KR101624691B1

KR101624691B1 - 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드 및 그의 조성물

Info

Publication number: KR101624691B1
Application number: KR1020140096164A
Authority: KR
Inventors: 황재삼; 윤은영; 남성희; 안미영; 김미애; 이준하; 김인우; 김상희; 이동건; 이원영; 최혜민
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장); 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2014-07-29
Filing date: 2014-07-29
Publication date: 2016-05-27
Also published as: KR20160014805A

Abstract

본 발명은 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드 및 그의 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 항진균 펩타이드는 서열번호 2로 표현되며, 서열번호 1로 표현되는 펩타이드의 유전자에서 연역된 아미노산에서 합성된 것이 특징이다.
본 발명에 의해, 왕지네로부터 분리한 신규 세크로핀 유사 항진균 펩타이드 및 그의 조성물이 제공됨에 따라, 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타냄과 동시에 인체에 안전한 항진균 제제용 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 등을 제공할 수 있게 된다.

Description

신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드 및 그의 조성물{A New Cecropin-like peptide and its synthetic composition}

본 발명은 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드 및 그의 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 왕지네로부터 분리하여 세포 독성이 없으면서 항진균활성을 나타내는 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것이다.

병원성 미생물의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나인데, 불행하게도 항생제의 남용으로 인하여 병원성 미생물의 항생제 저항성 (resistance)이 야기되었다.

실제로, 병원성 미생물이 새로운 항생제에 저항성을 나타내는 속도는 새로운 항생제의 유사체가 개발되는 속도보다 훨씬 더 빠르다.

예를 들면, 생명에 위협을 가할 수 있는 엔테로코쿠스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 아루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등의 병원성 미생물 종들은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 저항력을 키워왔다.

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었으며 페니실린의 작용 기작에 대한 중요한 단서를 제공하였다.

내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 결과적으로 죽지는 않는다.

상기 내성은 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 오토라이신 (autolysin) 등과 같은 세균의 자가분해 (autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문에 생기는데, 이러한 사실은 페니실린이 내인성 가수분해 효소 (endogenous hydrolytic enzyme)를 활성화시킴으로써 세균을 죽이며 세균은 또한 이들의 활성을 억제해서 항생제 치료 시에도 생존하는 결과를 나타내게 된다.

병원성 미생물이 항생제에 대한 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 내성 미생물을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다.

아울러 내성이 생기는 것은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행 조건이라고 간주되며, 이것은 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기기 때문이다.

이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 된다.

실제적으로 모든 저항성을 보이는 병원성 미생물들은 내성도 가지고 있는 것으로 알려져 있으므로, 이러한 항생제 저항성을 가지는 병원성 미생물을 죽일 수 있는 신규의 항생제의 개발은 시급한 실정이다.

상기 살펴본 바와 같이, 항생제에 저항성을 나타내는 병원성 미생물들에 의한 피해를 막기 위하여 새로운 항생제의 개발이 필요하며, 아울러 오토라이신 활성과는 독립적으로 작용하는 새로운 항생제의 개발이 필요하다. 또한, 그러한 새로운 항생제를 병원성 미생물의 감염을 효과적으로 치료하기 위한 약학적 조성물을 제공하는 것이 필요하다.

한편, 생물체의 항상성(homeostasis)을 유지하기 위한 과정에서 중요한 역할을 담당하고 있는 물질들 중 일부가 각종 생물체 유래의 생리 활성 물질이다.

지금까지 수많은 생리 활성 물질에 대해 많은 연구가 진행되고 있으며, 그 중, 각종 생물체에서 분리된 항균 펩타이드는 박테리아, 곰팡이 및 바이러스에 이르기까지 다양하게 작용하는 것으로 알려져 있다. 또한 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있다.

관련 선행기술로 한국등록번호 제10-0625875호 (아스퍼질러스 니듈란스로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물)과 한국등록특허 제10-0964136호(울도하늘소유충으로부터 분리한 항균 및 항진균 펩타이드 유전자 및 항균 및 항진균 활성을 가지는 합성펩타이드)에 관한 것이 공지되어 있으나, 현재까지 왕지네로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이들의 신규 용도에 대한 연구는 아직 미흡한 실정이다.

본 발명의 목적은 진균성 질환 치료용 항생제로 이용할 수 있도록 세포독성이 없고 우수한 항진균 활성을 갖는 왕지네로부터 분리된 신규한 세크로핀 유사 펩타이드 및 그의 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 항진균 펩타이드는 서열번호 2로 표현되며, 서열번호 1로 표현되는 펩타이드의 유전자에서 연역된 아미노산에서 합성된 것이 특징이다.

상기 펩타이드는 왕지네(Scolopendra subspinipes)로부터 분리하며, 진균 세포내 활성산소를 생성시켜 세포자살을 유도하는 것이 특징이다.

상기 펩타이드는 항진균활성을 갖는 것을 특징으로, 특히 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii) 중 선택된 어느 하나에 대하여 항진균활성을 나타내는 것이 특징이다.

상기 펩타이드는 사람의 적혈구 세포에 대해 무독성인 것이 특징이다.

본 발명은 상기와 같은 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항진균 제제용 약학적 조성물 또는, 항생제 또는, 식품 방부제 또는, 화장품 보존제 또는, 의약품 보존제를 제공하고자 한다.

본 발명에 의해, 왕지네로부터 분리한 신규 세크로핀 유사 항진균 펩타이드 및 그의 조성물이 제공됨에 따라, 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타냄과 동시에 인체에 안전한 항진균 제제용 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품 등이 제공하게 된다.

도 1은 왕지네로부터 분리한 본 발명의 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드와 세크로핀(Cecropin) A의 서열 상동성을 나타낸 도면이다.
도 2는 왕지네로부터 분리한 본 발명의 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드의 진균 세포자살능을 나타낸 도면이다.
도 3은 왕지네로부터 분리한 본 발명의 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드에 의한 진균 세포내에 활성산소 생성능을 나타낸 도면이다.
도 4는 왕지네로부터 분리한 본 발명의 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드에 의한 미토콘드리아 막의 탈분극 현상을 나타낸 도면이다.
도 5는 왕지네로부터 분리한 본 발명의 신규한 세크로핀 유사 항진균 펩타이드에 의한 메타카스파아제 활성유무를 나타낸 도면이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 왕지네(Scolopendra subspinipes)로부터 분리한 항진균 펩타이드는 본 발명은 항진균 펩타이드는 서열번호 2로 표현되며, 서열번호 1로 표현되는 펩타이드의 유전자에서 연역된 아미노산에서 합성된 것이 특징이다.

설명하면, 본 발명에서는 왕지네(Scolopendra subspinipes) 유래 펩타이드 유전자를 확인하기 위해 먼저 왕지네를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하고, 이를 RNA seq 분석법을 이용하여 왕지네 전사체들에 관한 유전자 정보를 확인하며, 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산의 서열을 바탕으로 blast룰 이용하여 기존의 펩타이드인 세크로핀(Cecropin A)와 18.75%의 상동성을 갖는 펩타이드 유니진을 발견한다.

상기 펩타이드의 아미노산 서열은 MDSFQKIEKIGEGTYGVVYKAKDKVSGRLVALKKIRLENESEGVPSTA-NH₂으로 48개 아미노산으로 구성되었으며 이를 본 발명에서는 '세크로핀(Cecropin) 유사 항진균 펩타이드'로 명명한다.

이러한 상기 펩타이드는 항진균 활성을 나타내며, 특히 사람의 적혈구 세포에 대해 무독성이므로, 이를 유효성분으로 포함하는 항진균 제제용 약학적 조성물 또는, 항생제 또는, 식품 방부제 또는, 화장품 보존제 또는, 의약품 보존제를 제공하게 된다.

이러한 상기 펩타이드는 사람의 적혈구 세포에 대해 무독성임과 동시에 진균 세포 내 활성산소를 생성시켜 세포자살을 유도함으로써 항진균활성을 나타내는 것이 특징이다.

이에 상기와 같은 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 항진균 제제용 약학적 조성물 또는, 항생제 또는, 식품 방부제 또는, 화장품 보존제 또는, 의약품 보존제의 제공이 가능하게 된다.

구체적으로 설명하면 본 발명자들은 상기 세크로핀 유사 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위해 항진균 활성 대상균으로 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii)를 실시한 바, 강력한 항진균 활성을 나타냄을 알 수 있다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 신규 세크로핀 유사 항진균 펩타이드의 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 사람의 적혈구 세포 파괴능을 조사한 결과, 본 발명의 신규 세크로핀 유사 항진균 펩타이드는 세포독성을 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있다.

상기의 결과로부터, 본 발명의 신규 세크로핀 유사 항진균 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 탁월한 항진균 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항진균제로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이때, 상기 약학적 조성물은 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 신규 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신규 펩타이드의 유효 용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하기 로는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드 및 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규 펩타이의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명은 신규 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항진균 제제용 항생제 또는, 식품 방부제 또는, 화장품 보존제 또는, 의약품 보존제를 제공한다.

이때, 식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 식품의 방부제 및 화장품, 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다.

본 발명의 신규 세크로핀 유사 항진균 펩타이드는 도 1 내지 4 및 표 2, 3에 나타난 바와 같이 강력한 항진균 활성을 나타내고 독성이 없으므로 항진균 제제용 식품의 방부제, 화장품 및 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1> 왕지네 유래 세크로핀 유사 펩타이드 선발

왕지네로부터 항진균활성을 나타내는 펩타이드를 확인하기 위해 먼저 왕지네를 액체질소로 급속 동결하여 전체 RNA를 분리하였고, 이를 RNA seq 분석법을 이용하여 왕지네 전사체들에 관한 유전자 정보를 확인 하였으며 각각의 전사체들로부터 번역된 아미노산의 서열을 바탕으로 blast를 이용하여 기존의 밝혀진 항균 펩타이드와의 상동성 여부를 확인하였다.

그 결과, 도 1에 나타나 있듯이 세크로핀(Cecropin) A와 18.75%의 서열 상동성을 보인 아미노산을 확인하였으며, 이를 생합성하여 실험에 사용하였다.

이렇게 생합성한 펩타이드의 아미노산 서열은 MDSFQKIEKIGEGTYGVVYKAKDKVSGRLVALKKIRLENESEGVPSTA-NH₂으로 48개 아미노산으로 구성되었으며, 왕지네 유래 세크로핀 유사 펩타이드로 명명하였다[표 1].

펩타이드	서열 (서열번호 2)	분자량(달톤)		전하	보유시간 (Retention) time
		계산값	관찰값
세크로핀 유사 항진균펩타이드	MDSFQKIEKIGEGTYGVVYKAKDKVSGRLVALKKIRLENESEGVPSTA	5270.0	5269.4	+2	19.792

< 실시예 2> 세크로핀 유사 항진균 펩타이드의 합성 및 분리정제

상기 실시예 1에서 왕지네로부터 유래하는 세크로핀 유사 항진균 펩타이드를 합성 및 분리 정제하였다.

먼저, 세크로핀 유사 항진균 펩타이드를 합성하기 위하여, 본 발명자들은 Fmoc 아미노기 보호용기를 이용한 메리필드(Merrifield)의 액상 고상법을 사용하여 펩타이드를 제조하였다.

상기 펩타이드 합성의 방법은 Fmoc(9-fluorenylmethoxycarbonyl)를 아미노산의 N_α-아미노그룹(amino group)의 보호기(protecting group)로 사용하는 고상법(solid phase method)으로 합성하였다.

구체적으로, 카르복실 말단이 -NH₂ 형태인 펩타이드는 Rink Amide MBHA-Resin을 출발물질로 사용하였으며, 카르복실 말단이 -OH 형태의 펩타이드는 Fmoc-아미노산-Wang Resin을 출발물질로 사용하였다.

Fmoc-아미노산의 커플링(coupling)에 의한 펩타이드 사슬의 연장 (elongation)은 DCC(N-hydroxybenzo-triazole(HOBt)-dicyclo-hexylcar-bodiimide)법에 의하였다.

각 펩타이드의 아미노 말단의 Fmoc-아미노산을 커플링 시킨 후, 20% 피페리딘/N-메틸피롤리돈(NMP)용액으로 Fmoc기를 제거하고 NMP 및 디클로로메탄(DCM)으로 여러 번 씻어준 다음 질소 가스로 말렸다.

여기에 TFA(trifluoroacetic acid)-phenol-thioanisole-H₂O-triisop- ropylsilane (85: 5: 5: 2.5: 2.5, vol./vol.) 용액을 가하고 3시간 동안 반응시켜 보호기의 제거 및 레진으로부터 펩타이드를 분리시킨 다음, 디에틸에테르로 펩타이드를 침전시켰다. 이렇게 하여 얻은 조(crude) 펩타이드는 0.1% TFA가 포함된 아세토니트릴 농도 구배(acetonitrile gradient)로 하여 정제형 역상-HPLC(reverse phase-HPLC) column (Delta Pak, C₁₈ 300Å, 15μ, 19.0 mm×30 , Waters)을 이용하여 정제하였다.

합성 펩타이드를 6N-HCl로 110℃ 에서 24시간 동안 가수분해한 후, 얻어진 잔사를 감압농축 한 뒤, 0.02N-HCl에 녹여서 아미노산 분석기(Hitachi 8500 A)로 아미노산 조성을 측정하였다.

또한 합성된 펩타이드의 시퀀스(sequence)를 바탕으로 분자량을 계산하였고, MALDI 질량 분석법(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometer)을 이용하여 정확한 분자량을 측정하였다.

그 결과 측정된 분자량과 계산된 분자량이 일치하므로 정확한 아미노산 서열(서열번호 2)을 가지는 항진균 펩타이드가 합성되었음을 확인하였다.

< 실시예 3> 세크로핀 유사 항진균 펩타이드의 병원성 진균에 대한 항진균 활성 조사

실시예 2에서 합성된 본 발명의 세크로핀 유사 항진균 펩타이드에 대한 항진균 활성을 조사하기 위해 MIC(minimum inhibitory concentration)를 수행하였다. 이때 꿀벌로부터 분리된 강력한 항진균 펩타이드인 멜리틴(Melittin)을 본 발명에서 양성 대조구로 사용하였다. 본 발명에서 항진균 펩타이드는 -20℃에 보관하며, 멸균된 3차 증류수에 녹여서 사용하였다.

사용균주(fungal cell)로는 병원성 진균인 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii KCTC 7707), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus KCTC 1375)는 한국생명공학연구소 Korean Collection for Type Culture (KCTC)에서 분양받았으며 캔디다 알비칸스(Candida albicans ATCC 90028), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis ATCC 22019)는 American Type Culture Collection (ATCC)에서 분양받아 사용하였다.

1. 실험방법

Cecropin A와 상동성이 확인 된 상기 본 발명의 세크로핀 유사 펩타이드의 항진균 활성을 측정하기 위하여, 상기 모든 균주는 YPD 배지(1 % yeast extract, 2 % peptone, 2 % dextrose)에서 Mid-log phase까지 배양하였다.

진균 수는 각 well당 2 × 10⁶ cells가 되도록 진균을 포함한 YPD 배지를 100 μl씩 분주한 후, 단계적으로 희석한 펩타이드 용액을 각 well당 10 μl씩 넣고, 28 ℃ 배양기에서 18 시간 배양하였다.

MTT [3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium bromide] 용액 [5 ㎎ of MTT/㎖ of PBS (pH 7.4)]을 각각의 well에 넣고 37 ℃ 배양기에서 4 시간 동안 배양하였으며, 각 well의 흡광도를 ELISA reader (Molecular Devices Emax, USA)로 580 nm에서 측정하여 흡광도가 나타나지 않은 농도를 최저 생육 저지 농도 (MIC: minimum inhibitory concentration)로 결정하였으며 그 결과는 하기 표 2와 같이 나타났다.

2. 실험결과

균주종류(Fungal strains)	MIC(μM)
균주종류(Fungal strains)	본 발명의 세크로핀 유사 항진균 펩타이드	멜리틴(Melittin)
C. albicans ATCC 90028	10.0	2.5
C. parapsilosis ATCC 22019	10.0~20.0	2.5
T. beigelii KCTC 7707	20.0	2.5
A. flavus KCTC 1375	20.0	5.0

상기 표 2에 나타나 있듯이, 세크로핀 유사 항진균 펩타이드는 10~20μM농도에서 항진균 활성을 보임을 확인하였으며, 이는 대조군인 사용된 강력한 항진균제인 멜리틴만큼 강한 항진균 활성으로 본 발명의 상기 펩타이드가 강력한 항진균 활성을 나타냄을 의미한다.

<실시예 4> 세크로핀 유사 항진균 펩타이드의 진균 세포자살 기작 유도

1. 실험방법

세포벽을 제거한 진균을 1M 솔비톨(sorbitol)을 함유하는 PPB(Potassium phosphate buffer) 10ml에 2 × 10⁶ cells/ml이 되도록 하여 일정량의 펩타이드 용액과 함께 28 ℃ 배양기에서 4 시간 배양하였다.

1 M sorbitol을 함유하는 PPB로 여러 번 씻어준 다음 1 ml Binding Buffer에 5 μl 의 FITC Annexin V 와 5 μl의 Propidium iodide (PI)를 섞어 준 후 15 분간 25 ℃ 암실에서 보관하였다.

세포막 외부로의 포스파티딜세린(Phosphatidylserine)의 노출을 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)로 분석하였다

2. 실험결과

상기 실험결과 도 2에 나타나 있듯이, 실시예 2에서 합성된 본 발명의 세크로핀 유사 펩타이드(Scolopendra Cecropin A)에 의한 세포막 외부로의 Phosphatidylserine의 노출을 확인할 수 있었으며 이를 바탕으로 진균 세포자살 기작을 통해 항진균 활성을 보임을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5> 세크로핀 유사 펩타이드에 의한 진균 세포 내 활성산소 생성

1. 실험방법

진균은 YPD 배지에서 Log phase까지 배양시키고 진균 수는 각 EP-tube당 2 × 10⁶ cells/ml가 되도록 진균을 1 ml씩 분주하였다.

희석한 펩타이드 용액을 각 EP-tube에 넣고 28 ℃ 배양기에서 4 시간 배양하였다. PBS (pH 7.4)로 여러 번 씻어준 다음 10 μg/ml의 DHR-123(Dihydrorhodamine-123)으로 염색한 후 FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 통해 활성산소 생성유무를 형광의 변화로 측정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 3에 나타나 있듯이, 실시예 2에서 합성된 본 발명의 세크로핀 유사 펩타이드(Scolopendra Cecropin A)에서 진균 세포 내에 활성산소를 생성시키는 것을 확인할 수 있었으며 이를 바탕으로 세포자살을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

< 실시예 6> 세크로핀 유사 펩타이드에 의한 미토콘드리아 막의 탈분극

1. 실험방법

진균 수가 각각 EP-tube당 2 × 10⁶ cells/ml가 되도록 분주한 후, 희석한 펩타이드 용액을 각 EP-tube에 넣고 28 ℃ 배양기에서 4 시간 배양하였다.

PBS (pH 7.4)로 여러 번 씻어준 다음 0.25 mM의 5,5,6,6-tetrachloro-1,1,3,3-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide (JC-1)으로 35 ℃에서 15 분동안 염색하였다.

FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 통해 미토콘드리아 막 전위의 변화를 형광의 변화로 측정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 4에 나타나 있듯이, 실시예 2에서 합성된 본 발명의 세크로핀 유사 펩타이드(Scolopendra Cecropin A)에 의한 미토콘드리아 막의 탈분극을 확인할 수 있었으며 이를 바탕으로 진균 세포자살이 미토콘드리아를 매개함을 확인할 수 있었다.

<실시예 7> 세크로핀 유사 펩타이드에 의한 메타카스파아제 (Metacaspase) 활성화

1. 실험방법

YPD 배지에서 진균을 Log phase까지 배양하고 2 × 10⁶ cells/ml가 되도록 각 EP-tube당 1 ml씩 분주하였다.

희석한 펩타이드 용액을 각 EP-tube에 넣고 28 ℃ 배양기에서 4 시간 배양하였다. PBS (pH 7.4)로 여러 번 씻어준 다음 10 μM의 CaspACETM FITC-VAD-FMK In Situ Marker로 상온에서 30 분동안 염색을 실시하였다.

FACSCalibur flow cytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA)를 통해 메타카스파아제 활성유무를 형광의 변화로 측정하였다.

2. 실험결과

상기 실험결과 도 5에 나타나 있듯이, 실시예 2에서 합성된 본 발명의 세크로핀 유사 펩타이드(Scolopendra Cecropin A)에 의한 메타카스파아제 활성화를 확인할 수 있었으며 이를 바탕으로 세포자살을 유도하는 것을 확인할 수 있었다.

<실시예 8> 세크로핀 유사 항진균 펩타이드의 인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성 측정

인간 적혈구 세포에 대한 세포 독성의 측정은 다음과 같이 실시하였다.

1.실험방법

적혈구 세포(Human erythrocytes)를 인산-염화나트륨 완충액, pH 7.4 (PBS)로 세 번 세척한 후, 인산-염화나트륨 완충액으로 희석하여, 8.0 %의 적혈구 세포 용액을 제조하였다.

그런 후, 8.0 % 적혈구 세포 용액을 96-웰 플레이트에 100㎕ 씩 분주한 후에 펩타이드의 단계적으로 희석한 용액을 섞어주었다.

이어서 모든 웰에 총액의 양이 200㎕ 가 되도록 생리 식염수 (Saline 0.85 % NaCl)을 넣어주고, 37℃ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다.

상기 배양이 끝난 후, 원심 분리기에서 1000 rpm의 회전 속도로 10분간 원심 분리하여 상등액을 옆 웰로 옮겼다.

적혈구 세포에 대한 파괴능은 ELISA 판독기로 414 nm의 파장 하에서의 흡광도를 측정하여 파괴능을 분석하였다.

그리고 대조군으로 0.1 % 트리톤 X-100으로 처리하였을 경우의 값을 100 % 파괴능으로 계산하였으며, 적혈구 세포만을 넣은 경우를 0 % 파괴능으로 계산하였다.

이때 항진균 펩타이드의 파괴능은 하기 수학식 1에 의하여 계산하였으며, 얻어진 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[수학식 1]

% 파괴능 = (펩타이드를 처리한 용액의 흡광도 414 nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도 414 nm)/(트리톤 X-100을 처리한 용액의 흡광도 414 nm - 인산-염화나트륨 완충액의 흡광도 414 nm) * 100

2. 실험결과

	용혈(Hemolysis, %)
	80.0μM	40.0μM	20.0μM	10.0μM	5.0μM	2.5μM	1.3μM
본 발명인 실시예2의 세크로핀 유사 항진균 펩타이드	0	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	98.4	74.0	36.7	13.4	0

상기 표 3에 나타나 있듯이, 본 발명의 세크로핀 유사 항진균 펩타이드는 모든 농도에서 세포 독성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 그에 비해 강력한 항진균 펩타이드인 멜리틴의 경우에는 낮은 농도에서도 세포 독성이 매우 높게 나타냄을 확인 할 수 있었다.

이러한 결과는 본 발명에서 발견된 펩타이드는 세포 독성이 없고 탁월한 항진균 활성을 나타냄과 동시에 인체에 안전한 항진균 제제용 항생제, 식품 방부제, 화장품 보존제, 의약품으로 사용가능함을 의미한다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> REPUBLIC OF KOREA(MANAGEMENT : RURAL DEVELOPMENT ADMINISTRATION) <120> A New cecropin-like peptide and its synthetic composition <130> p2013-0127 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 144 <212> DNA <213> Scolopendra subspinipes <400> 1 atggattcgt ttcaaaaaat tgaaaaaatt ggcgaaggga cttacggtgt tgtttataaa 60 gccaaagata aggtcagcgg acgacttgtg gccttaaaga agatcagatt agaaaatgaa 120 tcagaaggtg tgccaagtac tgcc 144 <210> 2 <211> 48 <212> PRT <213> cecropin-like peptide <400> 2 Met Asp Ser Phe Gln Lys Ile Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly 1 5 10 15 Val Val Tyr Lys Ala Lys Asp Lys Val Ser Gly Arg Leu Val Ala Leu 20 25 30 Lys Lys Ile Arg Leu Glu Asn Glu Ser Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala 35 40 45

Claims

하기 서열번호 2로 표현되는 항진균 펩타이드.
서열번호 2:
Met Asp Ser Phe Gln Lys Ile Glu Lys Ile Gly Glu Gly Thr Tyr Gly
Val Val Tyr Lys Ala Lys Asp Lys Val Ser Gly Arg Leu Val Ala Leu
Lys Lys Ile Arg Leu Glu Asn Glu Ser Glu Gly Val Pro Ser Thr Ala
청구항 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항진균 펩타이드.
청구항 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 왕지네(Scolopendra subspinipes)로부터 분리하는 것을 특징으로 하는, 항진균 펩타이드
청구항 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 진균 세포내 활성산소를 생성시켜 세포자살을 유도하는 것을 특징으로 하는, 항진균 펩타이드
청구항 2항에 있어서,
상기 항진균 활성은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 캔디다 파랍실로시스(Candida parapsilosis), 아스퍼질러스 플라부스(Aspergillus flavus), 트리코스포론 베이겔라이(Trichosporon beigelii) 중 선택된 어느 하나에 대하여 나타나는 것이 특징인, 항진균 펩타이드.
청구항 1항에 있어서,
상기 펩타이드는 사람의 적혈구 세포에 대해 무독성인 것을 특징으로 하는, 항진균 펩타이드.
청구항 1항 내지 6항 중 선택된 어느 한항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항진균 제제용 약학적 조성물.
청구항 1항 내지 6항 중 선택된 어느 한항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 항생제
청구항 1항 내지 6항 중 선택된 어느 한항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 식품 방부제.
청구항 1항 내지 6항 중 선택된 어느 한항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 화장품 보존제.
청구항 1항 내지 6항 중 선택된 어느 한항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는, 의약품 보존제.
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