KR20130109544A - 전복 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 어류 병원성 미생물에 대하여 효율적인 항미생물 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 인체 및 어류의 적혈구에 대한 용혈활성은 거의 없기 때문에, 양식어류에 대한 사료첨가제로 사용되거나, 항생제 대체제로 사용되더라도 어류 및 인체의 건강에 대한 위협요소를 제공하지 않는다.

Description

전복 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도{Novel antimicrobial peptide from the Abalone，Haliotis discus discus，and uses thereof}

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 전복 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

항미생물성 펩타이드는 생물체의 선천성 면역체계(innate immune system)의 최전방 생체 방어인자이다. 항미생물성 펩타이드는 특정 미생물이나 항원에 반응하는 후천면역과는 달리 미생물의 종류에 크게 상관없이 작용하며 반응시간도 바로 혹은 몇 시간 내로 매우 빠르다. 내성균의 문제를 항상 내포하고 있는 기존의 항생제와 구분되어 내성의 문제 또는 면역문제나 거부반응의 문제없이 광범위한 생물계에서 미생물로부터 숙주를 보호하기 위해 자연적으로 생성되었기에 이들 항미생물성 펩타이드들은 천연 항생제라고 불린다.

해양생물인 연체동물의 경우는 피부 그리고 아가미 등이 항상 물과 접하고 있다. 물은 세균, 바이러스 및 독성을 지닌 화학물질을 전달하는 매개체로 연체동물들은 병원 미생물의 약간의 접촉에 의해서도 피부 및 몸이 벗겨져 나갈 정도로 약한 구조를 지니고 있다. 어류 및 연체동물은 직접 호흡에 관련하는 PGL(primary gill lamella)와 이들 양 측면에 나뭇잎 모양의 SGL(secondary gill lamella)로 구성된 아가미 구조 또한, 가스 교환 이외에 염분과 물의 교환 조절, 질소계 노폐물의 배출 등 다양한 기능을 가지고 있기 때문에 이 부분이 미생물의 침입을 받아 파괴되면 심각한 생리 기능 장애를 동반하게 된다. 이러한 심각한 상황에 대처하기 위해 면역계가 발달되지 않은 무척추동물계에서 선천성 면역체계는 생체 내에 침입하는 외부로부터의 이물질을 제거하는 생체방어기전에 우선적으로 관여한다. 예를 들어, 아가미에는 생체를 물리적으로 보호하는 동시에 침입한 미생물을 살균하는 효과를 제공하는 점액질이 존재하고 있다.

전복은 단백질과 비타민이 풍부하여 예부터 고급수산물로 취급되었으며, 옛날부터 식용으로 해온 좋은 보양식으로 널리 알려진 수산물로서, 전복을 이용한 이전 연구에서 전복 추출물로부터의 항미생물성 및 항바이러스 활성이 검출되었으나, 아직까지 물질이 정제된 바는 없었다(Li C., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 103, 522-524, 1960; Li C. et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 109, 534-538, 1962). 다른 종류의 연체동물의 조직으로부터 직접 항미생물 활성 물질을 정제한 경우는 일부에 지나지 않는다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998~2004, 2005; Iijima et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 305~31, 2003; Charlet et al., J. Biol. Chem., 271, 21808~21813, 1996; Hubert et al., Eur. J. Biochem., 240, 302~306, 1996; Li et al., Fish Shellfish Immunol., 22,663~672, 2007)

전복 추출물로부터의 항미생물성 및 항바이러스 활성이 검출되었으나, 아직까지 항미생물 활성을 갖는 단일 성분에 대해서 보고된 바는 없는 실정이다. 또한 추출물로부터 단일 성분을 분리하는 과정은 분리시 소요되는 시간이 길며, 획들율이 낮으며, 천연물이 가지는 잠재적 독성 등의 요인들로 균일한 효과 및 규격화를 기대하기 어렵다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 전복으로부터 유래한 항미생물 활성을 갖는 신규 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 항미생물 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 제공된다.

상기 펩타이드는 전복(Haliotis discus discus)으로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 그람 양성균은 바실러스 섭틸러스(Bacillus subtilis), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) 일 수 있으며, 상기 그람 음성균은 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 및 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)일 수 있다.

상기 펩타이드에 있어서, 상기 펩타이드는 사람 및 어류의 적혈구 세포를 파괴하지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 암호화하는 유전자가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제가 제공된다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 전복(Haliotis discus discus)으로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 유효 투여량은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 제공된다.

상기 사료첨가제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 전복(Haliotis discus discus)으로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 사료첨가제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량% 로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 어류가 양식되고 있는 수조의 물에 직접 살포하는 것도 가능하다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 전복 아가미 추출물로부터 정제된 펩타이드는 항미생물 효과를 나타낼 뿐만 아니라, 적혈구 세포에 대하여 용혈반응을 거의 나타내지 않기 때문에, 양식어류에 대한 사료첨가제로 사용되거나, 사람에게 적용할 수 있는 항생제 대체제로 사용되더라도 어류 및 인체의 건강에 대한 위협요소를 제공하지 않는다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 전복 아가미 추출물의 B. subtilis KCTC1021 및 Streptococcus iniae FP5229에 대한 항미생물 활성을 URDA 방법을 이용하여 확인한 도이다.
도 2는 전복 아가미 추출물의 이온교환 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다.
도 3은 상기 도 2에서 최대 활성 피크값을 나타낸 분획물을 역상 HPLC 컬럼을 이용하여 분리한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 4는 상기 도 2 및 3의 2단계 HPLC 방법을 통하여 정제된 아미노산의 분자량을 MALDI-TOF MS 스펙트로미터를 이용하여 분석한 그래프이다.
도 5는 상기 도 2 및 3의 2단계 HPLC 방법을 통하여 정제된 아미노산 서열을 단백질 서열분석기를 통하여 분석한 서열번호 1의 서열을 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 일실시예를 통하여 확인된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 서열을 NCBI BlastP를 이용하여 검색한 후, ClustalX 프로그램을 이용하여 상기 검색된 서열을 정렬한 결과를 나타낸 그림이다.

본 문서에서 사용되는 용어를 정의하면 하기와 같다.

본 발명에서 사용되는 용어 "변이체"는 하나 또는 둘 이상의 염기가 돌연변이 예를 들면 치환, 결실, 부가, 삽입 등에 의해 변화되었으나, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 생물학적 성질을 유지하는 펩타이드를 의미한다.

이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 도면에 도시된 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 도면에 도시된 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.

도 1은 전복 아가미 추출물의 B. subtilis KCTC1021 및 Streptococcus iniae FP5229에 대한 항미생물 활성을 URDA 방법을 이용하여 확인한 도이다. 본 발명의 일 실시예를 통하여 추출된 전복 아가미 추출물이 미생물 및 어류 병원균에 대하여 항미생물 활성을 나타내고 있음을 확인하였다.

도 2는 전복 아가미 추출물의 이온교환 HPLC 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 본 발명의 일 실시예에 따른 전복 아가미 추출물을 SP-5PW (7.5 x 75 mm, Tosho, Japan) 컬럼을 이용하여 분리한 후, 10 mM 인산완충액(pH 6.0)에 용해된 NaCl을 0~1.0M 농도구배로 100분 동안 1 ㎖/분의 속도로 처리하여 용출시켰으며, 상기 용출물은 220 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과, 약 0.72M의 NaCl 농도에서 용출된 분획물에서 최대 활성이 관찰되었다(화살표 표시).

도 3은 상기 도 2에서 최대 피크값을 나타낸 분획물을 역상 HPLC 컬럼을 이용하여 분리한 결과를 나타낸 그래프이다. CapCell-Pak C₁₈ column (4.6 x 250 mm, Shiseido, Japan)에 0.1% TFA를 포함하는 100% 아세토나이트릴(CH3CN)을 5~35% 농도구배로 30분 동안 1 ㎖/분의 속도로 처리하여 용출시켰으며, 상기 용출물은 220 nm 파장에서 흡광도를 측정한 결과, 아세토나이트릴 약 19% 농도에서 용출된 분획물에서 최대 피크값이 관찰되었다. 도 2 및 3은 2단계 HPLC 방법을 통하여 최대 활성을 나타내는 물질을 정제하였으며, 이렇게 정제된 아미노산의 특성을 확인하였다.

도 4는 상기 도 2 및 3의 2단계 HPLC 방법을 통하여 정제된 아미노산의 분자량을 MALDI-TOF MS 스펙트로미터를 이용하여 분석한 그래프이다. HPLC 방법을 통하여 수득된 최대 활성을 갖는 펩타이드의 1차 구조를 확인하기 위하여, MALDI-TOF MS 스펙트로미터를 이용하여 분석한 결과 4763.9 Da의 분자량이 나타났다.

도 5는 상기 도 2 및 3의 2단계 HPLC 방법을 통하여 정제된 아미노산 서열을 단백질 서열분석기를 통하여 분석한 서열번호 1의 서열을 나타낸 도이다.

도 6은 본 발명의 일실시예를 통하여 확인된 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 상동성(homology)을 갖는 서열을 NCBI BlastP를 이용하여 검색한 후, ClustalX 프로그램을 이용하여 상기 검색된 서열을 정렬한 결과를 나타낸 그림이다. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 동정하기 위하여 NCBI BlastP를 이용하여 상동성을 갖는 서열을 검색하여 ClustalX 프로그램을 이용하여 alignment를 수행한 결과, 인간, 소, 토끼, 및 오리너구리 유래의 히스톤 H1의 N-말단과 높은 유사성을 나타냈다. 이러한 결과를 종합하여 보면, 본 발명의 일 실시예를 통하여 동정된 서열번호 1의 아미노산은 히스톤 H1 유래 펩타이드인 것으로 판단되었다.

이하, 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예 및 실험예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예 및 실험예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1. 전복 아가미 조직 추출물의 제조

전복(Haliotis discus discus)(국립수산과학원 전략양식연구소 육종연구센터로부터 분양받음)의 아가미 조직을 적출한 후, 적출한 아가미 조직과 1%의 초산용액(v/v)을 1:4(v/v)의 비율로 혼합하고 5분간 100℃에서 가열하였다. 가열된 조직은 얼음 속에서 냉각시킨 후, 균질기(Speed #3, Polytron PT1200 C homogenizer; Kinematica AG, Lucerne, Switzerland)를 이용하여 완전히 조직을 파쇄한 후, 4oC, 15,000 X g 조건에서 30분 동안 원심분리를 하여 상층액을 분리하였다.

실시예 2. 항미생물 활성 펩타이드의 정제

2단계 HPLC 방법을 사용하여 상기 실시예 1의 전복 아가미 추출물로부터 항미생물 활성 펩타이드를 분리하였다. 첫 번째 HPLC 단계에서는 이온 HPLC 컬럼인 SP-5PW(7.5 x 75 mm, Tosho, Japan)을 이용하여 정제한 후, 가장 큰 활성을 나타내는 0.72 M NaCl 농도에서 용출된 활성분획을 두 번째 HPLC 단계에서 역상 HPLC 컬럼인 CapCell-Pak C₁₈ column(4.6 x 250 mm, Shiseido, Japan)에 적용시켜 분리하였으며, 이때 각 단계의 조건은 하기 표 1과 같다(표 1 참조).

그 결과, 1 단계 HPLC 분석시 약 0.72 M NaCl 농도에서 용출된 분획에서 피크를 나타냈으며(도 2), 상기 분획물을 이용하여 두 번째 HPLC 분석을 수행하여, 약 14분대에 가장 큰 활성을 나타내는 단일 물질이 정제되었다(도 3).

2단계의 HPLC 조건

1 단계 HPLC	2 단계 HPLC
A용매: 10 mM 인산완충액(pH 6.0) B용매: 10 mM 인산완충액(pH 6.0)/1.0 M NaCl B용매의 농도구배: 0 →1.0 M NaCl (100 분) 유속: 1.0 ㎖/분 파장: 220 nm 온도: 실온	A용매: 0.1% TFA(Trifluoroacetic acid ) 수용액 (pH 2.2) B용매: 0.1% TFA를 포함하는 100% CH3CN (pH 2.2) B용매의 농도구배; 5 → 35% (30 분) 유속; 1.0 ㎖/분 파장; 220 nm 온도; 실온

실험예 1. 전복 아가미 추출물의 항미생물 활성 측정

고감도 방사확산 분석(Ultrasensitive radial diffusion assay, URDA) 방법을 사용하여 Bacillus subtilis KCTC1021와 Streptococcus iniae에 대한 항미생물 활성을 측정하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 338, 1998~2004, 2005). B. subtilis KCTC1021와 Streptococcus iniae 균주를 37℃ 또는 25℃에서 18시간 동안 TSB(Trypticase soy broth)에서 약 16시간 동안 배양한 후, 상기 배양액을 ~10⁸ CFU/㎖에 상응하도록 McFarland 표준혼탁도 0.5 (Vitek Colorimeter #52-1210; Hach, Loveland, CO, USA)가 되도록 희석하였다. 상기 희석액은 각각 0.5 ㎖을 9.5 ㎖의 깔개 겔(underlay gel)[10 mM 인산 완충액(pH 6.57), 0.03% TSB(tryptic soy broth) 및 1% I형 한천(low EEO)]에 혼합하여 5 X 10⁶ CFU/㎖로 조정한 후 직경 10 cm, 높이 1.5 cm 평판 접시에 도포하였으며, 그 결과 1 mm 높이의 겔이 형성되었다. 그 후, 상기 평판 접시 내에 형성된 겔에 직경 2.5 mm 크기로 구멍을 뚫어 웰(well)을 만들었다. 실시예 1의 추출물을 각각 5 ㎕ HAc(0.01% HAc)에 2배 순차희석한 후, 각각의 희석액을 1 mm 두께의 깔개 겔 내에 형성된 직경 2.5 mm의 웰에 첨가한 후, 37℃ 또는 25℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양된 현탁액 위에 10 mM 인산완충용액(pH 6.57)에 6% TSB, 및 1% 한천을 포함하는 강도 두 배의 덮개 젤 10 ㎖을 도입시킨 후, 37℃ 또는 25℃에서 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 다음 날 웰 주위에 형성된 투명 지역(clear zone)의 직경을 측정함으로서 활성을 확인 하였다. 웰의 투명 지역(clear zone)의 직경에서 웰의 직경을 제한 값을 유니트(U)로 환산하였고 합성 펩타이드의 최소 효과 농도(Minimal effective concentration, MEC)(㎍/㎖)는 펩타이드 농도의 로그값에 대한 유니트의 곡선의 X-intercept로 계산하였다(Zhao et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45: 2695-2702, 2001).

그 결과 아가미 추출물은 Bacillus subtilis KCTC1021와 Streptococcus iniae FP5229에 대해서 강한 항미생물 활성을 나타내었다(도 1). 이러한 결과는 아가미 조직이 선천적 면역에 주요한 기능을 담당한다는 것을 의미하는 것으로 항미생물 활성을 나타내는 물질이 함유되어 있음을 입증하는 것이다.

실험예 2. 정제된 펩타이드의 이황화 결합 유무확인

정제된 항미생물 활성 펩타이드내의 disulfide 결합 유무를 확인하기 위해서 환원제인 DTT(Dithiothreitol)를 처리한 후, HPLC에서의 보유시간(retention time)의 변화유무를 확인하였다. 확인 결과, 정제된 펩타이드는 환원제인 DTT 전 후의 HPLC 보유시간의 변화는 나타나지 않았다. 이러한 결과는 정제된 펩타이드 내에는 이황화 결합이 존재하지 않는 선형(linear) 펩타이드인 것으로 확인이 되었다.

실험예 3. 정제된 펩타이드의 분자량 측정

정제한 펩타이드의 분자량 측정은 매트릭스(matrix)로 α-시아노-4-히드록시신남산(α-cyano-4-hydroxycinnamic acid, CHCA)을 사용하였으며, MALDI-TOF mass spectrometer (Voyager-DETM PRO spectrometer, Perseptive Biosystems, USA)로 측정하였다. 분자량 측정 결과 정제된 펩타이드의 분자량은 4763.9 Da 이었다(도 4).

실험예 4. 정제된 펩타이드의 아미노산 서열 분석

정제한 펩타이드의 1차 구조를 결정하기 위해 한국기초과학지원연구원의 단백질 서열기(Procise^® cLC Sequencing System, Model 492 cLC, Applied Biosystems, USA)를 이용하였다. 전복의 아가미 추출물에서 정제한 항미생물 활성 물질의 N-말단의 서열분석을 수행한 결과, 1~46 번째 잔기까지의 일차구조를 얻었으며, 다음과 같다: AATKPKKAGAEAAPKKPAKKQTKKKPAKKAGGKKKPKRAGAKKAKK(서열번호 1, 이하 "Abalone AMP-1"이라 약칭함.)(도 5).

실험예 5. 상동성 검사 및 서열 비교

상기 실험예 4에서 확인된 아미노산 서열의 상동성 검사를 NCBI BlastP를 이용하여 수행하였다. 이때, 서열번호 1로 기재되는 46개 아미노산 서열 가운데, 1~30번째의 아미노산(서열번호 2: AATKPKKAGAEAAPKKPAKKQTKKKPAKKA)을 이용하여 유사성을 갖는 서열을 검색하였으며, 그 결과 histone H1의 N-말단의 일차구조와 높은 유사성을 나타내었다. 그리고 유사성이 있는 다른 histone H1의 N-말단의 일차 구조 서열들과의 서열정렬(alignment)은 ClustalX 프로그램을 이용하여 수행하였다(도 6). 이러한 결과를 종합하여 볼 때, 정제된 펩타이드는 histone H1 유래 펩타이드로 판단되었다.

실험예 6. 정제된 펩타이드의 항미생물 활성 측정

정제된 펩타이드의 항미생물 활성은 상술한 URDA 방법을 이용하여 측정하였다(Seo et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 338, 1998~2004, 2005). 그램 양성균(Bacillus subtilis, Micrococcus luteus, Streptococcus iniae, 및Staphylococcus aureus)과 그램 음성균(Aeromonas hydrophila, Escherichia coli, Enterobacter cloacae, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella enterica, Shigella flexneri, 및 Vibrio parahaemolyticus)과 효모(Candida albicans)에 대해 항미생물 활성을 측정하였다.

A. hydrophila, S. iniae 그리고 V. parahemolyticus는 25℃, 그 외 균주는 37℃에서 18시간 동안 TSB(Trypticase soy broth) 또는 SDB(Sabouraud's dextrose broth)에서 배양하였다. 그 후, 상기 세균과 C. albicans 현탁액은 세균의 경우 약 ~10⁸ CFU/㎖, C. albicans의 경우 약 10⁶ CFU/㎖에 상응하도록 McFarland 표준탁도 0.5 (Vitek Colorimeter #52-1210; Hach, Loveland, CO, USA)가 되도록 각각 희석하였다. 상기 희석된 세균 현탁액 0.5 ㎖을 9.5 ㎖의 깔개 겔(underlay gel)[10 mM 인산 완충액(pH 6.57), 0.03% TSB(tryptic soy broth) 또는 0.03% SDB(Sabouraud's dextrose broth), 및 1% I형 한천(low EEO)]에 혼합하여 5 X 10⁶ CFU/㎖로 만들었다. C. albicans의 경우 깔개 겔(underlay gel)과 혼합하여 5 X 10⁴ CFU/㎖로 조정한 후 직경 10 cm, 높이 1.5 cm 평판 접시에 도포하였으며, 그 결과 1 mm 높이의 겔이 형성되었다. 그 후, 상기 평판 접시 내에 형성된 겔에 직경 2.5 mm 크기로 구멍을 뚫어 웰(well)을 만들었다.

상기 실시예 2에서 정제된 펩타이드를 0.01%(v/v) 초산 3 ㎕에 2배씩 순차적으로 희석한 후, 1 mm 두께의 깔개 겔 내에 형성된 직경 2.5 mm의 웰에 각 희석액을 첨가한 후, A. hydrophila, S. iniae 및 V. parahaemolyticus의 경우 25℃에서, 그 외의 균은 37℃에서 3시간 동안 배양하였다.

배양 후 세균 또는 C. albicans 현탁액 위에 10 mM 인산완충용액(pH 6.57)에 6% TSB 또는 6% SDB, 및 1% 한천을 포함하는 강도 두 배의 덮개 젤 10 ㎖을 덮었다. 평판 접시를 추가적으로 18~24시간 동안 배양한 후 투명지역의 직경을 측정하였다. 웰의 직경을 제한 후 투명 지역(clear zone)의 직경을 유니트(U)로 표현하였는데, 0.1 mm을 1U로 환산하였고 합성 펩타이드의 최소 효과 농도(MEC, minimal effective concentration)(㎍/㎖)는 펩타이드 농도의 로그값에 대한 유니트의 곡선의 X-intercept로 계산하였다(Zhao et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45: 2695-2702, 2001). 양성 대조군으로는 교잡종 줄무늬 베스(hybrid striped bass, Morone saxatilis x M. chrysops)로부터 분리된 α-나선형의 항미생물성 펩타이드인 피사이딘(Piscidin) 1을 사용하였다(Silphaduang and Noga, Nature, 414(6861): 268-269, 2001).

그 결과, Abalone AMP-1은 그람양성균인 B. subtilis, S. aureus와 그람 음성균인 E. coli, P. aeruginosa, S. enterica, Shigella flexneri (MECs: 0.8-19.0 μg/㎖)를 포함하는 몇몇 그람 양성균과 음성균에 대하여 강한 항미생물 활성을 나타낸 반면, 그람 양성균인 M. luteus, 그람 음성균인 Enterobacter cloacae와 효모인 C. albicans (MEC: >125 ㎍/㎖)에 대해서 효과가 거의 없었다(표 2). 흥미롭게도, Abalone AMP-1은 A. hydrophila, S. iniae 및 V. parahemolyticus와 같은 어류 병원균 중에서 A. hydrophila (MEC: 3.2 ㎍/㎖)와 V. parahemolyticus (MEC: 2.0 ㎍/㎖)에 대하여 강한 항미생물 활성을 나타냈다. 표준 항미생물성 펩타이드로 사용된 Piscidin 1은 조사된 모든 세균에서 폭넓은 항미생물 활성을 보인 반면, 효모인 C. albicans에 대해서는 유의한 활성을 보이지 않았다(MEC: > 62.5 ㎍/㎖).

		Gram	MEC (㎍/㎖)
			Abalone AMP-1	Piscidin 1
미생물	B. subtilis KCTC1021	+	15.0	7.5
	B. subtilis RM125	+	0.8	4.5
	M. luteus ATCC9341	+	125.0	8.0
	S. aureus RM4220	+	19.0	4.4
	E. coli D31	-	1.4	3.8
	E. coli KCTC1116	-	3.6	7.0
	Enterobacter cloacae KCTC1685	-	>500	6.0
	P. aeruginosa KCTC2004	-	4.0	8.0
	S. enterica KCTC2514	-	1.0	4.6
	Shigella flexneri KCTC2517	-	1.5	8.0
어류 병원균	S. iniae FP5229	+	250.0	6.5
	A. hydrophila KCTC2358	-	3.3	10.0
	V. parahemolyticus KCCM41664	-	2.0	3.0
효모	C. albicans KCTC7965		> 500	> 62.5

실험예 7: 전복 아가미 추출물로부터 정제된 펩타이드의 용혈활성 측정

Abalone AMP-1이 세균에만 특이적으로 작용하고, 생체 내에서 적혈구 용혈반응과 같은 부작용이 나타나는지 확인하기 위해서, 인간 및 어류의 적혈구를 이용하여 Abalone AMP-1과 Piscidin 1의 적혈구 용혈활성을 분석하였다.

인간 및 어류의 적혈구는 헤파린-처리 혈액으로부터 4000 X g의 속도로 5분간 원심분리하여 수득한 후, 10 mM Tris-HCl 완충액(pH 7.4/150 mM NaCl)으로 세 차례 세척하여 혈장과 버피코트(buffy coat)를 제거한 후, 완충액에 현탁하여 3%의 적혈구 용적율(hematocrit)로 조절하였다. 그 결과 상기 현탁액은 약 2 X 10⁸ cells/㎖ 비율로 적혈구를 포함한다. 상기 3% 적혈구 용적율을 갖는 현탁액 90 ㎕에 Abalone AMP-1 또는 Piscidin 1을 첨가하여 최종 농도를 3.13 내지 100 ㎍/㎖로 조정한 후 60분간 37℃에서 배양하였다. 배양 후, 8000 X g의 속도로 10분간 원심분리하여 얻은 상등액(70 ㎕)을 마이크로타이터 플레이트에 넣은 후 405 nm에서의 흡광도를 측정하였다. 100% 용혈반응은 0.1% Triton X-100을 처리한 후, 방출되는 헤모글로빈에 따라 결정되었다. Abalone AMP-1 또는 Piscidin 1 펩타이드에 의한 적혈구 용적율은 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.

그 결과, 표 3에서 나타난 바와 같이, Abalone AMP-1은 100 ㎍/㎖의 농도까지는 인간 및 어류의 적혈구에 대하여 용혈반응을 거의 나타내지 않은 반면, Piscidin 1은 12.5 ㎍/㎖의 농도에서조차 적혈구 용혈반응을 보였다(표 3). 이러한 결과는 Abalone AMP-I이 유의한 적혈구 용혈반응 없이 항미생물 활성을 제공할 수 있음을 시사하는 것이다.

펩타이드 처리농도 (㎍/㎖)	Abalone AMP-1에 의한 용혈반응(%)		Piscidin 1에 의한 용혈반응(%)
	인간 적혈구	어류 적혈구	인간 적혈구	어류 적혈구
3.13	0	0	0	0
6.25	0	0	2.4	3.1
12.5	0.7	0	22.8	15.8
25	0.9	0.3	29.5	38.2
50	1.0	1.2	92.9	89.5
100	1.2	1.5	100	100

본 발명은 도면에 도시된 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Novel antimicrobial peptide from the Abalone, Haliotis discus discus, and uses thereof <130> PD12-0269 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 46 <212> PRT <213> Haliotis discus discus <400> 1 Ala Ala Thr Lys Pro Lys Lys Ala Gly Ala Glu Ala Ala Pro Lys Lys 1 5 10 15 Pro Ala Lys Lys Gln Thr Lys Lys Lys Pro Ala Lys Lys Ala Gly Gly 20 25 30 Lys Lys Lys Pro Lys Arg Ala Gly Ala Lys Lys Ala Lys Lys 35 40 45 <210> 2 <211> 30 <212> PRT <213> Haliotis discus discus <400> 2 Ala Ala Thr Lys Pro Lys Lys Ala Gly Ala Glu Ala Ala Pro Lys Lys 1 5 10 15 Pro Ala Lys Lys Gln Thr Lys Lys Lys Pro Ala Lys Lys Ala 20 25 30

Claims (9)

1. 항미생물 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   전복(Haliotis discus discus)으로부터 유래한, 펩타이드.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 갖는, 펩타이드.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 사람과 어류의 적혈구 세포를 파괴하지 않는 펩타이드.
5. 제 1항의 펩타이드를 암호화하는 유전자.
6. 제 5항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
7. 제 6항의 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체.
8. 제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
9. 제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.
   
   

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