CN101333247B - 从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽及其在抗菌药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽及其在抗菌药物中的应用。采用的技术方案是：两条抗菌肽为从两栖类动物东北林蛙皮肤分泌物中分离得到的序列特异性单链多肽，分子量分别为1459.9和2184.2，等电点分别为9.70和12.60，氨基酸全序列分别为SEQIDNO.1和SEQ ID NO.2。制备方法是收集东北林蛙皮肤分泌物，离心去除沉淀、冷冻干燥后，G50和G25分子筛层析、高压液相反相柱层析分离纯化后得到单一组分。本发明可以在制备治疗微生物感染疾病药物中应用。
Description
技术领域：
本发明属于生物医学领域，尤其涉及从东北林蛙皮肤中分离出抗菌肽及其在抗菌药物中的应用。
背景技术：
自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成就，但随着药物的持续使用，目前微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。万古霉素抗性的葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病目前均是世界范围内的临床难题。三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉素脑膜炎双球菌，肺炎球菌，对抗新头抱菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现。因此新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点。与目前广泛使用的抗生素相比，多肽抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局部感染和全身感染都有效。由此看来，在目前不少病原菌对已有抗生素逐渐产生耐药性，而新的抗生素发现又极为困难的情况下，多肽类物质正成为新一类抗生素的发展对象，其研制目前受到广泛重视。
两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，很多两栖类动物在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如东北林蛙(哈士蟆)、中华蟾蜍、大蹼铃蟾等。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用等。从这些传统药物中寻找特定药理活性的单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点，据文献报道从爪蟾(Xenopus iaevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗肿瘤活性；国外学者也已报道从东方铃蟾(Bombina orientalis)和花铃蟾(Bombina variegata)中分离出若干具广谱抗微生物活性的多肽类物质，如Bombinin和BLP-like多肽。
由于抗菌肽作为新一代抗菌药物的诱人前景，肽类抗生素已引起世界的广泛关注，如Magainin制药公司宣布，他们生产的爪蟾皮肤抗菌肤Magainin类似物MSI-78用于治疗926例糖尿病患者因多种细菌感染而引起足部溃疡的III期临床结果表明，MSI-78与ofloxacin有同样的效果，但产生更小的副作用。Intrabiotics公司生产的抗菌肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验。动物实验研究表明，天蚕抗菌肽和蜂毒抗菌肽的部分序列杂合而成的含12-18氨基酸残基的多肤对绿脓假单胞菌引起的兔眼感染有良好的治疗作用。
我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究还较少。东北林蛙主要分布于我国的东北长白山地区，是我国的特色资源动物之一，也是特色的民族民间药物。
发明内容：
本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有广谱抗微生物(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌、真菌)，抗肿瘤活性的从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽。
本发明的另一目的是提供从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽在抗菌药物中的应用。
为了实现本发明的目的，本发明采用的技术方案是：从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽，其特征在于是从东北林蛙皮肤分泌物中分离得到的两条单链多肽：分子量为1459.9、等电点为9.70的具有序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列的单链多肽，或分子量为2184.2，等电点为12.60的具有序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列的单链多肽。
从东北林蛙皮肤中分离出的两条抗菌肽，是我们首次从两栖类动物东北林蛙皮肤分泌物中分离得到的特异性单链多肽，分子量为1459.9，等电点为9.70，氨基酸全序列为IIPLPLGYFAKKT，我们命名为dybowskin-1CDYa。分子量为2184.2，等电点为12.60，氨基酸全序列为SAVGRHSRRFGLRKHRKH，我们命名为dybowskin-2CDYa。
从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽的制备方法：将活体东北林蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，施加5V～10V的电刺激，收集分泌物，立即加入乙酸使其终浓度为3-5％，进行酸化处理，冷冻干燥；经Sephadex-G50和Sephadex-G25分子筛层析、反相高压液相反相柱层析分离纯化，即可得到具有SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列的两种单链东北林蛙抗菌肽。
从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽在制备治疗微生物感染疾病药物中的应用。
下面用本发明的从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽实验结果来说明本发明抗菌肽的药效作用。
抗菌活性检测：采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入待测菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的牛津杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余牛津杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度。
抗真菌活性检测：采用杯碟法。培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基，分别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的牛津杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的抗菌肽溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10uHn以上的作为最小抑菌浓度。
上述试验重复三次，取平均值。两条抗菌肽的抑菌实验结果如表1和表2。
表1 dybowskin-1CDYa抑菌抑菌活性
| 菌株 | 来源 | 最小抑菌浓度(μg/ml) |
| 革兰氏阴性菌 |
| E.coli | 沈阳市疾控中心 | 25 |
| P.aeruginosa | 沈阳市疾控中心 | 67 |
| 革兰氏阳性菌 | ||
| S.aureus | 沈阳市疾控中心 | 12.5 |
| MRSA* | 沈阳市疾控中心 | 50 |
| B.thuringiensis | 沈阳市疾控中心 | 80 |
| M.luteus | 沈阳市疾控中心 | 4 |
| E.faecium | 沈阳市疾控中心 | 20 |
| 真菌 | ||
| C.parapsilosis | 沈阳出入境检验检疫局 | 20 |
| C.tropicalis | 沈阳出入境检验检疫局 | 20 |
| C.neoformans | 沈阳出入境检验检疫局 | 20 |
| C.krusei | 沈阳出入境检验检疫局 | 30 |
| C.albicans | 沈阳出入境检验检疫局 | 80 |
| C.glabrata | 沈阳市疾控中心 | 80 |
*耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌
表2dybowskin-2CDYa抑菌抑菌活性
| 菌株 | 来源 | 最小抑菌浓度(μg/ml) |
| 革兰氏阴性菌 | ||
| E.coli | 沈阳市疾控中心 | 3 |
| P.aeruginosa | 沈阳市疾控中心 | 67 |
| 革兰氏阳性菌 | ||
| S.aureus | 沈阳市疾控中心 | 12.5 |
| MRSA* | 沈阳市疾控中心 | 10 |
| B.thuringiensis | 沈阳市疾控中心 | 2 |
| M.luteus | 沈阳市疾控中心 | 28 |
| E.faecium | 沈阳市疾控中心 | 6 |
| 真菌 | ||
| C.parapsilosis | 沈阳出入境检验检疫局 | 8 |
| C.tropicalis | 沈阳出入境检验检疫局 | 8 |
| C.neoformans | 沈阳出入境检验检疫局 | 8 |
| C.krusei | 沈阳出入境检验检疫局 | 16 |
| C.albicans | 沈阳出入境检验检疫局 | 30 |
| C.glabrata | 沈阳市疾控中心 | 50 |
*耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌
具体实施方式：
实施例1从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽dybowskin-1CDYa的制备
将活体东北林蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，8V直流电刺激，可见大量的泡沫状物质从东北林蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，立即加入乙酸使其终浓度为4％，酸化处理，冷冻干燥，经SephadexA-50层析后，收取II峰，浓缩，冻干，冻干物经SephadexA-25层析，收取IV峰，浓缩，冻干，再经反相高效液相色谱(HPLC)C18柱分离纯化，取PT-HPLC的峰IV，即为从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽dybowskin-1CDYa。
利用PT-HPLC方法鉴定其纯度。分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment.55 spectrometry，以B一Ms)，测得分子量为1459.9；等电聚焦电泳测定等电点，测得等电点为9.70；用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列。
实施例2从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽dybowskin-2CDYa的制备
将活体东北林蛙用水清洗干净，置于带盖的玻璃容器中，8V直流电刺激，可见大量的泡沫状物质从东北林蛙皮肤分泌出来，收集分泌物，立即加入乙酸使其终浓度为4％，酸化处理，冷冻干燥，经SephadexG-50层析后，收取II峰，浓缩，冻干，冻干物经SephadexA-25层析，收取IV峰，浓缩，冻干，再经反相高效液相色谱(HPLC)C18柱分离纯化，取PT-HPLC的峰VII，即为从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽dybowskin-2CDYa。
利用PT-HPLC方法鉴定其纯度。分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment.55 spectrometry，以B一Ms)，测得分子量为2184.2；等电聚焦电泳测定等电点，测得等电点为12.60；用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所述的氨基酸序列。
序列表
<110>辽宁大学
<120>从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽及其在抗菌药物中的应用
<160>2
<170>ParentIn version 3.1
<210>1
<211>13
<212>PRT
<213>东北林蛙
<400>1
Ile Ile Pro Leu Pro Leu Gly Tyr Phe Ala Lys Lys Thr
1 5 10
<210>2
<211>18
<212>PRT
<213>东北林蛙
<400>2
Ser Ala Val Gly Arg His Ser Arg Arg Phe Gly Leu Arg Lys His
1 5 10 15
Arg lys His
Claims (2)
1.从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽，其特征在于：是从东北林蛙皮肤分泌物中分离得到的单链多肽：分子量为2184.2，等电点为12.60的序列表中SEQ ID N0.2所述的氨基酸序列的单链多肽。
2.权利要求1所述的从东北林蛙皮肤中分离出的抗菌肽在制备治疗微生物感染疾病药物中的应用。
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