KR20190033141A

KR20190033141A - 꽃게 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도

Info

Publication number: KR20190033141A
Application number: KR1020170121556A
Authority: KR
Inventors: 남보혜; 김영옥; 김동균; 공희정; 박중연; 서정길
Original assignee: 대한민국(관리부서:국립수산과학원)
Priority date: 2017-09-21
Filing date: 2017-09-21
Publication date: 2019-03-29
Also published as: KR101985663B1

Abstract

본 발명은 항균 활성이 우수한 꽃게(swimming crab) 유래의 항균 펩타이드를제공한다.

Description

꽃게 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도{Antimicrobial Peptides derived from swimming crab and uses thereof}

본 발명은 항균 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 꽃게 유래의 항균 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.

항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)는 그람 양성균 및 그람 음성균, 곰팡이, 바이러스 및 기생충에 대해서도 광범위한 항균 활성을 갖는 펩타이드와 작은 단백질 그룹으로 본질적으로 보편적이고 모든 다세포 생물, 미생물, 식물 및 동물은 AMP를 분비하는 선천적 면역 방어 시스템을 가지고 있다. 내인성 AMP는 감염이 발생했을 때 생산되며 신속하고 효율적인 방어의 첫 번째 라인을 구성하여 동식물의 조직에 노출된다. 상기 펩타이드는 광범위한 스펙트럼의 항균 활성을 가지며 다제 내성 세균(multidrug-resistant bacteria)에 대한 공동 대응으로 수복 및 적응 면역 반응(adaptive immune responses)을 일으킬 수 있다. AMP의 전형적인 특징은 순 양이온 성 전하(net cationic charge), 소수성(hydrophobicity) 및 양친 매성이다. 이러한 AMP의 새로운 합성 유사체(synthetic analogues)를 다자인하는데 있어 다양한 전략이 적용되었는데 진핵 세포에 대한 항균 활성을 높이고 독성을 감소시키는 새로운 AMP를 개발하기 위해 많은 연구가 사슬 길이(chain length), 순 전하(net charge), 소수성(hydrophobicity) 및 구조의 변형을 채택하고 있다. 특정한 위치에서 특정 아미노산 또는 단편의 존재에 항균 활성을 연관시키는 서열-기반 접근법은 AMPs의 새로운 유사체를 설계 할 때 다양한 전략 중에서 직접적이고 효율적인 방법으로 설계가 간단하고 보통 높은 수준의 계산 기술을 필요로 하지 않는다(Le et al., Sci. Rep. 5, 9761, 2015).

한편, 항 지질 다당류 인자(Anti-lipopolysaccharide factors, ALFs)는 중요한 항균 펩타이드 군에 속하며 해양 협각류(chelicerate) 및 갑각류에서만 배타적으로 분포한다. ALF는 일반적으로 4-가닥 β-시트에 대항하여 채워진 3개의 알파-나선 구조로 구성되는 보존된 3차원 구조를 공유하며 일군의 친수성 및 소수성 잔기가 존재하는 2개의 보존된 시스테인(cysteins) 잔기 사이의 이황화결합(disulphide bond)에 의해 형성되는 보존된 LPS 결합 도메인(LBD)을 포함한다. 이러한 LBD에 해당하는 많은 합성 펩타이드는 항균 활성 또는 항-바이러스 활성을 가지고 있고 전체 분자의 기능을 모방하는데 사용되는데, 아직 유의한 항균 활성을 나타내지 않는 몇몇 LBD 펩타이드가 여전히 존재한다. LBD의 아미노산 외에도 LBD 외부의 일부 아미노산도 항균 작용에 참여할 것으로 예측되어 왔다. 일부 합성 양이온성 LBD 펩타이드는 박테리아 세포벽을 파괴하여 고효율의 항균 활성을 나타낸다(Jaree et al., Dev. Comp. Immunol. 38(4):554-560, 2012).

그러나, 상기 선행기술의 경우, 펩타이드의 분리 시 수율이 높지 않아 충분한 항균활성을 나타내지 않고 잠재적인 독성 등의 요인으로 균일한 효과를 기대하기 어렵다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 항균 활성이 우수한 꽃게 유래의 항균 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열(MARVLLRLIRL) 내에서 선택되며, 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열(RVLLRL)을 포함하는, 항균 펩타이드가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물이 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상기 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제가 제공된다.

상기한 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따르면, 다양한 균주에 대한 항균활성을 나타내는 꽃게 유래의 항균 펩타이드 생산효과를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 이차 구조 예측에 사용되는 GOR 알고리즘(Ver.4)을 이용하여 두 개의 모체 펩타이드인 ALF-2N과 ALF-6N의 아미노산 서열을 나타내고 있다.
도 2는 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A(FRLMLRLLRW) 및 ALF-6A (MARVLLRLIRL)의 2차 구조에서 소수성 및 친수성 영역을 예측한 그림이다.
도 3은 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A를 실험균주 E. coli, B. cereus 및 C. albicans에 처리하고 항균 활성을 관찰한 사진이다
도 4는 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A에 pH 또는 열처리 후 실험 균주 B. cereus에 대한 항균 활성을 관찰한 사진이다.
도 5는 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A에 pH 또는 열처리 후 실험 균주 E. coli에 대한 항균 활성을 관찰한 사진이다.
도 6은 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A에 pH 또는 열처리 후 실험 균주 C. albicans에 대한 항균 활성을 관찰한 사진이다.
도 7은 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A에 염분 처리 후 실험 균주 E. coli, B. cereus 및 C. albicans에 대한 항균 활성을 관찰한 사진이다.
도 8은 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A를 대장균 ML35p에 처리하여 사멸 운동 연구(killing kinetic study)를 분석한 그래프이다.
도 9는 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A를 유당 투과 효소가 결핍된 대장균 ML35에 처리하여 내부 막 투과 분석을 수행한 그래프이다.
도 10은 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A의 DNA에 대한 펩타이드의 결합 능력을 관찰한 겔 사진이다.
도 11은 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A의 DNA 중합 효소 활성 억제 여부를 관찰한 겔 사진이다.
도 12는 본 발명의 항균 합성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A를 실험균주(C. albicans, E. coli 및 S. aureus)에 처리 후 형태의 변화를 현미경으로 관찰한 사진이다.

용어의 정의:

본 문서에서 사용되는 용어 "항균 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)" 는 원핵생물부터 포유동물까지 모든 유형의 살아있는 생물체에 존재하는 선천적 면역체계(innate immune system)의 최전방 생체 방어인자이다. 항미생물성 펩타이드는 특정 미생물이나 항원에 반응하는 후천면역과는 달리 미생물의 종류에 크게 상관없이 작용하며 반응시간도 바로 혹은 몇 시간 내로 매우 빠르다. 내성균의 문제를 항상 내포하고 있는 기존의 항생제와 구분되어 내성의 문제 또는 면역문제나 거부반응의 문제없이 광범위한 생물계에서 미생물로부터 숙주를 보호하기 위해 자연적으로 생성되는 천연물로 기존의 항생제 대체 가능성이 기대되는 잠재적 약물 후보군이다(Hancock et al,, Curr Dr㎍ Targets Infect Disord. Mar;2(1):79-83. 2002). 최근에는 유전체(genomic)/전사체(transcriptome) 데이터베이스 정보에서 항박테리아 또는 살균 활성을 가지는 단백질의 아미노산 서열에 기반하여 신규한 AMP를 설계해 왔다(He et al., Insect Biochem Mol Biol. Feb;37(2):135-46. 2007).

본 문서에서 사용되는 용어 "항 지질 다당류 인자(Anti-lipopolysaccharide factors, ALFs)"는 중요한 항균 펩타이드 군에 속하며 해양 킬레이트 제 및 갑각류에서만 독점적으로 분포한다. 첫 번째 ALF는 투구게 (Limulus polyphemus)에서 확인되었으며 새우, 가재, 바닷가재, 담수산 새우, 게와 같은 많은 갑각류 종으로부터 수많은 ALF 동족체(homologs)가 보고되었다.

본 문서에서 사용되는 용어 "신호 펩타이드(signal peptide)"는 분비 경로를 향하는 다수의 새로 합성된 단백질의 N-말단에 존재하는 짧은(5-30 아미노산 길이) 펩타이드로 이들 단백질은 소포체(endoplasmic reticulum), 골지체(golgi) 또는 엔도좀(endosome)과 같은 특정 세포 소기관 내부에 존재하거나, 세포로부터 분비되거나, 대부분의 세포막에 삽입되는 단백질을 포함하며 항균 펩타이드와 신호 펩타이드는 구조상 공통적인 특징을 나타낸다. 대부분의 신호 펩타이드는 전좌(translocation) 동안 폴리펩타이드의 적절한 토폴로지(topology)를 시행하는데 도움을 줄 수있는 아미노산의 짧은 양전하 스트레치(n-region)로 시작하며, 신호 펩타이드의 코어는 단일 알파-나선(h-region)을 형성하는 경향있는 긴 소수성 아미노산(5-16 잔기 길이)의 긴 스트레치를 포함한다.

본 문서에서 사용되는 용어 "꽃게(swimming crab)"는 전 해역에 분포하며, 수심 2~110 m의 모래나 모래진흙 바닥에 서식한다. 갑각은 초록색을 띤 연한 청색이거나 짙은 청색이고, 집게다리에는 보라색 바탕에 흰점무늬가 있다. 남해안에서는 몸 전체가 보라색인 개체도 흔히 나타난다. 이마에는 3개의 작은이가 있으나 노령의 개체에서는 중간의 것이 없어져 2개로 보이기도 한다. 포란기는 4~8월이며, 조에아유생 4기를 거치고, 수명은 약 3년으로 추정된다.

발명의 상세한 설명:

상기 항균 펩타이드에 있어서, C-말단이 아미드화될 수 있고 서열번호 4 내지 10 및 12로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성될 수 있다.

상기 항균 조성물에 있어서, 그람 음성균, 그람 양성균 및 진균에 대한 항균활성을 가질 수 있고 상기 그람 양성균은 Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus iniae, 또는 S. mutans일 수 있고 상기 그람 음성균은 Escherichia coli 또는 Pseudomonas aeruginosa일 수 있으며 상기 진균은 Candida albicans일 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드의 유효량은 환자의 환부의 종류,적용부위, 처리회수, 처리시간, 제형, 환자의 상태, 보조제의 종류 등에 따라 변할수 있다. 사용량은 특별히 한정되지 않지만, 0.01μg/kg/day 내지 10 mg/kg/day일일 수 있다. 상기 1일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일(數日) 간격으로 간헐(間歇)투여해도 된다.

본 발명의 항균 펩타이드는, 조성물 총 중량에 대하여 0.1-100 중량%로 함유될 수 있고 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 또한, 약학적 조성물의 제조에는 고체 또는 액체의 제제용 첨가물을 사용할 수 있다. 제제용 첨가물은 유기 또는 무기 중 어느 것이어도 된다. 부형제로서는 예를 들면 유당, 자당, 백당, 포도당, 옥수수 전분(cornstarch), 전분, 탈크, 소르비트, 결정 셀룰로오스, 덱스트린, 카올린, 탄산칼슘 및 이산화규소 등을 들 수 있다. 결합제로서는 예를 들면 폴리비닐알코올, 폴리비닐에테르, 에틸셀룰로오스, 메틸셀룰로오스, 아라비아고무, 트래거캔스(tragacanth),젤라틴, 셀락(shellac), 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 구연산칼슘, 덱스트린 및 펙틴(pectin) 등을 들 수 있다. 활택제로서는 예를 들면 스테아린산마그네슘, 탈크, 폴리에틸렌글리콜, 실리카, 경화식물유 등을 들 수 있다. 착색제로서는 통상 의약품에 첨가하는 것이 허가되어 있는 것이라면 모두 사용할 수 있다. 이들의 정제, 과립제에는 당의(糖衣), 젤라틴코팅, 기타 필요에 따라 적절히 코팅할 수 있다. 또한, 필요에 따라 방부제, 항산화제 등을 첨가할 수 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며(예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판;Mack Publishing Company, Easton PA), 제제의 형태는 특별히 한정되는 것은 아니다. 이들 제형은 모든 제약 화학에 일반적으로 공지된 처방서인 문헌[Remington's Pharmaceutical Science, 15^th Edition, 1975, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania 18042(Chapter 87: Blaug, Seymour)에 기술되어 있다.

본 발명의 항균 펩타이드는 경구 또는 비경구로 투여되는 것이 가능하며, 바람직하게는 비경구 투여로 정맥내 주입, 피하 주입, 뇌실내 주입(intracerebroventricular injection), 뇌척수액내 주입(intracerebrospinal fluid injection), 근육내 주입 및 복강 주입 등으로 투여할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 항균 펩타이드의 고안 및 특성 예측

본 발명의 신규 항균 펩타이드(AMP)를 개발하기 위해, 꽃게의 ALF(NCBI accession No. AFA42334)로부터 유사 펩타이드를 고안하였다. 구체적으로, 상기 꽃게의 ALF(Liu et al., Fish Shellfish Immunol., 34(2): 463-470, 2013)에 대하여 펩타이드의 2차 구조를 GOR 알고리즘(Ver.4)(ExPASy)을 사용하여 분석하였다.

상기 분석결과, 꽃게의 ALF 단백질 중 LBD는 무작위 코일(random coil)과 연장된 가닥(extended strand)을 나타냈고 51-60번째 아미노산 위치에 존재하는 것으로 확인되어 이를 ALF-2N(FRVMPRLRSW, 서열번호 1)으로 명명하였고, 신호 펩타이드는 1-11번째 아미노산 위치에 존재하며 무작위적 코일 및 알파-나선 구조를 가지고 있었으며, 이를 ALF-6N(MARVLLRLIRL, 서열번호 2)으로 명명하였다(도 1). 상기 예측된 2차 구조를 바탕으로 항균활성을 나타내는데 가장 이상적인 구조로 알려져 있는 α-헬릭스(α-helix) 구조를 취하게 하였으며, C-말단의 아미드화 (amidation) 및 아미노산 치환(amino acid substitution) 방법으로 ALF-2N와 ALF-6N 각각의 유도체인 ALF-2A(FRLMLRLLRW, 서열번호 3) 및 ALF-6A(MARVLLRLIRL, 서열번호 4)를 고안하고, 이들의 이차구조 역시 Schiffer-Edmundson 나선 륜 투사법을 이용하여 예측하였다(도 2). 상기 도 2에서 생성된 나선 륜 다이어그램은 EMBOSS Pepwheel(유럽 생물정보학 연구소, Cambridge, UK)(Ref)를 사용하여 생성하였다. 아울러, ProtParam 툴(ExPASy)(Ref)을 사용하여 분자량, 이론적인 등전점(pI), 순 전하량(net charge), 소수성, 보만 지수, 불안정성 지수(instability index) 및 지방족 지수(aliphatic index)를 예측한 후 모체 펩타이드 생화학적 성질을 비교하였다.

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이, 상기 ALF-2A는 모 펩타이드인 ALF-2N과 등전점 및 순 전하량이 동일한 반면, 소수성 및 보만 지수는 ALF-2N보다 낮았다. ALF-6A는 모 펩타이드인 ALF-6N보다 더 높은 등점점과 순 전하량을 갖는 것으로 확인되었다. 상기 펩타이드들은 Anygen사(Gwangju, Korea)에 의뢰하여 고상 펩타이드 합성법에 의해 합성되었다.

펩타이드 명칭	서열(서열번호)	M.W.	p.I.	순전하	소수성(kcal/mol)	보만 지수(kcal/mol)	불안정성지수
ALF-2N	FRVMPRLRSW-NH₂(1)	1347.65	12.3	+3	-0.41	3.15	108.6
ALF-2A	FRLMLRLLRW-NH₂(2)	1403.80	12.3	+3	-3.02	1.74	104.8
ALF-6N	MARVSLLLIVL-NH₂(3)	1227.61	9.5	+1	-1.53	-1.68	12.59
ALF-6A	MARVLLRLIRL-NH₂(4)	1353.78	12.3	+3	-0.11	1.08	37.82

실험예 1: 합성 펩타이드의 항균 활성 분석

본 발명자들은 상기 실시예 1에서 합성된 모체 펩타이드(ALF-2N 및 ALF-6N)와 유도체(ALF-2A 및 ALF-6A)의 항균활성을 분석하였다.

상기 항균활성분석은 종래에 보고된 바와 같이 초민감성 방사 확산 분석(ultrasensitive radial diffusion assay, URDA)을 통해 수행하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338: 1998~2004, 2005). 항균활성 분석 대상 균으로는 그람양성균으로 Bacillus cereus ATCC21772, Staphylococcus aureus ATCC6538, Streptococcu siniae FP5229, 및 S. mutans KCTC3065를 사용하였고, 그람음성균으로는 Escherichia coli KCTC1116 및 Pseudomonas aeruginosa KCTC2004를 사용하였으며 및 진균인 효모로는 Candida albicans KCTC7965를 사용하였다.

구체적으로, 박테리아 균주는 적절한 온도조건에서(P. aeruginosa 및 S. iniae는 25℃ 및 다른 균주는 37℃) 뇌-심장 주입 배지(BHI; BD Biosciences, San Jose, CA, USA)에서 배양하였고 효모 균주 C. albicans는 25ㅀC의 효모 배지에서 배양하였다. 대략 16-18 시간 배양한 후에 상기 박테리아 및 C. albicans 현탁액은 C. albicans를 위한 ~10⁶ CFU/mL 및 박테리아를 위한 ~10⁸ CFU/mL에 해당하는 McFarland 혼탁도 표준 0.5(Vitek Colorimeter #52-1210; Hach, Loveland, CO, USA)에 희석하였다. 상기 희석된 박테리아 또는 C. albicans 현탁액의 500-mL 분취량(aliquot)을 0.03% Tryptic Soy Broth(TSB) 또는 0.03% Sabouraud Dextrose Broth(SDB) 및 1% type I low-EEO 아가로즈를 첨가한 10 mM PBS(pH 6.6)에서 5×10⁶ CFU/mL 또는 5×10⁴ CFU/mL을 포함하는 언더레이 겔(underlay gel) 9.5 mL을 첨가하였다. 그 후, 상기 정제된 펩타이드를 5μL의 산성화 수(0.01 % HAc)에서 2 배로 연속 희석하였고, 각 희석액을 1mm 두께의 언더레이(underlay) 겔에서 제조된 2.5 mm 직경의 웰에 첨가하였다. 그 후, 25℃(P. aeruginosa, S. iniae 및 C. albicans) 또는 37℃ (다른 균주)에서 3 시간 동안 배양한 후 박테리아 또는 효모 현탁액을 10 mL 10 % PBS (pH 6.6) 및 1% 아가로즈를 사용하여 6 % BHI 또는 6 % YM을 포함하는 10 mL 이중 강도 오버레이 겔로 상기 언더레이 겔에 적층(overlay)하였다. 이어서, 플레이트를 추가로 18-24 시간 동안 배양한 후, 투명영역(clearing zone) 직경을 측정하였고 웰의 직경을 빼고, 투명영역 직경을 단위(0.1 mm = 1 U)로 나타내었다. 상기 합성 펩타이드의 최소 유효농도(MEC, μg/mL)는 펩타이드 농도의 log10에 대한 상기 기술된 단위의 플롯의 x-절편으로 계산하였고 항균 분석은 3회 실시한 결과를 평균하였다.

그 결과, 모체 펩타이드인 ALF-2N과 ALF-6N에서는 항균활성을 확인할 수 없었으나(data not shown), 각각의 유도체인 ALF-2A와 ALF-6A에서는 탁월한 항균활성이 관찰되었다. ALF-2A는 그람 양성균 B. cereus , S. aureus, 및 S. iniae(MECs 1.51-1.93 ㎍/mL) 및 그람-음성균 P. aeruginosa 및 E. coli(MECs 1.87-1.98)에 대하여 5 ㎍/mL의 펩타이드 농도에서 최소효과농도의 항균활성을 나타내었고 ALF-6A는 5 ㎍/mL의 펩타이드 농도에서 그람 음성균 B. cereus, S. aureus, 및 S. iniae(MECs 1.49-2.3 ㎍/mL) 및 그람-음성균 P. aeruginosa 및 E. coli(MECs 1.72-1.19 ㎍/mL)에 대하여 최소효과농도의 항균활성을 나타내었다. 따라서 C. albicans에 대한 ALF-2A 및 ALF-6A의 최소효과농도는 각각 2.11 및 1.95 ㎍/mL으로 나타났다. 본 발명에서 합성한 항균 펩타이드의 최소효과농도(MECs) 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

미생물		최소 효과 농도	(μg/mL)
미생물		ALF-2A	ALF-6A
그람양성균	B. cereus ATCC21772	1.51	1.88
	S. aureus RM4220	1.87	1.79
	S. iniae FP5229	1.93	2.3
	S. mutans KCTC3065	1.73	1.49
그람음성균	P. aeruginosa KCTC2004	1.98	1.72
그람음성균	E. coli KCTC1116	1.87	1.79
효모	C. albicans KCTC7965	2.11	1.95

실시예 2: 소형화 ALF 펩타이드 유도체의 제조

상기 실시예 1에서 합성된 두 가지 항균 펩타이드(ALF-2A 및 ALF-6A) 모두 광범위의 강력한 항균활성을 나타냈으나, ALF-2A의 불안정지수가 ALF-6A보다 높았기 때문에, 본 발명자들은 ALF-6A를 더욱 유력한 항균제 후보물질로 선정하였고, 상기 ALF-6A의 활성 최소부위를 확인하고자 하였다. 이에, 본 발명자들은 ALF-6A의 N-말단 및/또는 C-말단의 1 내지 4개의 아미노산이 결실된 결실 변이체들을 고안 및 합성하였다(표 3 참조). 상기 결실 변이체들의 서열, 예상 분자량, 예상 등전점, 순 전하량, 소수성, 불안정성 지수, 보만 지수는 하기 표 3에 나타내었다.

한편, 상기 ALF-2A 및 ALF-6A를 포함한 본 발명의 펩타이드의 합성은 Anygen Co., Ltd.(Gwangju, Korea)의 고상(solid-phase) 펩타이드 합성 방법을 사용하여 수행하였다. 상기 펩타이드는 산성화된 증류수에 용해하였고 사용 전까지 -20℃에 보관하였다.

서열번호	펩타이드	서열	분자량	p.I.	순전하량	소수성(kcal/mol)	불안정성지수	보만 지수(kcal/mol)
4	ALF-6A	MARVLLRLIRL(-NH₂)	1353.79	12.3	+3	-0.11	37.82	1.08
5	ALF-6A1	-ARVLLRLIRL(-NH₂)	1222.59	12.3	+3	0.12	28.26	1.43
6	ALF-6A2	MARVLLRLIR-(-NH₂)	1240.62	12.3	+3	0.45	40.60	1.68
7	ALF-6A3	-ARVLLRLIR-(-NH₂)	1109.43	12.3	+3	0.68	30.29	2.13
8	ALF-6A4	--RVLLRLIR-(-NH₂)	1038.35	12.3	+3	0.51	32.83	2.63
9	ALF-6A5	-ARVLLRLI--(-NH₂)	953.24	12.0	+2	-0.31	32.83	0.53
10	ALF-6A6	--RVLIRLI--(-NH₂)	882.16	12.0	+2	-0.3	36.09	0.87
11	ALF-6A7	---VLLRLI--(-NH₂)	725.97	9.72	+1	-1.11	40.43	-1.46
12	ALF-6A8	--RVLLRL---(-NH₂)	769.004	12.0	+2	0.01	40.43	1.84
13	ALF-6A9	---VLLRL---(-NH₂)	612.816	9.72	+1	-0.8	46.52	-0.77
14	ALF-6A10	--RVLLR----(-NH₂)	655.844	12.0	+2	0.57	46.52	3.19

실험예 2: 결실변이체의 항균 활성 분석

상기 실시예 2에서 제조된 ALF-6A의 결실 변이체들에 대한 항균활성 분석을 상기 실험예 1과 동일한 방법으로 수행하였다(도 3).

그 결과 도 3에 도시된 것과 같이 항균활성의 최소단위는 ALF-6A의 세 번째 아미노산(아르기닌)부터 8번째 아미노산(류신)까지의 헥사펩타이드(RVLLRL, 서열번호 12)인 것으로 확인되었다. 특히 세 번째 아미노산인 아르기닌 또는 8번째 아미노산인 류신이 제거될 경우 항균활성은 완전히 상실되는 것으로 나타났으며, 상기 헥사펩타이드의 항균활성은 ALF-6A와 버금가는 것으로 확인되었다. 다만, 그람 양성균인 B. cereus에 대한 항균활성은 펩타이드의 길이가 짧아질수록 낮아지는 것으로 확인되었다.

실험예 3: 항균 활성에 미치는 pH, 온도, 염분의 영향

본 발명의 항균활성 펩타이드 ALF-2A 및 ALF-6A 활성에 있어 NaCl(0.5%, 1.0%, 1.5%, and 2.0%) 첨가, pH(5.0, 6.0, and 7.0) 및 온도(80℃)의 영향은 URDA을 사용하여 계산하였다. 또한, 다른 pH에서 열적 안전성(thermal stability)을 조사하기 위해 상기 펩타이드(5㎍/mL)를 50 mM 초산나트륨 버퍼(pH 5.0 및 pH 6.0) 또는 Tris-HCl 버퍼(pH 7.0)에 용해시킨 후 80℃에서 6시간 동안 배양하였고 냉각시킨 후 B. cereus, E. coli, 및 C. albicans에 대한 URDA에 사용하였다. 아울러, 염분 효과를 조사하기 위해, 언더레이 배지는 원하는 농도(0.5%, 1.0%, 1.5%, and 2.0%)의 NaCl을 첨가하였고 각각의 미생물을 배지에 첨가하였으며 플레이트를 24시간 동안 배양한 후, 억제 영역(zones of inhibition)을 측정 하였다.

그 결과, 상기 합성한 펩타이드의 항균 활성은 실험 균주에 대한 강력한 항균 활성으로 입증된 바와 같이 pH 또는 열처리에 의해 크게 변화되지 않는 것을 확인하였고(도 4 내지 6) 염화나트륨 농도에 따라 영향을 받았는데 특히, C. albicans에 대한 항균 활성 ALF-2A 및 ALF-6A는 배지에서 각각 1.5% 및 1.0% 염화나트륨(sodium chloride)에서 완전히 소실되는 것을 관찰하였다(도 7)

실험예 4: 사멸 운동 실험(Killing kinetic study)

본 발명의 ALF 유사체의 억제 모드(inhibition mode)를 평가하기 위해 MECs와 MECs의 5 배에서 E.coli ML35p에 대한 사멸 운동 연구를 수행 하였다.

구체적으로 E.coli ML35p을 하룻밤 동안 배양한 후 10⁶ CFU/mL의 세포 농도가 되도록 TBS에 희석하였고 각각 현탁액의 1 mL을 각각의 ALF 유사체와 대조군 피시딘에 노출시키고 37℃에서 하룻밤 동안 배양한 후 수득한 콜로니를 계수하였다. 그 후, 사멸 비율을 ALF 펩타이드 유사체 첨가 전의 존재하는 박테리아 수와 비교하여 ALF 펩타이드 유사체 첨가에 따른 주어진 시간에서 살아있는 박테리아의 비율로 계산하였다. 각각의 박테리아 대조군 배양을 ALF 펩타이드 유사체 없이 배양하고 데트트 배양의 분석 시간에 따른 시간 포인트에서 분석하였고 사멸운동 분석을 3회 수행한 후 결과의 평균값을 구하였다.

그 결과, 본 발명의 항균활성 펩타이드 유사체(ALF-2A 및 ALF-6A) 및 대조군 피시딘(piscidin) 1은 E.coli ML35p를 5×MEC에서 5분 이내 및 1×MEC에서 10분 이내에 매우 빠르게 사멸시키는 것을 확인하였다(도 8).

실험예 5: 내부 막 투과성 분석

본 발명의 항균활성 펩타이드 유사체(ALF-2A 및 ALF-6A)의 박테리아 내부 막 투과 활성을 확인하기 위해 o-nitrophenyl-β-D-galactoside(ONPG)와 총 뉴클레오타이드 누출(total nucleotide leakage)을 대장균(E. coli)에서 수행하였다. 구체적으로 발색 기질(chromogenic substrate)로 ONPG를 사용하여 유당 투과 효소(lactose permease) 결핍 균주인 E.coli ML35p의 β-갈락토시다아제(galactosidase) 활성을 측정함으로써 결정하였다. 요약하면, E.coli ML35p의 하룻밤 배양액에 β-갈락토시다아제의 발현을 유도하기 위해 1 mM IPTG를 포함한 fresh Lauri-Bertanni(LB)를 접종하였고 각 시점(0, 10, 20, 30, 40, 50, 및 60 분)에서 상등액을 수집하였으며 ONPG를 최종 농도 0.4 mM로 첨가하고 37℃에서 10분 동안 배양하였다. β-갈락토시다아제에 의한 ONPG의 분할시 생성된 ONP는 A405 값으로서 분광 광도계(spectrophotometer)로 검출하였다.

그 결과, 항균활성 펩타이드 유사체(ALF-2A 및 ALF-6A)에 노출된 후, 상등액에서 A₄₀₅ 값(β-갈락토시다아제 활성)의 급격한 증가가 0 내지 60분에서 관찰되었고 ALF-2의 활성은 carb-ALF-6 보다 높게 나타났다(도 9).

실험예 6: DNA 결합 분석

본 발명의 항균활성 펩타이드(ALF-2A 및 ALF-6A)에 대한 DNA 결합 분석은 아가로즈 겔(agarose gels)을 통한 DNA 밴드의 이동 속도의 억제를 평가하기 위해 수행하였다. 먼저, 상용 분자량 마커, λ-HindⅢ-digested DNA(50 ng)(Roche, Basel, Switzerland)를 0.01% 아세트산(acetic acid)에서 다양한 양의 펩타이드(0, 0.156, 0.313, 0.625 및 1.25 ㎍)와 혼합하였고 실온에서 5분간 배양한 후, 0.5 ㎍/mL에 브롬화 에티듐(EtBr)을 함유하는 1.0 % 아가로즈 겔에서 전기영동하였다.

그 결과, 전기영동 이동 변화 분석(EMSA)에서 DNA의 전기영동 이동성은 복합체가 아닌 DNA와 비교하여 1.25 μg에서 ALF-2A와 ALF-6A에 의해 거의 완전히 억제되는 것으로 나타났다(도 10).

실험예 7: DNA 중합 효소 저해 분석

본 발명의 항균활성 펩타이드(ALF-2A 및 ALF-6A)가 DNA 중합 효소 활성을 억제하는지 여부를 결정하기 위해, DNA 중합 효소 저해 분석을 수행하였다. 구체적으로, ALF-2A 및 ALF-6A를 1000 ㎕/ml의 농도로 0.01% 아세트산에 용해시켰고 PCR 억제(PCR inhibition)를 평가하기 위해, 다양한 농도의 ALF-2A 또는 ALF-6A(2.5, 1.25, 0.625, 0.313 ㎍/mL)를 각각의 반응 혼합물에 첨가하였다. 그 후, 대장균 게놈 DNA(100 ng)는 16S-F1(서열번호 15) 및 16S-R3(서열번호 16) 프라이머 세트를 이용한 PCR 증폭을 위한 주형으로 사용하였다. PCR 반응 조건은 95 ℃에서 30초, 55℃ 30초 및 72℃ 1분의 조건으로 30 사이클로 수행하였고 상기 조건에 다른 예측된 반응산물(amplicon)은 약 1.5 kb 길이로 PCR 후에 모든 반응산물은 EtBr를 포함하는 1.0% 아가로즈 겔에서 전기영동하였다.

그 결과, ALF-2A는 모든 실험 농도(0.313-2.5 ㎍)에서 완전한 억제활성을 나타내었으나 ALF-6A는 ALF-2A와 비교하여 1.25 ㎍에서 낮은 억제 활성을 나타내었다(도 11). 상기 PCR 증폭에 사용된 프라이머에 대한 정보를 하기 표 4에 나타내었다.

프라이머	핵산서열(5'->3')	서열번호
16S-F1	CTCCTACGGGAGGCAGCAG	15
16S-R3	CCAGGGTATCTAATCCTG	16

실험예 9: 주사 전자 현미경(SEM)

본 발명의 항균활성 펩타이드(ALF-2A 및 ALF-6A) 처리효과에 따른 미생물의 형태를 현미경으로 관찰하였다. 구체적으로, 현미경 관찰을 위해 ALF-6A를 처리 후 C. albicans의 형태를 SEM으로 관찰하였고 C. albicans의 중간-대수기(Mid-logarithmic phase) 배양액을 제조한 후 495 ㎕의 신선한 여과 PBS 완충액에 재현탁하였다. 그 후, C. albicans를 5 ㎍/ml의 ALF-6A와 2 시간 동안 혼합하고 즉시 수거하였고 처리되지 않은 세포를 대조군으로 사용하였다. 상기 수집된 세포를 0.1M 인산완충액(pH 7.4)에서 2.5 %(V/V) 글루타르알데히드(glutaraldehyde)에서 하룻밤 동안 고정하였고 0.1 M 인산완충액(pH 7.4)으로 3회 세척하였으며 등급 에탄올 시리즈(30, 50, 70, 90, 95, and 100 %)로 탈수하였다. 이어서, 임계점(critical point) 건조 후 1 cm 스터브(stubs)에 올려 놓고 Sputter coater(Q150T, Quorum)를 사용하여 백금-코팅하였고 SEM(SUPRA-55VP, Carl Zeiss)을 사용하여 SE2 모드(ETH = 5 kV)에서 시료를 관찰하였다.

그 결과, 대조군과 비교하여, ALF-2A 또는 ALF-6A로 처리한 미생물에서 세포질 함량의 누출에 의해 유발될 수 있는 수축(shrinkage)이 관찰되었다(도 12).

결론적으로, 본 발명의 꽃게(swimming crab) 항 지질 다당류 인자(ALFs)로 부터 유래한 항균활성 펩타이드 유사체(ALF-2A 및 ALF-6A)는 pH 또는 열처리에 안정적이고 그람 양성균 및 그람 음성균에 대한 우수한 항균 활성을 나타내었으므로 기존의 항생제를 대체할 수 있는 항생제 대체재 개발이나 항충제 개발을 위한 후보물질로 활용 가능할 것으로 판단된다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Republic of Korea represented by National Fisheries Research & Development Institute <120> Antimicrobial Peptides derived from swimming crab and uses thereof <130> PD17-5516 <160> 16 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-2N <400> 1 Phe Arg Val Met Pro Arg Leu Arg Ser Trp 1 5 10 <210> 2 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-2A <400> 2 Phe Arg Leu Met Leu Arg Leu Leu Arg Trp 1 5 10 <210> 3 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6N <400> 3 Met Ala Arg Val Ser Leu Leu Leu Ile Val Leu 1 5 10 <210> 4 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A <400> 4 Met Ala Arg Val Leu Leu Arg Leu Ile Arg Leu 1 5 10 <210> 5 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A1 <400> 5 Ala Arg Val Leu Leu Arg Leu Ile Arg Leu 1 5 10 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A2 <400> 6 Met Ala Arg Val Leu Leu Arg Leu Ile Arg 1 5 10 <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A3 <400> 7 Ala Arg Val Leu Leu Arg Leu Ile Arg 1 5 <210> 8 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A4 <400> 8 Arg Val Leu Leu Arg Leu Ile Arg 1 5 <210> 9 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A5 <400> 9 Ala Arg Val Leu Leu Arg Leu Ile 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A6 <400> 10 Arg Val Leu Ile Arg Leu Ile 1 5 <210> 11 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A7 <400> 11 Val Leu Leu Arg Leu Ile 1 5 <210> 12 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A8 <400> 12 Arg Val Leu Leu Arg Leu 1 5 <210> 13 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A9 <400> 13 Val Leu Leu Arg Leu 1 5 <210> 14 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> ALF-6A10 <400> 14 Arg Val Leu Leu Arg 1 5 <210> 15 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S-F1 <400> 15 ctcctacggg aggcagcag 19 <210> 16 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 16S-R3 <400> 16 ccagggtatc taatcctg 18

Claims

서열번호 4로 기재되는 아미노산 서열(MARVLLRLIRL) 내에서 선택되며, 서열번호 12로 기재되는 아미노산 서열(RVLLRL)을 포함하는, 항균 펩타이드.
제1항에 있어서,
C-말단이 아미드화된, 항균 펩타이드.
제1항에 있어서,
서열번호 4 내지 10 및 12로 구성되는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열로 구성되는, 항균 펩타이드.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항균 조성물.
제4항에 있어서,
그람 음성균, 그람 양성균 또는 진균에 대한 항균활성을 갖는, 항균 조성물.
제5항에 있어서,
상기 그람 양성균은 Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Streptococcus iniae, 또는 S. mutans인 항균 조성물.
제5항에 있어서,
상기 그람 음성균은 Escherichia coli 또는 Pseudomonas aeruginosa인, 항균 조성물.
제5항에 있어서,
상기 진균은 Candida albicans인, 항균 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 항균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제.