7)，40℃保温15min，接着组织打碎2.0min，40KHz超声处理1.0min，加入9g复合酶(风味蛋白酶、木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶三者复合比例为2∶1∶1)，将该混合体系置于37℃恒温水浴振荡器中，100r/min充分酶解，控制水解度达到25％后，升温至95℃，保持2.0min后，冰浴快速冷却，3000g离心20min，获得上清液即为带鱼加工副产物蛋白肽水解液。

调节蛋白肽水解液的pH值至7，加入FeCl₂和ZnCl₂（质量比为1:1），使Fe²⁺和Zn²⁺终浓度为3g/L，同时加入少量V_C保护，形成螯合反应体系，调节螯合反应体系pH为4.0，在30℃恒温条件下进行水浴振荡，螯合反应40min。螯合反应结束后，8000r/min离心分离15min，将获得的上清液采用实验室超滤分离设备，超滤截留获得分子量<1500Da水解肽-金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干燥后，得带鱼加工副产物蛋白水解肽-金属元素配合物，即非特异性免疫增强剂。

实施例3：

取带鱼加工副产物200g，加入1600ml磷酸缓冲液(0.05mol/L，pH6.8)，50℃保温10min，接着组织打碎2.0min，25KHz超声处理1.0min，加入7.2g复合酶(风味蛋白酶、木瓜蛋白酶及碱性蛋白酶三者复合比例为3∶1∶1)，将该混合体系置于60℃恒温水浴振荡器中，100r/min充分酶解，控制水解度达到30％后，升温至85℃，保持3.0min后，冰浴快速冷却，4500g离心10min，获得上清液即为带鱼加工副产物蛋白肽水解液。

调节蛋白肽水解液的pH值至7，加入CaCl₂，使Ca²⁺终浓度为1g/L，同时加入少量V_C保护，形成螯合反应体系，调节螯合反应体系pH为7.0，在35℃恒温条件下进行水浴振荡，螯合反应20min。螯合反应结束后，10000r/min离心分离40min，将获得的上清液采用采用实验室纳滤分离设备，纳滤截留获得分子量<1500Da水解肽-金属元素配合物，经真空浓缩、真空冷冻干燥后，得带鱼加工副产物蛋白水解肽-金属元素配合物，即非特异性免疫增强剂。

实施例4：

本实施例中克氏原鳌虾的基础饲料为：鱼粉37.0%、豆粕28.0%、大豆油2.5%、鱼油2.5%、玉米粉10.0%、小麦粉15.0%、复合维生素及各种矿质元素3.0%、羧甲基纤维素钠2.0%。经测定，基础饲料营养水平为粗蛋白28.5%、粗脂肪6.2%、碳水化合物41.9%、粗灰分8.1%。将以上组分粉碎至60目，将上述非特异性免疫增强剂（本实施例中以蛋白水解肽-Fe²⁺配合物为例，记为TPH-Fe²⁺）添加到上述基础饲料中，添加的终浓度分别为0、600、800、1000、1200、1500mg/kg，加少量水搅拌。采用双螺杆压条机制成直径为1～2mm颗粒饲料，经55℃熟化烘干2h，室温晾干后于4℃冰箱中保存、备用。

克氏原螯虾（Procambarusclarkii）平均体长为5.5±0.2cm，平均体重10.2±0.4g，于室内水族箱（100×50×50cm，15尾/箱，水深15cm，设置瓦片和树枝为遮蔽物）内驯养2周后，挑选健康活泼、体色正常、大小均匀的试验虾种，进行饲喂试验。带鱼（Trichiuruslepturus）加工副产物（含鱼头、内脏、鱼骨及碎肉等），浙江兴业集团有限公司提供。

试验分组：①对照组：基础饲料饲喂；②TPH-Fe²⁺饲喂组1：以添加600mg/kgTPH-Fe²⁺的基础饲料饲喂；③TPH-Fe²⁺饲喂组2：以添加800mg/kgTPH-Fe²⁺的基础饲料饲喂；④TPH-Fe²⁺饲喂组3：以添加1000mg/kgTPH-Fe²⁺的基础饲料饲喂。⑤TPH-Fe²⁺饲喂组4：以添加1200mg/kgTPH-Fe²⁺的基础饲料饲喂；⑥TPH-Fe²⁺饲喂组5：以添加1500mg/kgTPH-Fe²⁺的基础饲料饲喂（以上各组均6个平行饲喂水族箱，15尾螯虾/箱）。

饲养管理：首先采用3～4%食盐水对螯虾浴洗10min，进行虾体消毒。试验期间，控制养殖水体pH7.8～8.0、温度25±0.2℃；静水连续充氧，每日定时更换3/4体积水，并清洁吸污。每天投喂螯虾体重5.0-8.0%饲料，视情况进行适当调整；每天投喂3次，采用定时（06:30、12:30和18:30）、定点（分布均匀，避免争食）投喂方法，同时观察螯虾进食、活动状况。饲喂试验为期60d。

分别在喂食30d和60d结束后，随机从每个组中取10尾螯虾，采集螯虾血和剥离肝胰腺组织并制备血清和肝胰腺匀浆液。血清和肝胰腺匀浆液中超氧化物歧化酶（SOD）、酚氧化酶（PO）、溶菌酶（LSZ）及酸性磷酸酶（ACP），采用南京建成生物公司试剂盒进行测定，具体测定方法及含量计算依据说明书进行，测定结果如表1、表2、表3、表4所示。

SOD作为生物体内清除活性氧反应过程中第一个发挥作用的抗氧化酶，在机体抗氧化酶类中处于核心地位。SOD清除活性氧的能力与生物体的免疫水平密切相关，其活力大小在一定程度上也反应了机体的健康状况。由表1可知，饲喂第0d，螯虾血清和肝胰腺中，SOD酶活性为124.7～125.6和178.4～179.5U/mL。饲喂第30d，添加600～800mg/kgTPH-Fe²⁺对螯虾血清和肝胰腺SOD酶活性，相比于空白组无显著性影响（p>0.05）；添加浓度为1200、1500mg/kg时，TPH-Fe²⁺显著提高螯虾SOD酶活性至144.1～144.6和187.2～187.9U/mL（p<0.05）。饲喂第60d，TPH-Fe²⁺添加量为800～1500mg/kg时，即显著提高了血清和肝胰腺中SOD酶活性（p<0.05）；尤其当浓度为1200～1500mg/kg时，SOD酶活性增幅程度更大。

表1TPH-Fe²⁺对螯虾SOD活性的影响

注：饲喂第0、30、60d，每组实验动物取全虾10尾，分别制备血清、肝胰腺提取液进行SOD活性测定；同列中不同小写字母，表示显著性差异P<0.05。

正常情况下，PO以无活性酚氧化酶原形式，存在于甲壳动物大颗粒血细胞中，一定条件下通过胞吐作用释放，再经一系列过程转变成具有活性的PO，PO再将酚氧化成醌，形成黑色素而发挥免疫作用，这是虾类甲壳动物重要的免疫因子。如表2所示，螯虾饲喂初始（0d）血清和肝胰腺中，PO活性为3.48～3.53和1.19～1.23U/mL。饲喂第30d，与空白组相比，600～1500mg/kgTPH-Fe²⁺对螯虾血清和肝胰腺PO活性（3.85～3.95和1.37～1.43U/mL），无显著性差异（p>0.05）。饲喂第60d，600～1000mg/kgTPH-Fe²⁺对螯虾PO活性无显著性影响（p>0.05）；1500mg/kgTPH-Fe²⁺显著提高了血清中PO活性（4.46U/mL），1200、1500mg/kgTPH-Fe²⁺显著提高了肝胰腺组织中PO活性（1.74～1.76U/mL）（p<0.05）。螯虾血清和肝胰腺组织中PO活性整体相对较低，是由于整个实验过程，严格控制了养殖动物所处环境、水体理化因子等条件，避免了螯虾遭受外界环境、病原体侵染及重金属离子胁迫等影响。

表2TPH-Fe²⁺对螯虾PO活性的影响

注：饲喂第0、30、60d，每组实验动物取全虾10尾，分别制备血清、肝胰腺提取液进行PO活性测定；同列中不同小写字母，表示显著性差异P<0.05。

LSZ广泛存在于生物体血清及其他组织液中，通过切断细菌肽聚糖中β-1,4糖苷键，破坏细胞壁支架致使细胞在渗透压下胀裂死亡。正常虾血淋巴中具有较强溶菌活力，而濒死虾溶菌活性基本丧失^[21]，因此，LSZ活力可作为检测虾体免疫状态的参考指标。如表3所示，空白组螯虾血清和肝胰腺中LSZ活性为41.0～41.5和27.7～28.3U/mL。饲喂第30d，1000～1500mg/kgTPH-Fe²⁺显著提高了螯虾血清（46.7～46.9U/mL）和肝胰腺（30.7～31.3U/mL）中LSZ活性（p<0.05）。饲喂第60d，800～1500mg/kgTPH-Fe²⁺对螯虾LSZ活性，即可表现出显著性增强作用（p<0.05）。由上可知，在30～60d饲喂期内，添加1000～1500mg/kgTPH-Fe²⁺可显著提高螯虾血清和肝胰腺组织中LSZ活力。

表3TPH-Fe²⁺对螯虾LSZ活性的影响

注：饲喂第0、30、60d，每组实验动物取全虾10尾，分别制备血清、肝胰腺提取液进行LSZ活性测定；同列中不同小写字母，表示显著性差异P<0.05。

ACP在生物体内作为机体巨噬细胞的标识酶，活性高低反应了巨噬细胞被激活的程度，其还对生物体钙质吸收、甲壳质分泌及形成等有重要影响。如表4所示。螯虾血清ACP活力比肝胰腺低，这与组织差异性有关；此外，肝胰腺组织作为机体解毒器官和脂肪代谢场所，其水解酶类ACP含量较为丰富，因而ACP活力相对较高。在螯虾血清中，1200～1500mg/kgTPH-Fe²⁺对ACP活力，具有显著地增强作用(p<0.05)；在螯虾肝胰腺组织中，1000～1500mg/kgTPH-Fe²⁺可起到显著提高作用(p<0.05)。

表4TPH-Fe²⁺对螯虾ACP活性的影响

注：饲喂第0、30、60d，每组实验动物取全虾10尾，分别制备血清、肝胰腺提取液进行ACP活性测定；同列中不同小写字母，表示显著性差异P<0.05。

Claims

1.一种克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

2.一种如权利要求1所述的克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的应用，其特征在于：所述非特异性免疫增强剂在提高克氏原鳌虾免疫指标的应用。

3.如权利要求2所述的克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的应用，其特征在于：所述氏原鳌虾免疫指标包括血清以及肝胰腺组织中保护性酶SOD、PO、LSZ和ACP活力。

4.如权利要求2或3所述的克氏原鳌虾非特异性免疫增强剂的应用，其特征在于：在克氏原鳌虾常规基础营养饲料中，以800～1500mg/kg的比例加入所述非特异性免疫增强剂，作为克氏原鳌虾日常饲喂饵料。