KR101508693B1 - 참굴 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 어류 병원성 미생물에 대하여 효율적인 항미생물 활성을 나타낼 뿐만 아니라, 적혈구에 대한 용혈활성은 거의 없기 때문에, 양식어류에 대한 사료첨가제로 사용되거나, 항생제 대체제로 사용되더라도 어류 및 인체의 건강에 대한 위협요소를 제공하지 않는다.

Description

참굴 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도{Novel antimicrobial peptide from Crassostrea gigas, and uses thereof}

본 발명은 항미생물성 펩타이드에 관한 것으로서, 더 상세하게는 참굴 유래의 새로운 항미생물성 펩타이드 및 이의 용도에 관한 것이다.

해양 무척추 동물들 가운데, 특히 홍합(mussels) 및 굴과 같은 저생 생물들(benthic organisms)은 미생물이 풍부한 환경에 서식하면서 끊임없이 다양한 병원성 미생물에 노출되어 있다(Bachere et al., Immunology review, 198:149-168, 2004). 또한, 이러한 종들의 한 장소에 부착된 생태는 병원성 감염 위험을 더욱 증가시키며, 이에 대항하기 위한 방어 시스템이 필요하다. 그러나 해양 무척추 동물은 T-림프구에 기반된 후천성 면역시스템이 없고, 오직 체액성 면역 또는 세포 매개성 면역과 같은 선천성 면역에 의존한다고 알려져 있다.

참굴(Crassostrea gigas)은 국내 수산업을 뒷받침하는 중요한 자원 중 하나이다. 그러나 박테리아, 기생충 및 바이러스와 같은 다양한 병원성 균에 의해서 국내의 굴 생산 규모가 감소하고 있으며, 특히 참굴의 경우 비브리오 불리피쿠스(Vibrio vulnificus) 및 비브리오 파라헤몰리티커스(V. parahaemolyticus)에 의한 해산물 매개의 질병의 주요 원인으로 알려져 있다. 그러나 현재까지 굴의 면역 방어기작에 대한 연구는 거의 되어 있지 않으며, 병원성 미생물의 수준이 숙주내에서 조절되는 기작에 대해서도 알려진 바가 매우 적은 실정이다.

굴과 같이 여과섭식하는 이매패류(bivalves)는 병원성 균으로부터 스스로를 보호하기 위하여, 효과적인 항미생물 기작을 이용하고 있는데, 가장 대표적인 선천성 면역체계(innate immune system)인 항미생물활성 펩타이드(antimicrobial peptide, AMP)를 이용한다고 알려져 있다. 항미생물성 펩타이드는 생물체의 선천성 면역체계(innate immune system)의 최전방 생체 방어인자이다. 항미생물성 펩타이드는 특정 미생물이나 항원에 반응하는 후천면역과는 달리 미생물의 종류에 크게 상관없이 작용하며 반응시간도 바로 혹은 몇 시간 내로 매우 빠르다. 내성균의 문제를 항상 내포하고 있는 기존의 항생제와 구분되어 내성의 문제 또는 면역문제나 거부반응의 문제없이 광범위한 생물계에서 미생물로부터 숙주를 보호하기 위해 자연적으로 생성되었기에 이들 항미생물성 펩타이드들은 천연 항생제라고 불린다. 현재 굴 유래의 항미생물 펩타이드에 관한 연구는 디펜신(defensin), 히스톤(histone), 라이소자임(lysozyme) 및 유비퀴틴(ubiquitin)에 한정되어 있다.

본 발명은 참굴(Crassostrea gigas)로부터 면역기작을 담당하는 신규 항미생물 활성 펩타이드를 제공하는 것을 목적으로 한다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따르면, 항미생물 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드가 제공된다.

상기 펩타이드는 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 그람 양성균은 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코코스 루테우스(Micrococcus luteus), 스트렙토코코스 이니에(Streptococcus iniae), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)일 수 있으며, 상기 그람 음성균은 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 에스케리시아 콜라이(Escherichia coli), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri), 및 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus)일 수 있다.

상기 펩타이드는 적혈구 세포를 파괴하지 않을 수 있다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 펩타이드를 암호화하는 유전자가 제공된다.

상기 유전자는 서열번호 3 또는 7의 핵산서열을 가질 수 있다. 상기 서열번호 3은 본 발명의 일 실시예의 항미생물 활성을 갖는 펩타이드의 cDNA 핵산서열이고, 상기 서열번호 7은 상기 펩타이드의 gDNA 핵산서열이다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 유전자를 포함하는 발현벡터가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 발현 벡터를 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체가 제공된다.

본 발명의 다른 일 관점에 따르면, 상술한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제가 제공된다.

상기 항생제에 있어서, 상기 펩타이드는 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 유효 투여량은 0.1 mg/kg 내지 1 g/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 더 바람직하게는 0.1 mg/kg 내지 500 mg/kg의 투여량으로 투여될 수 있다. 한편, 상기 투여량은 환자의 나이, 성별 및 상태에 따라 적절히 조절될 수 있다.

상기 항생제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 임상 투여 시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 비경구 투여 시 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내주사, 자궁내 경막주사, 뇌혈관내 주사 또는 흉부내 주사에 의해 투여될 수 있고, 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 일 관점에 따르면, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드 를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제가 제공된다.

상기 사료첨가제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래될 수 있으며, 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 나타낼 수 있다.

상기 사료첨가제에 있어서, 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드를 조성물 총 중량에 대하여 바람직하게는 0.1 내지 50 중량% 로 포함할 수 있다. 또한, 추가로 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드와 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상을 함유할 수 있으나, 상기 유효성분의 함량을 초과하지 않는 것이 바람직하다.

본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드는 어류가 양식되고 있는 수조의 물에 직접 살포하는 것도 가능하다.

상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 참굴로부터 유래된 신규한 항미생물 활성을 갖는 펩타이드를 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 참굴 아가미 및 외투막(mantle) 추출물의 그람 양성균인 B. subtilis KCTC1021와 그람 음성균인 E. coli D31에 대한 항미생물 활성을 확인한 사진(도 1a), 아가미 추출물을 역상 HPLC를 이용하여 분리한 결과 그래프(도 1b), 및 상기 HPLC 분리된 분획물을 양이온 교환 컬럼을 이용하여 정제한 결과 그래프(도 1c)이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 참굴 아가미 추출물을 양이온 교환 컬럼을 수행한 후, 한 번 더 역상 HPLC를 수행한 결과 및 이의 항미생물 활성을 나타낸 결과(도 2a) 및 상기 분획된 펩타이드를 MALDI time-of-flight(TOF)/TOF 질량분석기를 이용하여 분자량을 분석한 결과이다.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드의 인간 적혈구 세포에 대한 용혈활성을 피사이딘(Piscidin) 1과 비교한 그래프이다.
도 4는 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드 핵산서열(도 4a) 및 게놈 구조(도 4b)를 분석한 결과를 나타낸 그림이다.
도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin의 조직 특이적인 발현을 실시간 RT-PCR을 이용하여 분석한 결과(도 5a), 병원성 비브리오 균으로 감염시키 후(0, 1, 3, 6, 9, 12, 24 및 48 시간), 참굴의 아가미 조직에서 cgMolluscidin의 발현 수준을 28S rDNA 대비하여 나타난 RT-PCR 결과를 나타내는 그래프이다:
DG: 소화관(digestive gland);
MT: 외투막(mantle);
GL: 아가미(gill);
LP: 순판(labial palp); 및
AM: 패각근(adductor muscle).
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin에 카르복시말단펩티드 가수분해효소 B를 처리한 후, 보존시간 및 절단 패턴을 확인한 결과로, 도 6a는 cgMolluscidin을 로딩한 결과, 도 6b는 카르복시말단펩티드 가수분해효소 B를 로딩한 결과, 도 6c는 cgMolluscidin + 카르복시말단펩티드 가수분해효소 B 처리군을 로딩한 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin의 2차 구조 및 Schiffer-Edmundson 헬리컬 휠 다이어그램(helical wheel diagram)을 분석한 결과로, 도 7a는 2차 구조를 GOR 프로그램을 이용하여 분석한 결과를 나타내며, 도 7는 사각형 박스 안의 소수성 잔기를 표시한 그림이며, 도 7c는 중앙의 헬릭컬 부위의 비-양친매성 구조를 나타낸 그림이다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다.

실시예 1: 참굴 조직 추출물의 제조

7.0-12.0 cm의 껍질 길이를 갖는 40마리의 성체 참굴을 2010년 5월 사천해안에서 채취하고, 이를 실험실에 가져오자마자 각각의 참굴을 수돗물로 조심스럽게 세척하고 서킹 나이프(shucking knife)를 이용하여 껍질을 열었다. 5 내지 6마리의 참굴로부터 얻은 약 5 ml의 아가미와 외투막(mantle)을 얼음위의 살균된 15 ml 폴리프로필렌 튜브에 분리하여 넣었다. 상기 아가미 또는 맨틀 조직은 미리 가열된 1% 아세트산(HAc) 용액 20 ml이 담겨져 있는 50 ml 비커에 넣고, 5분 동안 가열한 후, 2분 동안 얼음위에서 균질화하였다(speed #4, Polytron PT1200 C homogenizer, Kinematica AG, Switzerland). 균질화 이후, 총 8개의 가열된 샘플(총 40마리 참굴)을 4℃, 15,000 x g에서 45분 동안 원심분리하였다. 상기 원심분리 후, 아가미로부터 144 ml의 상층액을, 외투막으로부터 104 ml의 상층액을 수득하고 하기 실험에 이용하기 직전까지 -70℃에 보관하였다.

실시예 2: 참굴 추출물의 항미생물 활성

참굴 추출물의 항미생물 활성은 B. subtilis KCTC1021와 그람 음성균인 대장균(Escherichia coli)을 이용하였으며, 아가미 및 외투막 추출물의 각각의 항미생물 활성을 URDA 방법을 이용하여 측정하였다.

구체적으로 상술한 미생물들은 25℃ 또는 37℃에서 18시간 동안 TSB(Trypticase soy broth) 또는 SDB(Sabouraud's dextrose broth)에서 배양한 후, 상기 배양액을 McFarland 표준혼탁도 0.5(Vitek Colorimeter #52-1210; Hach, Loveland, CO, USA)가 되도록 각각 희석하였다. 상기 희석액은 약 ~10⁸ CFU/㎖ (세균) 또는 ~10⁶ CFU/㎖ (C. albicans)에 해당하는 양이다. 상기 희석액은 각각 0.5 ㎖을 9.5 ㎖의 깔개 겔(underlay gel)[10 mM 인산 완충액(pH 6.6), 0.03% TSB(tryptic soy broth) 또는 0.03% SDB(Sabouraud's dextrose broth), 및 1% I형 한천(low EEO)]에 혼합하여 5 X 10⁶ CFU/㎖ 또는 5 X 10⁴ CFU/㎖로 조정한 후 직경 10 cm, 높이 1.5 cm 평판 접시에 도포하였으며, 그 결과 1 mm 높이의 겔이 형성되었다. 그 후, 상기 평판 접시 내에 형성된 겔에 직경 2.5 mm 크기로 구멍을 뚫어 웰(well)을 만들었다. 그 후, 아가미 또는 맨틀 추출물을 각각 5 ㎕ HAc(0.01% HAc)에 2배 순차희석한 후, 각각의 희석액을 1 mm 두께의 깔개 겔 내에 형성된 직경 2.5 mm의 웰에 첨가한 후, 25℃ 또는 37℃에서 3시간 동안 배양하였다. 배양된 현탁액 위에 10 mM 인산완충용액(pH 6.6)에 6% TSB 또는 6% SDB, 및 1% 한천을 포함하는 강도 두 배의 덮개 젤 10 ㎖을 덮은 후, 25℃ 또는 37℃에서 16 내지 18시간 동안 배양하였다. 다음 날 웰 주위에 형성된 투명 지역(clear zone)의 직경을 측정함으로서 활성을 확인 하였다. 웰의 투명 지역(clear zone)의 직경에서 웰의 직경을 제한 값을 유니트(U)로 표현하였는데 0.1 mm을 1U로 환산하였고 합성 펩타이드의 최소 효과 농도(Minimal effective concentration, MEC, ㎍/㎖)는 펩타이드 농도의 로그값에 대한 유니트의 곡선의 X-intercept로 계산하였다(Zhao et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 45: 2695-2702, 2001).

그 결과, 도 1a 왼쪽 패널에 나타난 바와 같이 참굴 아가미 또는 외투막 추출물은 그람 양성 균인 B. subtilis KCTC1021 및 그람 음성 균인 E. coli D31에 대하여 강력한 항미생물 활성을 나타냈다. 특히, 아가미 추출물은 외투막 추출물보다 좀더 강한 항미생물 활성을 보였다. 이에, 하기 실시예에서 아가미 추출물을 이용하였다.

이어, 본 발명자는 본 발명의 일 실시예에 따른 상기 참굴 아가미 추출물에 포함된 활성물질이 가수분해 작용에 영향을 받는지의 여부를 단백질 분해 효소를 처리하여 확인하였다. 단백질 분해 효소로 250 ㎍/㎖ 크리스탈 트립신(Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, USA)을 이용하였으며, 상기 실시예 1의 참굴 아가미 추출물에 첨가하여 37℃에서 60분 동안 처리하였다. 그리고 상술한 바와 동일한 URDA 방법을 이용하여 그람 양성 균인 B.subtilis KCTC1021 및 그람 음성 균인 E.coli D31에 대한 항미생물 활성을 확인하였다.

그 결과, 도 1a의 오른쪽 패널에 나타난 바와 같이, 상기 균에 대한 항미생물 활성이 현저하게 감소되었으며, 이러한 결과는 참굴 아가미 추출물이 단백질 항생물질을 포함하고 있다는 것을 의미한다.

실시예 3: 참굴 아가미 추출물로부터 항미생물 펩타이드의 정제

본 발명의 일 실시예에 따른 항미생물 활성을 나타내는 참굴 아가미 산 추출물을 역상 HPLC를 통하여 정제하였다.

우선, CapCell-Pak C₁₈ 역상 컬럼(5 μm, 300Å, 4.6 X 250mm, Shiseido, Japan)에 로딩하였다. 그 후, 상기 샘플에 0.1% TFA(trifluoroacetic acid)를 포함하는 아세토나이트릴(CH₃CN, ACN) 용액을 1 ㎖/분의 유속으로 60분 동안 5~65%까지 선형 농도구배를 처리하였으며 수득된 용출액의 흡광도는 220 nm 파장에서 관찰하였다.

그 결과, 도 1b에 나타난 바와 같이, 강한 활성을 나타내는 피크가 관찰되었다(도 1b 참조).

이에, 본 발명자는 상기 도 1b의 분획물을 한 번 더 정제하였다. 상기 도 1b의 강한 피크를 나타내는 분획물들을 양이온 교환 컬럼인 TSK-Gel SP-5PW HPLC 컬럼(7.5×75 mm; Tosoh, Tokyo, Japan)에 로딩하고, 10 mM PB(pH 6.0) 용액을 넣고 평형화시켰다. 0~1.0 M NaCl에 버퍼 A[10 mM PB, pH 6.0] 및 버퍼 B[1.0 M NaCl in 10 mM PB, pH 6.0]을 1 ml/분의 유속으로 100분 동안 선형 농도구배로 처리하며 분리하고, 220 nm에서 흡광도를 관찰하였다.

그 결과, 도 1c에 나타난 바와 같이, 약 76분대, 0.76 M NaCl 농도에서 단일 물질이 정제되었다(도 1c 참조).

실시예 4: 정제된 펩타이드의 항미생물 활성 측정

이어 본 발명자는 상기 실시예 3에서 정제된 펩타이드의 항미생물 활성을 URDA 방법을 이용하여 확인하였다. 상기 실시예 3에서 확인된 펩타이드는 항미생물 활성을 확인하기 전에, 마지막으로 역상 HPLC를 한 번 더 수행하여 정제한 후, 단백질 분해 효소인 크리스탈 트립신 처리 전, 후의 항미생물 활성을 비교하였다.

250 ㎍/㎖ 크리스탈 트립신(Fisher Scientific, Fairlawn, NJ, USA)을 처리하였으며, 상술한 정제과정을 한번 수행한 펩타이드에 37℃에서 60분 동안 처리하였다. 그리고 상술한 바와 동일한 URDA 방법을 이용하여 그람 양성 균인 B. subtilis KCTC1021 에 대한 항미생물 활성을 확인하였다.

그 결과, 트립신 처리에 의해서 상기 펩타이드의 항미생물 활성은 완전히 사라졌다(도 2a 참조).

실시예 5: 정제된 펩타이드의 분자량 및 서열분석

5-1: 분자량 분석

상기 실시예 4에서 항미생물 활성을 확인한 정제된 펩타이드의 분자량을 Ultraflex Ⅲ MALDI time-of-flight (TOF)/TOF 질량분석기를 이용하여 분석하였다. 우선, 상기 펩타이드는 DBA(sinapinic 2,5-dihydroxybenzoic acid) 매트릭스 용액[10 mg/mL DBA in 0.1% TFA/50% CH₃CN, 1:1,v/v]과 0.1% TFA/50% CH₃CN(1:1, v/v)의 혼합용액에 녹인 후, MALDI 플레이트에 바로 로딩하였다. 그 후, 상기 스펙트라(spectra)는 Flex analysis software(version 3.3, Bruker Daltonics, DEU)를 이용하여 분석하였다. 또한, 정제된 펩타이드의 N 말단의 아미노산 서열은 펄스 리퀴드 자동 서열분석기(pulse liquid automatic sequencer, model 473A; Applied Biosystems Inc., Foster City, CA, USA)의 자동화된 Edman 분해 방법을 이용하여 분석하였다.

그 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이 2개의 양성 이온 피크([M+H]⁺:5568.75 와 [M+2H]²⁺:2784.65)가 관찰되었다. 이러한 결과를 통해서 상기 실시예 4에서 마지막으로 정제된 펩타이드가 5568.75 Da에 달한다는 것을 확인할 수 있었으며, Edman 분해 방법에 따라 분석한 결과 상기 펩타이드의 N 말단은 하기와 같은 23개의 아미노산 잔기를 포함한다는 것을 확인할 수 있었다:

NH₂-A-A-T-A-K-K-G-A-K-K-A-D-A-P-A-K-P-K-K-A-T-K-P-OH(서열번호 4).

상기 확인된 아미노산 서열은 기본 잔기가 다수 존재하고 있으며(8개의 라이신), 그 외에는 8개의 알라닌 또는 3개의 프롤린 잔기와 같은 다양한 잔기가 존재하고 있었다.

5-2: 상동성 분석

본 발명의 일 실시예에 따른 상기 아미노산의 상동성을 분석하기 위하여, NCBI 데이터베이스에 있는 BlastX 유사성 분석 프로그램을 이용하였다. 분석 결과, 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin의 아미노산은 NCBI의 단백질 데이터 베이스에 존재하는 펩타이드 또는 단백질과 일치하지 않았다.

이러한 결과는 본 발명의 일 실시예를 통하여 정제된 펩타이드가 신규한 항미생물 활성을 갖는 펩타이드이며, 본 발명자는 상기 펩타이드를 cgMolluscidin (C. gigas molluscan antimicrobial peptide)라고 명명하였다. 상기 cgMolluscidin 펩타이드는 라이신-라이신을 반복적으로 포함하고 있으며, 그 사이에 알라닌, 발린 또는 글라이신과 같은 작은 소수성 아미노산이 자리잡고 있었다.

5-3: cDNA 및 게놈 DNA 서열 분석

N 말단 아미노산을 포함하는 2개의 엑손(exon)으로부터 추정되는 아미노산 서열은 Edman degradation 방법에 의하여 분석되었다. 5' 말단 및 3' 말단의 cgMolluscidin은 SMART RACE 방법에 의하여 증폭되었다. 이러한 cDNA 단편 서열은 ORF-F(서열번호 5) 및 ORF-R 프라이머(서열번호 6)를 이용하여 참굴 아가미 cDNA를 이용하여 증폭된 RT-PCR 산물과 비교하였다.

전장 cgMolluscidin cDNA(GenBank accession no. JX549384)는 110 bp 5'- UTR(untranslated region) 및 461 bp 3'-UTR을 포함하는 742 bp를 포함하는 것으로 분석되었다(서열번호 2). 또한, 도 4a에 나타난 바와 같이, 전장 cgMollusidin은 56개의 아미노산(서열번호 1)을 암호화하는 171 bp의 오픈 리딩 프레임을 포함하는 것으로 나타났으며(서열번호 3), Met을 제외한 cgMolluscidin cDNA의 분자량은 약 5.5 kDa으로 MALDI-TOF 분석 결과 나타났다. 상기 3'-UTR은 poly(A)⁺ 신호(AATAAA) 및 2개의 ATTTA 모티프를 포함하는 것으로 나타났다.

또한, 상기 전장 cDNA로부터 추정되는 펩타이드 서열은 23개의 라이신 및 15개의 알라닌을 포함하는 55개의 아미노산으로 구성되는 것으로 나타났으며, 이때 메티오닌은 제외하였다. 이로부터 계산되는 등전점(isoelectric point, pI)는 11.28 이었다. 주목할반한 점은 상기 추론된 아미노산 서열이 10개의 라이산-라이신 또는 라이신-아르기닌 반복을 포함하고 있으며, 알라닌, 발린 및 글라이신과 같은 작은/소수성 아미노산이 이러한 반복된 서열 사이에 위치하였다. 상기 계산된 추론된 아미노산 서열의 분자량은 5567.8 Da이었으며, 이는 MALDI-(TOF)/TOF-MS 분석 결과 수득된 5568.75 Da와 거의 일치하였다. 이러한 결과는 cgMolluscidin이 전사후 변이 과정을 가지지 않는 다는 것을 의미한다.

또한, 도 4b에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 유전자(GenBank accession no. JX549385, 서열번호 7)는 865 bp 길이이며, 3개의 엑손 및 2개의 인트론(intron)으로 구성되어 있으며, 이때 상기 인트론은 108 bp 및 265 bp로 나타났다(도 4b 참조).

실시예 6: 정제된 펩타이드(cgMolluscidin)의 항미생물 활성

본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드의 항미생물 활성을 URDA 방법을 이용하여 확인하였다.

항미생물 활성 측정에는 그람 양성 균인 바실러스 섭틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 및 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)를 이용하였으며, 그람 음성균인 대장균 D31(Escherichia coli D31), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica) 및 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus), 및 효모인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 이용하였다. 항미생물 활성을 측정한 방법은 상기 실시예 2과 동일하며, 비브리오 파라헤모리티커스(Vibrio parahaemolyticus)의 경우 TSB(Trypticase soy broth)에서 25℃ 온도조건으로, 나머지 세균들은 TSB(Trypticase soy broth)에서 37℃ 온도조건에서 배양하였으며, 효모인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)는 SDB(Sabouraud's dextrose broth)에서 37℃ 온도조건에서 배양되었다는 면에서 차이가 있었다. 이때, 양성 대조군으로는 E. J. Noga(NCSU, NC, USA) 교수로부터 제공받은 교잡종 줄무늬 베스(hybrid striped bass, Morone saxatilis x M. chrysops)로부터 분리된 α-나선형의 항미생물성 펩타이드인 피사이딘(Piscidin) 1을 사용하였다(Silphaduang and Noga, Nature, 414(6861): 268-269, 2001).

그 결과, 하기 표 1에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드는 그람 양성균(B. subtilis, M. luteus, 및 S. aureus [MECs, 1.3 - 31.3 μg/mL])과 그람 음성균(E. coli D31, S. enterica, 및 V. parahaemolyticus[MECs, 0.4 - 2.3 μg/mL])에 대하여 모두 강한 항미생물 활성을 나타냈으며, 양성 대조군인 피사이딘 1과도 유사한 항미생물 활성을 보였다. 그러나 C. albicans에 대해서는 MEC 수치가 >250 μg/mL을 나타내며 항미생물 활성이 거의 나타나지 않았다. 이러한 결과는 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드가 그람 양성 및 그람 음성 균에 대하여 폭넓게 적용될 수 있으나, 몇몇의 미생물(예: 효모)에 대해서는 효과가 제한적일 수 있음을 의미한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 항미생물 펩타이드의 항미생물 활성

미생물	그램염색 여부	최소효과농도(μg/mL) [μM]a
		cgMolluscidin	Piscidin 1
B. subtilis KCTC1021	+	1.3 [0.2]	2.3 [0.9]
M. luteus ATCC9340	+	3.0 [0.5]	2.3 [0.9]
S. aureus RM4220	+	31.3 [5.6]	2.2 [0.9]
E. coli D31	-	1.4 [0.3]	2.0 [0.8]
S. enterica KCTC2514	-	0.4 [0.1]	4.6 [1.8]
V. parahaemolyticus KCCM41664	-	2.3 [0.4]	1.8 [0.7]
C. albicans KCTC7965	Yeast	>250.0 [45.0]	31.3 [12.2]

실시예 7: 정제된 펩타이드(cgMolluscidin)의 용혈활성

본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드의 용혈활성을 확인하기 위하여, 인간 적혈구 세포를 이용하여 측정하였다(Park et al., Biochemistry, 50, 3288-3299, 2011).

상기 적혈구 세포는 구연산을 처리한 혈액을 5분 동안 3000 x g에서 원심분리하여 수득한 후, 플라즈마와 버피코트(buffy coat)를 제거하기 위해 150 mM NaCl을 포함하는 10 mM 인산완충액(pH 7.4)으로 세척한 후, 완충액에 현탁하여 3%의 적혈구 용적율(hematocrit)로 조절하였다. 그 결과 상기 현탁액은 약 2 X 10⁸ cells/㎖ 비율로 적혈구를 포함한다. 상기 3% 적혈구 용적율을 갖는 현탁액에 cgMolluscidin 또는 Piscidin 1을 0 내지 100 ㎍/ml의 농도로 첨가한 후, 37℃에서 60분 동안 반응시켰다. 상기 상층액을 5분 동안 3,000 x g에서 원심분리해서 얻은 상층액을 마이크로타이터 플레이트에 넣은 후 405 nm에서 흡광도를 측정하여 용혈반응을 표현하였다. 100% 용혈반응은 0.1% Triton X-100을 처리한 후, 방출되는 헤모글로빈에 따라 결정되었다. cgMolluscidin 또는 Piscidin 1에 의한 적혈구 용혈반응은 하기 수학식 1에 의해 계산하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드는 인간 적혈구 세포에 대해서 용혈활성을 전혀 나타나지 않았으며, 이러한 용혈활성을 100 ㎍/ml의 농도로 처리하였을 때에도 관찰되지 않았다. 반면 양성대조군으로 이용한 피사이딘 1은 12.5 ㎍/ml의 농도로 인간 적혈구 세포에 처리하였을 때에도 세포가 용혈되는 것을 관찰할 수 있었다(도 3 참조).

실시예 8: cgMolluscidin mRNA의 발현 분석

조직 및 병원균 감염에 의하여 유발되는 mRNA 발현을 검출하기 위하여, 소화관, 외투막(mantle), 아가미, 순판(labial palp), 및 패각근(adductor muscle) 조직을 정상 또는 비정상 굴로부터 채취하였다(Park et al., Fish Shellfish Immunol., 24:11-17, 2008). 간략하게 설명하면, 참굴의 껍질을 줄로 자른 후, 패각근에 각각 10⁹ CFU/mL 농도의 병원성 비브리오균 4종(V. anguillarum, V. metshnikovii, V. tubiashii, 및 V. alginolyticus)을 균일하게 혼합하여 100 μL씩 주입하였으며, 이에 대한 대조군으로는 SPW(saline peptone water, peptone 15 g/L and NaCl 15 g/L)을 주입하였다. 1, 3, 6, 9, 12, 24 및 48 시간이 경과한 후, 참굴로부터 조직을 채취한 후, 액체 질소에서 바로 조직을 분쇄하여 RNA를 추출하였다(시간대별 n=3). 전체 RNA는 각 시간대 별로 3마리의 굴로부터 수득한 조직을 TRizol 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)을 이용하여 분리하였다.

cgMolluscidin mRNA를 검출하기 위하여 Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit(Roche Diagnostics)를 이용하여 첫 번째 가닥 cDNA를 합성하였다. RT-PCR을 이용하여 발현 변화를 확인할 수 없었기 때문에, 변형된 실시간 PCR 기술을 이용하여 발현 수준의 변화를 분석하였다.

정량적 실시간 PCR은 FastStart DNA Master SYBR Green I (Roche Diagnostics) 시약 및 LightCycler system(Roche Diagnostics)을 이용하여 수행하였다. 이때 사용한 프라이머는 하기와 같으며, 실시간 PCR 조건은 95℃에서 10분 동안 Taq 활성화를 수행하였으며, 95℃ 10초, 55℃ 6초 72℃ 10초를 40 사이클로 수행하였다:

molluscidin-1-ORF-F(서열번호 5): 5'-ATGGCAGCTACAGCTAAGAAAGGCGCA-3'; 및

molluscidin-1-ORF-R(서열번호 6): 5'-CTACTTCTTGGCCTTAGTGGT-3'.

LightCycler system에서 형광 방출 강도를 측정하는 동안, 온도를 0.1℃/초의 비율로 점진적으로 상승시키면서 변성곡선(melting curve)을 분석하였다. 정제된 폴리펩타이드의 mRNA의 조직 내 발현수준은 28S rDNA 수준을 기준으로 표준화하였다[정방향 프라이머: 5'-AAGGGCAGGAAAAGAAACTAAC-3'(서열번호 8) 및 역방향 프라이머: 5'-TTTCCCTCTAAGTGGTTTCAC-3'(서열번호 9)].

또한, 병원성 비브리오 균에 대하여 감염 이후 각 시간대별 mRNA의 발현 수준은 28S rDNA 수준에 대하여 정량적으로 나타낸 후, 2^-ΔΔCt 방법을 이용하여 병원성 비브리오 균 처리 이전(0 시간)과 비교하였다(Livak and Schmittgen, Methods, 25:402-408, 2001). 모든 분석은 각 cDNA 샘플에 대하여 3회 반복하여 수행하였다.

그 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin mRNA의 발현 수준은 외투막(mantle)에서 가장 높은 수준을 나타냈으며, 아가미 및 순판(labial palp)에서 주간 수준의 발현을, 소화관 및 패각근에서는 가장 낮은 수준의 발현을 나타냈다(도 5a 참조).

도 5b에 나타난 바와 같이, 비브리오 균을 주입한 후, 아가미에서 cgMolluscidin mRNA의 발현 수준을 관찰한 결과, 병원성 비브리오 균을 주입 초기단계에서는 cgMolluscidin mRNA 수준에 변화가 관찰되지 않았으나, 12시간 내지 48시간이 경과한 후, cgMolluscidin mRNA의 발현이 현저하게 변화하는 것을 관찰할 수 있었으며, 상기 mRNA는 12시간(2.8 배) 및 48시간(2.5 배)로 가장 높게 발현되었으며, 24시간 감염 이후 현저하게 감소하였다(도 5b 참조).

실시예 9: 정제된 펩타이드(cgMolluscidin)의 C 말단 분석

정제된 C-말단의 Lys 잔기의 존재여부를 확인하기 위하여, 정제된 폴리펩티드에 아르기닌 및 라이신과 같은 기본 아미노산 잔기에 대하여 우선적으로 작용하는 카르복시말단펩티드 가수분해효소 B를 처리하고(Worthington Biochemical Corp., Lakewood, NJ), RP-HPLC의 보존시간(retention time)의 차이를 비교하였다(Seo et. al., Molecular Immunology, 53:88-98, 2013). 구체적으로, 카르복시말단펩티드 가수분해효소 B를 0.1 M NaCl을 포함하는 Tris-HCl 버퍼(pH 7.65) 내의 cgMolluscidin에 첨가하였다. 가수분해 과정 이후, 0.1 % 트리플루오로아세트산(trifluoroacetic acid)을 이용하여 pH 2.2로 산성화시킨 후, 역상 HPLC 분석을 수행하였다. 보존시간(retention time)을 비교하기 위하여, 정제된 폴리펩타이드를 C18 역상 컬럼(5 μm, 300Å, 4.6 x 250 mm, Shiseido Co., Ltd., Japan)에 로딩하고, 0.1% TFA 내의 5-65% 아세토나이트릴(CH₃CN)을 1 mL/분의 유속으로 60분 동안 선형농도로 용출하였다. 상기 용출액을 Waters 486 UV 검출기를 이용하여 220 nm에서 관찰하였다.

그 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, cgMolluscidin 펩타이드 피크는 카르복시말단펩티드 가수분해효소 B 처리 이후 사라지거나, 이동하는 것을 관찰할 수 있었다(도 6 참조). 이러한 결과는 cgMolluscidin 펩타이드의 C 말단이 아르기닌(Arg) 및 라이신(Lys)과 같은 양전하를 취하는 염기성 잔기로 구성되어 있다는 것을 의미한다. 또한, 아미노산 잔기를 추정한 서열을 기준으로 보면, cgMolluscidin 펩타이드의 C 말단은 라이신(Lys)일 것으로 예상되었다.

실시예 10: 정제된 펩타이드(cgMolluscidin)의 2차 구조 분석

정제된 폴리펩타이드는 Genome Net(www.ncbi.nlm.gov/BLAST) 사이트의 BLASTP 2.2.10 and TBLASTN 2.2.10을 이용하여 상동성을 분석하였다. 등전점(pI) 및 분자 질량은 ExPASy(www.expasy.ch/tools/peptide-mass.html)를 이용하여 이론적으로 계산하였다. 2차 구조는 GOR 방법(www.expasy.org/tools/)으로 분석하였다. Schiffer Edmunson 플랏은 EMBOSS 프로그램을 이용하여 작성하였다(www.bioinfo.hku.hk/EMBOSS, Pepwheel program).

그 결과, 도 7a에 나타난 바와 같이, 상기 GOR 분석 프로그램은 cgMolluscidin 펩타이드의 N- 및 C- 말단이 연장된 β-가닥 또는 랜덤 코일을 형성하는 것으로 나타났다(7a 참조). 반면, 가운데 부분 구조는 (아미노산 24-42)는 α-헬릭스 구조를 취하며 강한 염기성(p.I. 11.47)를 나타내는 것으로 분석되었다. 또한, Schiffer-Edmunson 헬리컬 휠(helical wheel) 도형은 cgMolluscidin 펩타이드 2차 구조의 소수성 및 친수성 부분을 예측하는데 이용될 있다(도 7b 및 7c 참조).

본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드 및 이의 중앙 부분은 양친매성 구조를 가지고 있지 않으며, 상기 구조는 염기성 잔기가 반대 방향으로 위치하는 소수성 및 친수성 잔기를 포함하고 있는 것을 확인하였다. 일반적으로 소수성 및 하전된 잔기의 분포는 플루시딘(pleurocidin) 및 피사이딘(Piscidin) 1과 같은 항미생물 펩타이드(antimicrobial peptides, AMPs)의 활성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다(Yeaman et al., Pharmacol. Rev., 55:27-55, 2003). 본 발명의 일 실시예에 따른 cgMolluscidin 펩타이드의 비-양친매성 구조는 상기 펩타이드가 종래의 AMP와 다른 기작으로 작용한다는 것을 의미한다.

본 발명은 상술한 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.

<110> National Fishery Research Institute <120> Novel antimicrobial peptide from the Crassostrea gigas and uses thereof <130> PD12-0624 <160> 9 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 56 <212> PRT <213> Crassostrea gigas <400> 1 Met Ala Ala Thr Ala Lys Lys Gly Ala Lys Lys Ala Asp Ala Pro Ala 1 5 10 15 Lys Pro Lys Lys Ala Thr Lys Pro Lys Ser Pro Lys Lys Ala Ala Lys 20 25 30 Lys Ala Gly Ala Lys Lys Gly Val Lys Arg Ala Gly Lys Lys Gly Ala 35 40 45 Lys Lys Thr Thr Lys Ala Lys Lys 50 55 <210> 2 <211> 742 <212> DNA <213> Crassostrea gigas <400> 2 acgcgggggg gtatcgcgcg tctactacaa gctgttagcg tcacttgcga agttgtttac 60 tggaggatcg attataagaa aatttacttt tttcgtgaat aaagctcaaa atggcagcta 120 cagctaagaa aggcgcaaag aaggctgatg ccccagcaaa accaaagaaa gcaacaaagc 180 ccaagtctcc caaaaaggct gcaaagaagg caggagcaaa aaagggagtt aagagagctg 240 gaaagaaagg agcaaagaag accactaagg ccaagaagta gatgattttc tcgcagacat 300 cttcacaatc cagggatttc ctcatcagtc atcgtgtaga cctagatttc cacccctctc 360 tgactttgtc atctcatttt tttgagaatg accgaatctc ttttattata tagatctata 420 tataactgtt ttatagaata gatatttata gacgtgtgaa caacaaacgg ttttatactc 480 tgtaaaagct gactgttttt gatttttgag atcaatttga tatttacaag ttgttaagaa 540 tttctaaatg ttaaagagaa tgaaatttta ccgatgtttt atcataattt tttgactaat 600 ctccattttt gtcacatttt atgattcttt ttatgactgg gtgtgtaata ctctttctac 660 agtcttgtac caagcctgta ggactataaa tgtacaataa atgtgtataa aacgaaaaaa 720 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 742 <210> 3 <211> 171 <212> DNA <213> Crassostrea gigas <400> 3 atggcagcta cagctaagaa aggcgcaaag aaggctgatg ccccagcaaa accaaagaaa 60 gcaacaaagc ccaagtctcc caaaaaggct gcaaagaagg caggagcaaa aaagggagtt 120 aagagagctg gaaagaaagg agcaaagaag accactaagg ccaagaagta g 171 <210> 4 <211> 23 <212> PRT <213> Crassostrea gigas <400> 4 Ala Ala Thr Ala Lys Lys Gly Ala Lys Lys Ala Asp Ala Pro Ala Lys 1 5 10 15 Pro Lys Lys Ala Thr Lys Pro 20 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molluscidin-1-ORF-F <400> 5 atggcagcta cagctaagaa aggcgca 27 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> molluscidin-1-ORF-R <400> 6 ctacttcttg gccttagtgg t 21 <210> 7 <211> 865 <212> DNA <213> Crassostrea gigas <400> 7 atggcagcta cagctaagaa aggcgcaaag aaggctgatg ccccaggtat tgaataaata 60 ttacccacaa ttcttttcat gaatcttaaa tatttttctt gtgtctcgca aacgttaaat 120 ttcttggtga ttttatttaa ctttaaactt ccagcaaaac caaagaaagc aacaaagccc 180 aagtctccca aaaaggctgc aaagaaggca ggagcaaaaa agggtaagcc tgtgttttta 240 cacataaaaa aattaataga ctttaaggga atgcattatg tattctctct agctttgtca 300 gagtatttca tttgcaggcg attcccatat caaaaccaat cttcatttaa aaaaaataaa 360 agtacgcgat ataatatatt tagtactaaa gagttcttgg taaacttaat catttaaaat 420 tgggcctagc tgttgatgat tatttatatt gttgaatgtt taataatgca atttgttcta 480 ttttaaagga gttaagagag ctggaaagaa aggagcaaag aagaccacta aggccaagaa 540 gtagatgatt ttcttgcgga cattttcaca atccagggat ttcctcatca gtcatcgtgt 600 agacctagat ttccacccct ctctgacttt gtcatctcat ttttttgaga atgaccgaat 660 ctcttttatt atatagatct atatataact gttttataga atagatattt atagacgtgt 720 gaacaacaaa cggttttata ctctgtcaaa gctgactgtt tttgattttt gagatcaatt 780 tgatatttac aagttgttaa gaatttctaa tgttaaagag aatgaaattt taccgatgtt 840 ttatcataat tttttgacta atctc 865 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28S rDNA forward primer <400> 8 aagggcagga aaagaaacta ac 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 28S rDNA reward primer <400> 9 tttccctcta agtggtttca c 21

Claims (10)

1. 항미생물 활성을 나타내고, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 펩타이드.
2. 제1항에 있어서,
   참굴(Crassostrea gigas)로부터 유래한, 펩타이드.
3. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 그람 양성균 및 그람 음성균에 대하여 항미생물 활성을 갖는, 펩타이드
4. 제1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 적혈구 세포를 파괴하지 않는, 펩타이드.
5. 제1항의 펩타이드를 암호화하는 유전자.
6. 제5항에 있어서,
   서열번호 3 또는 7의 핵산서열로 구성되는, 유전자.
7. 제5항의 유전자를 포함하는 발현벡터.
8. 제7항의 발현 벡터를 비인간 숙주세포에 형질 전환시킨 형질 전환체.
9. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항생제.
10. 제1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 사료첨가제.
    

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