CN110714045A - 一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于抗菌肽技术领域。本发明公开了一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其包括前处理、酶解、酶解后处理和提纯等步骤，其中提纯步骤中依次采用C18固相萃取柱、葡聚糖凝胶柱和半制HPLC色谱柱对细点圆趾蟹下脚料酶解产物中抗菌肽进行分离提纯，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。本发明中细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法工艺简单且成本较低；采用C18固相萃取柱、葡聚糖凝胶柱和半制备HPLC分离纯化对细点圆趾蟹下脚料酶解产物中抗菌肽富集分离，操作方便且抗菌肽纯度较高、易于工业化生产，所制备的抗菌肽的抑菌效果较强。

Description

一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法
技术领域
本发明涉及抗菌肽技术领域，尤其是涉及一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法。
背景技术
抗菌肽是一类分子量较小，一般分子量为2000～7000Da，由12～50个氨基酸残基组成，结构较为松散，具有抗菌活性。从第一个不具有完全意义上的抗菌肽Gramicidin被Hotchkiss发现以来，御素、天蚕素、蛙皮素等抗菌肽相继被发现。近十几年来，抗菌肽的功能作用逐渐受到关注。到现在为止，已经有超过5000多种抗菌肽被发现并分离鉴定，且研究数量每年都在快速增加。抗菌肽具有热稳定性、光谱抗菌和不产生耐药性等优点，有望取代抗生素成为一种新型的细菌抑制剂。
近年来，随着海洋资源的衰退与快餐业的高速发展，新的蛋白资源开发迫在眉睫，低值细点圆趾蟹(Ovalipes punctatus)开发利用逐渐进入水产加工者的视野。细点圆趾蟹经蒸煮、人工挑取蟹螯和头胸部的大块蟹肉，再加工成冷冻蟹肉罐头和蟹肉糜。由于细点圆趾蟹具有个头小、肌肉组织松散等特点，加工过程中产生许多含肉下脚料，包括蟹螯、头胸部和腹部残留蟹肉以及难以加工的附肢和小蟹等，这些下脚料中残留的蟹肉若不回收利用，不仅严重浪费蛋白资源，而且也会污染环境。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种能够合理利用细点圆趾蟹下脚料并且具有操作方便、提纯抗菌肽纯度高、易于工业化生产的细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a)前处理：将细点圆趾蟹下脚料粉碎，然后进行脱脂处理、干燥粉碎后制得脱脂下脚料；
b)酶解：将脱脂下脚料加入水制得混合物，液料比为3～5：1(wt：vol)，然后向其中加入0.3～0.4wt％ProteAE peptidase在45～55℃酶解处理4～5小时，制得酶解液；
c)酶解后处理：酶解液灭酶，然后离心处理得到上清液A，将上清液A蒸发浓缩并冷冻干燥制得抗菌肽粗品；
d)提纯：将抗菌肽粗品用三氟乙酸溶解，离心处理制得上清液B，然后用C18固相萃取柱进行富集，收集合并具有抑菌活性的洗脱液，再用葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化，收集合并具有抑菌活性的洗脱峰，最后将具有抑菌活性肽真空浓缩后再经C18色谱柱进行分离纯化，收集合并具有抑菌活性的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。
作为优选，步骤a)前处理具体为，将细点圆趾蟹下脚料粉碎，然后将下脚料按料液比1:4～6(wt：vol)在无水乙醇+正己烷混合溶剂(1：2，vol：vol)中脱脂处理60～90分钟，脱脂处理时温度为45～55℃，抽滤后滤饼在75～85℃下干燥5.5～6.5小时，制得下脚料粉。
作为优选，步骤b)酶解前先将混合物的pH值调至7.8～8.6并在45～55℃水浴中处理0.5～1.5小时。
作为优选，步骤c)具体为，将酶解液在90～100℃下灭酶处理10～20分钟，然后经流水冷却至室温，以4000～6000rpm的转速离心处理8～13分钟得到上清液A，将上清液A 在45～55℃下蒸发浓缩至固形物含量不小于70wt％，-18℃冷冻5h，真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品。
作为优选，步骤d)中，三氟乙酸的浓度为0.08～0.12wt％。
作为优选，步骤d)中，离心处理的转速为8000～12000rpm，处理时间为5～15分钟。
作为优选，步骤d)中，C18固相萃取柱洗脱时，分别依次采用洗脱液含0.1wt％TFA的30wt％乙腈溶液和含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液进行洗脱，流速为1.0～2.0mL/min，收集含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液洗脱的洗脱液。
作为优选，步骤d)中，葡聚糖凝胶柱洗脱时，上样量为5mL，洗脱液为超纯水，洗脱速度为1.0～2.0mL/min，检测波长为220nm，收集合并洗脱48～51分钟区间内的洗脱峰即得洗脱抗菌肽。
作为优选，步骤d)中，HPLC分离纯化时，检测波长为220nm，进样量100μL，流速1～2mL/min，流动相为乙腈和含0.1％三氟乙酸溶液，洗脱方式为梯度洗脱，在30分钟内乙腈含量有30wt％升高到55wt％，收集合并洗脱时间为18～20分钟区间内的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。
因此，本发明具有以下有益效果：本发明中细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法工艺简单且成本较低；采用C18固相萃取柱、葡聚糖凝胶柱和HPLC反相色谱柱对紫贻贝抗菌肽的富集分离，操作方便且抗菌肽纯度较高、易于工业化生产，所制备的抗菌肽的抑菌效果较强，并且具有良好的耐酸碱性、耐热性，具有一定的酶稳定性。
附图说明
图1为酶添加量与液料比响应面示意图；
图2为酶添加量与液料比等高线示意图；
图3为酶添加量与酶解时间响应面示意图；
图4为酶添加量与酶解时间等高线示意图；
图5为液料比与酶解时间响应面示意图；
图6为液料比与酶解时间等高线示意图；
图7为抗菌肽粗品的Sephadex G-15色谱图；
图8为组分c的HPLC色谱图；
图9为组分1和组分2的抑菌效果图。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步的说明。
显然，所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
在本发明中，若非特指，所有的设备和原料均可从市场上购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法，其中记载的百分含量均为重量百分含量。
实施例1
一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a)前处理：将细点圆趾蟹下脚料进行斩拌粉碎，然后将下脚料按料液比1：4(wt：vol)在无水乙醇+正己烷混合溶剂(1：2，vol：vol)中脱脂处理60分钟制得脱脂下脚料，脱脂处理时温度为45℃；然后将脱脂下脚料在75℃下干燥5.5小时，之后粉碎并过75目筛制得下脚料粉；
b)酶解：将脱脂下脚料加入水制得混合物，使液料比为4:1(vol：wt)，将混合物的pH值调至7.8并在45℃水浴中处理1.5小时，然后向其中加入0.30wt％prote AE peptidase(以脱脂下脚料质量计)在45℃酶解处理5小时，制得酶解液；
c)酶解后处理：将酶解液在90℃下灭酶处理20分钟，然后经流水冷却至室温，以4000rpm 的转速离心处理8分钟得到上清液A，将上清液A在45℃下蒸发浓缩至固相物含量不小于 70wt％，-18℃冷冻5h，真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品；
d)提纯：将抗菌肽粗品用浓度为0.08wt％的三氟乙酸溶解，以8000rpm的转速离心处理15 分钟制得上清液B，然后用C18固相萃取柱进行富集，分别依次采用含0.1wt％TFA的30wt％乙腈溶液和含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液进行洗脱，流速为1.8mL/min，收集含0.1wt％TFA 的50wt％乙腈溶液洗脱的洗脱液；将洗脱液真空浓缩至1/3体积后经SephadexG-15色谱柱进一步分离纯化，上样量为5mL，洗脱液为超纯水，洗脱速度为1.5mL/min，检测波长为220nm，收集合并洗脱48～51分钟区间内的洗脱峰得洗脱抗菌肽；接着将洗脱抗菌肽经HPLC分离纯化，色谱条件为：检测波长为220nm，进样量100μL，流速1～2mL/min，流动相为乙腈和含0.1％三氟乙酸溶液，洗脱方式为梯度洗脱，在30分钟内乙腈含量有30wt％升高到55wt％，收集合并洗脱时间为18～20分钟区间内的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。
实施例2
一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a)前处理：将细点圆趾蟹下脚料进行斩拌粉碎，然后将下脚料按料液比1：6(wt：vol)在无水乙醇+正己烷混合溶剂(1：2，vol：vol)中脱脂处理90分钟制得脱脂下脚料，脱脂处理时温度为55℃；然后将脱脂下脚料在85℃下干燥6.5小时，之后粉碎并过85目筛制得下脚料粉；
b)酶解：将脱脂下脚料加入水制得混合物，使液料比为5：1(vol：wt)，将混合物的pH值调至8.6并在50℃水浴中处理1小时，然后向其中加入0.35wt％prote AE peptidase(以脱脂下脚料质量计)，在50℃酶解处理4.5小时，制得酶解液；
c)酶解后处理：将酶解液在100℃下灭酶处理10分钟，然后经流水冷却至室温，以6000rpm 的转速离心处理13分钟得到上清液A，将上清液A在55℃下蒸发浓缩至固形物含量不小于 70wt％，-18℃冷冻5h，真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品；
d)提纯：将抗菌肽粗品用浓度为0.12wt％的三氟乙酸溶解，以12000rpm的转速离心处理5 分钟制得上清液B，然后用C18固相萃取柱进行富集，分别依次采用洗脱液含0.1wt％TFA的 30wt％乙腈溶液和含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液进行洗脱，流速为2.3mL/min，收集含 0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液洗脱的洗脱液；将洗脱液真空浓缩至1/3体积后经Sephadex G-15色谱柱进一步分离纯化，上样量为5mL，洗脱液为超纯水，洗脱速度为2mL/min，检测波长为220nm，收集合并洗脱48～51分钟区间内的洗脱峰得洗脱抗菌肽；接着将洗脱抗菌肽经HPLC分离纯化，色谱分离条件为：检测波长为220nm，进样量100μL，流速2mL/min，流动相为乙腈和含0.1％三氟乙酸溶液，洗脱方式为梯度洗脱，在30分钟内乙腈含量有30wt％升高到55wt％，收集合并洗脱时间为18～20分钟区间内的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。
实施例3
一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，包括以下步骤：
a)前处理：将细点圆趾蟹下脚料进行斩拌粉碎，然后将下脚料按料液比1：5(wt：vol)在无水乙醇+正己烷混合溶剂(1：2，vol：vol)中脱脂处理75分钟制得脱脂下脚料，脱脂处理时温度为50℃；抽滤后滤饼在80℃下干燥6小时，粉碎并过80目筛制得下脚料粉；
b)酶解：将脱脂下脚料加入水制得混合物，使液比料为4：1(vol：wt)，将混合物的pH值调至8.0并在55℃水浴中处理0.5小时，然后向其中加入0.4wt％prote AE peptidase(以脱脂下脚料质量计)，在55℃酶解处理4小时，制得酶解液；
c)酶解后处理：将酶解液在95℃下灭酶处理15分钟，然后经流水冷却至室温，以5000rpm 的转速离心处理10分钟得到上清液A，将上清液A在50℃下蒸发浓缩至固形物含量不小于 70wt％，-18℃冷冻5h，真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品；
d)提纯：将抗菌肽粗品用浓度为0.10wt％的三氟乙酸配制成10mg/mL溶液，10000rpm离心 10分钟制得上清液B，然后用C18固相萃取柱进行富集，分别依次采用洗脱液含0.1wt％TFA 的30wt％乙腈溶液和含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液进行洗脱，流速为2.0mL/min，收集含 0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液洗脱的洗脱液；将洗脱液真空浓缩至1/3体积后经Sephadex G-15色谱柱进一步分离纯化，上样量为5mL，洗脱液为超纯水，洗脱速度为1mL/min，检测波长为220nm，收集合并洗脱48～51分钟区间内的洗脱峰得洗脱抗菌肽；接着将洗脱抗菌肽经HPLC分离纯化，收集合并洗脱时间为18～20分钟区间内的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。色谱分离条件为：检测波长为220nm，进样量100μL，流速2mL/min，流动相为乙腈和含0.1％三氟乙酸溶液，洗脱方式为梯度洗脱，在30分钟内乙腈含量有30wt％升高到 55wt％。
细点圆趾蟹下脚料抗菌肽制备研究：
1细点圆趾蟹抗菌肽制备：
1.1下脚料前处理：
细点圆趾蟹加工下脚料半解冻后放入多功能斩拌机中于4℃下斩拌20min，称取一定量的肉糜于蓝盖瓶中，按料液比1：5(wt:vol)加入无水乙醇+正己烷混合溶剂(1：2，vol：vol)，在 50℃下处理60～90分钟，抽滤后滤饼在80℃下干燥6小时，粉碎并过80目筛制得下脚料粉。
1.2抗菌肽粗品制备：
称取一定脱脂下脚料粉，按液料比为6：1(vol：wt)用超纯水配制成溶液，将溶液pH值调至8.5并在50℃水浴中预热1.5小时后，在prote AE peptidase添加量为0.3wt％(以脱脂下脚料质量计)、酶解温度50℃、酶解时间3小时的条件下进行酶解。待酶解完成后，酶解液于95℃水浴中灭酶15min，冷却后于5000g离心10min制得酶解液；上清液在50℃下蒸发浓缩至固形物含量不小于70wt％，-18℃冷冻5h，真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品；
1.3抗菌肽分离纯化：
1.3.1固相萃取：
将抗菌肽粗品用浓度为0.10wt％的三氟乙酸配制成10mg/mL溶液，10000rpm离心5分钟制得上清液B，然后用C18固相萃取柱进行富集，分别依次用3倍柱体积的含0.1wt％TFA的30wt％乙腈溶液和含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液进行洗脱，流速为2.0mL/min，收集含0.1wt％TFA 的50wt％乙腈溶液洗脱的洗脱液，冷冻干燥后用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成 1mg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，上清液吸取100μl的按照3方法测定其抑菌活性。
1.3.2 Sephadex G-15分离纯化：
上述浓缩洗脱液以10000×g相对离心力离心处理5分钟得到上清液C，然后在SephadexG-15 凝胶柱中分离纯化，收集合并洗脱48～51分钟区间内的洗脱峰冷冻干燥制得抗菌肽粗品B。凝胶柱的参数为，上样量5mL、检测波长220nm、流速1mL/min，洗脱液为去离子水。重复分离多次，收集合并各洗脱峰，冷冻干燥后用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成 1mg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，上清液吸取100μl的按照3方法测定其抑菌活性。
1.3.3 HPLC分离纯化：
用浓度0.01wt％的三氟乙酸溶液将抗菌肽粗品B配制成1mg/mL抗菌肽溶液，以10000×g相对离心力离心处理5分钟得到上清液D并采用C18色谱柱进行分离纯化，收集合并洗脱时间为18～20分钟区间内的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。C18色谱柱参数设定：检测波长220nm，色谱柱温为25℃，洗脱液为乙腈和0.01％三氟乙酸溶液，流速0.4mL/min，上样体积100μL；采用梯度洗脱方法，在30min内乙腈浓度由30％提高到55％。重复分离多次，收集合并各洗脱峰，冷冻干燥后用0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成400μg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，上清液吸取100μl的按照3方法测定其抑菌活性。
2工艺优化：
以其酶解产物抑菌活性的影响。在此基础上，采用响应面试验获得最适酶解工艺条件。
2.1单因素试验：
细点圆趾蟹下脚料酶解的基本条件为：液料比3：1(vol：wt)、prote AE peptidase添加量为 0.3％(以脱脂下脚料粉质量计)、初始pH值8.5、酶解温度50℃、酶解时间3h。在此条件下，分别考察不同酶解时间(1h、2h、4h、6h)、不同液料比(2：1、4：1、6：1、8：1)和不同胰蛋白添加量(0.1％、0.2％、0.3％、0.4％、0.5％)对其水酶解产物抑菌效果的影响。在prote AEpeptidase添加前，底物混合液先在酶解温度下预热0.5h，待酶解结束后，酶解液在95℃下灭酶处理15分钟，流水冷却至室温，5000rpm离心10分钟，上清液在50℃下蒸发浓缩至固形物含量不小于70wt％，-18℃冷冻5h，真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品。用0.1mol/L pH4.0乙酸-乙酸钠缓冲液配制成1mg/mL多肽溶液，12000×g离心10min，按3方法考察上清液的抑菌圈大小变化。
2.2响应面试验：
根据Box-Behnken的中心组合实验设计原理，基于单因素试验结果的基础上选择酶解时间、液料比和酶添加量为自变量，以酶解产物抑菌圈直径为因变量建立三因素三水平的中心组合试验，如表1所示。
表1三因素水平编码表
Figure RE-RE-GDA0002265710420000071
3抑菌效果测定：
采用琼脂打孔法，取100μL 8.0log CFU/mL麦氏比浊法稀释的菌悬液均匀涂布于营养琼脂平板中，用灭菌打孔器
Figure RE-RE-GDA0002265710420000072
打孔，每孔分别加入100μL酶解产物/抗菌肽溶液，4℃放置 60min，37℃培养16～18h后，采用十字交叉法用游标卡尺测量抑菌圈直径。以无菌0.1mol/L pH 4.0乙酸-乙酸钠缓冲液为阴性对照，根据抑菌圈直径大小判断多肽对受试菌的抑菌效果。
细点圆趾蟹下脚料抗菌肽提取研究结果与分析：
1单因素试验结果：
1.1酶解时间：
表2显示，随着咩姐时间的延长，酶解产物抑菌圈直径也逐渐增大。酶解4h的酶解产物抑菌圈直径最大，即为13.02mm；进一步延长酶解时间其酶解产物的抑菌圈直径却减小。由此可知，酶解时间为4h左右较合适。
表2酶解时间对酶解产物抑菌圈直径的影响
酶解时间/h 1 2 4 6
抑菌圈直径/mm 7.03 9.04 13.02 12.91
1.2液料比：
由表3可以看出，在低的液料比时，酶解产物抑菌圈直径显著减小，当液料比由4:1增大至 8:1时，酶解产物抑菌圈直径却无显著增大。综上所述，液料比在4:1左右较适宜。
表3液料比对酶解产物抑菌圈直径的影响
料液比 2:1 4:1 6:1 8:1
抑菌圈直径/mm 12.39 13.66 13.61 13.65
1.3酶添加量：
表4反映了，随着酶添加量的增加，酶解产物抑菌圈直径也逐渐增大。其中，酶添加量为0.3％时，酶解产物抑菌圈直径最大，即为13.71mm，进一步提高酶添加量，酶解产物抑菌圈直径却减小，但无显著变化。因此，酶添加量在0.3％左右较适合。
表4酶添加量对酶解产物抑菌圈直径的影响
Figure RE-RE-GDA0002265710420000073
Figure RE-RE-GDA0002265710420000081
2响应面试验优化结果：
2.1回归方程建立及显著性分析：
根据Design-Expert 8.0.6软件中的Box-Behnken模式设计响应面试验，试验结果见表5。进行多元回归拟合分析，得到回归方程： y＝-3.1335-138.665A-0.23925B+16.438C-7.6AB-4.7AC-0.045BC+316.4A2+0.36B2-1.566C2。对其进行方差分析,结果见表6。由表6可知，回归模型的F值为，P<0.0001(极显著)，失拟项P＝0.316>0.05，相关系数R2＝0.9871，Adj-R2＝0.9704，CV＝1.21％，表明模型对该试验的拟合效果较好,可以真实地反映出考察因素对考察指标的影响。综上所述,该模型可用于优化细点圆趾蟹下脚料抗菌肽酶法制备工艺参数。
表5响应面试验方案及结果
Figure RE-RE-GDA0002265710420000082
根据表6中的F值可看出，考察因素对细点圆趾蟹酶解产物抑菌圈直径影响由大到小依次为酶解时间(C)、液料比(B)和酶添加量(A)。由表3中的P值可知，模型中B对细点圆趾蟹酶解产物抑菌圈直径的影响显著(P<0.05)；模型中C、AB、A2、B2和C2对细点圆趾蟹酶解产物抑菌圈直径的影响极显著(P<0.01)。
表6拟合二次多项式模型的方差分析
Figure RE-RE-GDA0002265710420000083
Figure RE-RE-GDA0002265710420000091
注：p-value>0.05，不显著；p-value<0.01，极显著，**；0.01<p-value<0.05，显著，*
2.2交互作用分析：
图1～图6直接反映了两因素间有相互影响的三维抑菌圈直径效果图，可以看出两因素对因变量的影响情况，曲面倾斜度越高说明两因素交互作用越显著。其中，因素AB对抑菌圈直径大小的影响极显著，曲面的坡度陡峭，等高线宽度大；酶添加量和酶解时间的交互作用、液料比和酶解时间的交互作用对抑菌圈直径的影响不显著(P>0.05)，曲面弯曲不明显，等高线宽度较小。这一结果与表6的分析结果一致，相互验证。
2.3验证试验：
经响应面分析，模型计算得到最适酶解理论条件为：液料比4:1(vol:wt)、prote AEpeptidase 添加量为0.35％(以脱脂下脚料粉质量计)、初始pH值8.5、酶解温度50℃、酶解时间4.5h。在此条件下，其抑菌圈直径理论值为15.32mm，按最适酶解理论条件进行试验，测得酶解产物抑菌圈直径实际值为14.94±0.07mm，相对误差为0.38±0.07mm，相对误差较小，说明模型较为准确，实际值略小于理论值，可能是由于采用麦氏比浊法测菌悬液中受试菌菌量不准确性造成的，最终导致实际酶解物抑菌圈直径偏小。
3分离纯化：
3.1固相萃取：
采用Sep-Pak C18固相萃取柱富集酶解产物中抑菌肽，结果显示，含0.1wt％TFA的50wt％乙腈溶液洗脱出的多肽具有抑菌活性，其抑菌圈直径为15.34mm，表明细点圆趾蟹下脚料酶解产物抑菌活性可能是多肽的存在。
3.2 Sephadex G-15分离：
图7显示，上述经过Sephadex G-15分离获得3个组分，分别为组分a、组分b和组分c，其含量为13.58％、47.03％和39.09％，其抑菌圈直径分别为0.22mm、1.08mm和12.83mm(>7mm)，表明组分c具有抑菌活性，进一步表明酶解产物中存在抗菌肽。因此，后续试验对组分c进一步分离。
3.3制备HPLC分离：
从图8可以看出，组分c经HPLC分离获得组分1和组分2，其含量分别为42.66％和57.04％。图9为组分1和组分2抑菌试验结果，表明两组分均具有抑菌活性，组分1和组分2抑菌圈直径分别为12.12mm和14.40mm。
应当理解的是，对于本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
a）前处理：将细点圆趾蟹下脚料粉碎，然后进行脱脂处理、干燥粉碎后制得脱脂下脚料；
b）酶解：将脱脂下脚料加入水制得混合物，液料比为3～5：1，然后向其中加入0.3～0.4wt% ProteAE peptidase在45～55℃酶解处理4～5小时，制得酶解液；
c）酶解后处理：酶解液灭酶，然后离心处理得到上清液A，将上清液A蒸发浓缩并冷冻干燥制得抗菌肽粗品；
d）提纯：收集合并具有抑菌活性的洗脱液，再用葡聚糖凝胶色谱进行分离纯化，收集合并具有抑菌活性的洗脱峰，最后将具有抑菌活性肽真空浓缩后再经C18色谱柱进行分离纯化，收集合并具有抑菌活性的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。
2.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤a）前处理具体为，将细点圆趾蟹下脚料粉碎，然后将下脚料按液料比4～6：1在无水乙醇和正己烷混合溶剂中脱脂处理60～90分钟，脱脂处理时温度为45～55℃，抽滤后滤饼在75～85℃下干燥5.5～6.5小时，制得下脚料粉。
3.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤b）酶解前先将混合物的pH值调至7.8～8.6并在45～55℃水浴中处理0.5～1.5小时。
4.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤c）具体为，将酶解液在90～100℃下灭酶处理10～20分钟，然后经流水冷却至室温，以4000～6000rpm的转速离心处理8～13分钟得到上清液A，将上清液A在45～55℃下蒸发浓缩至固形物含量不小于70wt%，-18℃冷冻5h，真空冷冻干燥处理制得抗菌肽粗品。
5.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）中，三氟乙酸的浓度为0.08～0.12wt%。
6.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）中，离心处理的转速为8000～12000rpm，处理时间为5～15分钟。
7.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）中，C18固相萃取柱洗脱时，分别依次采用洗脱液含0.1wt%TFA的30wt%乙腈溶液和含0.1wt%TFA的50wt%乙腈溶液进行洗脱，流速为1.0～2.0mL/min，收集含0.1wt%TFA的50wt%乙腈溶液洗脱的洗脱液。
8.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）中，葡聚糖凝胶柱洗脱时，上样量为5mL，洗脱液为超纯水，洗脱速度为1.0～2.0mL/min，收集合并洗脱48～51分钟区间内的洗脱峰即得洗脱抗菌肽。
9.根据权利要求1所述的一种细点圆趾蟹下脚料抗菌肽的制备方法，其特征在于：
所述步骤d）中，HPLC分离纯化时，检测波长为220nm，进样量100μL，流速1～2mL/min，流动相为乙腈和含0.1%三氟乙酸溶液，洗脱方式为梯度洗脱，在30分钟内乙腈含量有30wt%升高到55wt%，收集合并洗脱时间为18～20分钟区间内的洗脱峰，制得细点圆趾蟹下脚料抗菌肽。
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