CN111087460B

CN111087460B - 一种广谱型抗菌肽及其应用

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Publication number: CN111087460B
Application number: CN202010037156.2A
Authority: CN
Inventors: 谢芳; 刘思国; 张万江; 张跃灵
Original assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Current assignee: Harbin Veterinary Research Institute of CAAS
Priority date: 2020-01-14
Filing date: 2020-01-14
Publication date: 2021-07-30
Anticipated expiration: 2040-01-14
Also published as: CN111087460A

Abstract

本发明公开了一种广谱型抗菌肽及其应用，属于医药技术领域。所述的抗菌肽，命名为26M，其含有18个氨基酸残基，分子量2475.16道尔顿，等电点12.03，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1所示。实验证明，该抗菌肽具有显著抑制多种病原菌生长和繁殖的作用，所述的病原菌包括大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素屎肠球菌。本发明提供的一种新型的具有广谱抗菌作用的抗菌肽，能够替代传统抗生素，且不易产生耐药性，在对抗病原菌引起的感染性疾病中将具有很好的应用前景。

Description

一种广谱型抗菌肽及其应用

技术领域

本发明涉及一种抗菌肽及其应用，特别涉及一种具有广谱抑菌效果的抗菌肽及其应用。本发明属于医药技术领域。

背景技术

随着传统抗生素的滥用，细菌对抗生素的耐药周期不断缩短，导致了近年来多重耐药菌泛滥成灾。由于细菌耐药性产生和变异的速度不断加快，而抗生素新药研发却十分缓慢。目前，严重的细菌耐药性加大了对人类和动物疫病防治的难度，已成为危害现代养殖业、食品安全和公共卫生安全的重大问题。2006年欧盟开始全面禁止使用抗生素生长促进剂，我国也于2019年发布了饲料“禁抗”令(第194号公告)，明确了严禁使用含有促生长类药物饲料添加剂，积极推进养殖业实现饲料“禁抗”、养殖“减抗”、产品“无抗”的发展方向，鼓励研发安全高效的新型研发抗菌药物以替代传统抗生素。

抗菌肽(antimicrobial peptides,AMP)是一类具有抗菌作用的免疫活性短肽，一般含有10-60个氨基酸，广泛存在于生物界，是动物天然免疫系统的重要组成部分。抗菌肽的二级结构通常可分为α-螺旋结构、β-折叠结构和延展结构等。大多数抗菌肽具有广谱的抗菌活性，对革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌、真菌、病毒、寄生虫等具有良好的杀伤活性。此外，有些抗菌肽还具有抗肿瘤、调节免疫和促进伤口修复的功能。抗菌肽独特的杀菌作用机理和不易产生耐药性的独特优势，有望成为替代传统抗生素的新型绿色药物，因此基于抗菌肽的设计和改造成为时下新型抗菌药物的研究热点。

Eotaxin-3/CCL26属于趋化因子家族，是人白细胞的重要的趋化因子和促炎因子。Eotaxin-3/CCL26含有71个氨基酸，分子量为8.4kDa，其结构包括靠近N端的两个相邻的半胱氨酸残基、3个β-折叠和靠近C端的1个α-螺旋。已有研究表明，Eotaxin-3/CCL26对革兰氏阳性菌和阴性菌均具有杀菌活性。本课题组前期研究发现Eotaxin-3/CCL26发挥抗菌功能的结构为C端的α螺旋结构。因此，本发明以Eotaxin-3/CCL26为模板，对其C端最后18个氨基酸序列区域(命名为26C)进行截取，采用氨基酸替换的方式设计合成了具有正电荷和两亲性的多肽(命名为26M)，并增加了α螺旋含量以提高其杀菌效率。实验证明，改造后的多肽26M提高了对多种病原菌的杀菌能力，所述细菌包括大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素屎肠球菌。

发明内容

本发明的目的在于提供一种安全有效的新型广谱型抗菌肽及其应用。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明截取CCL26的C端18个氨基酸，将其命名为26C(氨基酸序列为RKKWVQKYISLLKTPKQL，SEQ ID NO.2所示)，采用氨基酸替代法设计26C衍生肽，将其命名为26M(氨基酸序列为RKKWRKVYKRLKRLFKKL，SEQ ID NO.1所示)。实验证明，改造后的多肽26M对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌活性和杀菌活性较原始肽26C显著提高，并且使用安全。

因此，在上述研究的基础上，本发明提出了一种广谱型抗菌肽，命名为26M，所述的抗菌肽具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

编码所述的广谱型抗菌肽的核苷酸序列也在本发明的保护范围之内。

进一步的，本发明还提出了所述的广谱型抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

其中，优选的，所述的抗菌剂具有抑制以下病原菌生长和繁殖的作用：大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素屎肠球菌。

相较于现有技术，本发明的有益效果是：

本发明提供了一种新型的具有广谱抗菌作用的抗菌肽，该抗菌肽具有显著抑制多种病原菌生长和繁殖的作用，所述的病原菌包括大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素屎肠球菌，能够替代传统抗生素，且不易产生耐药性。本发明的一种新型的具有广谱抗菌作用的抗菌肽在对抗病原菌引起的感染性疾病中将具有很好的应用前景。

附图说明

图1为多肽26C和26M分别在10mM PBS、H₂O、50％TFE及30mM SDS中的圆二色谱；

图2为不同温度处理后多肽26M对猪链球菌的抗菌活性；

图3为多肽26C和26M在不同时间点的膜透化效率；

图4为多肽26C和26M作用菌体后透射电镜结果；

其中：A.PBS组；B.26C组；C.26M组；

图5为多肽26C和26M注射小鼠后肝、脾、肾组织的病理变化图；

图6为小鼠生存率曲线；

图7为小鼠感染48小时肝脏(A)、肾脏(B)以及脾脏(C)的荷菌量变化。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1多肽26M的抗菌活性研究

1材料与方法

1.1材料：

1.1.1菌株

大肠埃希菌ATCC 25922、沙门菌ATCC 51741、铜绿假单胞菌ATCC 27853、鲍曼不动杆菌ATCC 19606、肺炎克雷伯菌ATCC 700603、猪链球菌ATCC 43765、金黄色葡萄球菌ATCC29213、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌ATCC 33591和耐万古霉素屎肠球菌ATCC 700221购自美国模式培养物集存库。

1.1.2药品与试剂

胰蛋白大豆肉汤培养基(Tryptical soy broth,TSB)和胰蛋白大豆琼脂培养基(Tryptical soy agar,TSA)购自美国BD公司、10mM的磷酸盐缓冲液(Phosphate BufferSaline,PBS)、三氟乙醇(Trifluoroethanol,TFE)购自美国Sigma公司、30mM SDS购自美国Amresco公司。

1.1.3仪器

分析天平购自美国DENVER公司、小型台式离心机购自美国BECKMAN公司、多功能酶标仪购自美国PerkinElmer公司、细胞培养摇床购自美国CRYSTAL公司、细胞培养箱购自上海精宏实验设备有限公司、水浴锅购自上海慧泰仪器制造有限公司、组织研磨仪购自德国QIAGEN公司。

1.1.4实验动物

6周龄雌性BALB/c小鼠，SPF级，体重约18～20g，购自北京维通利华有限公司。

1.2方法：

1.2.1多肽的改造与合成

截取CCL26的C端18个氨基酸，将其命名为26C(氨基酸序列为RKKWVQKYISLLKTPKQL，SEQ ID NO.2所示)，采用氨基酸替代法设计26C衍生肽，将其命名为26M(氨基酸序列为RKKWRKVYKRLKRLFKKL，SEQ ID NO.1所示)。多肽由采用固相化学合成法合成，反相高效液相色谱纯化，纯度≥98％，纯化后多肽进行氨基酸分析及质谱鉴定。

1.2.2菌种复苏

将各菌株分别划线接种于LB或者TSA固体培养基上，放置37℃培养并传代三次。

1.2.3最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)的测定

MIC和MBC的测定参照CLSI的标准方法进行。挑取细菌单菌落接种于液体培养基中，37℃培养16小时。用液体培养基调整菌数为2×10⁶CFU/ml。在96孔培养板上分别加入100μl不同浓度的多肽26C和26M，每孔加入100μl稀释好的菌液，设置三组重复。将96孔培养板置于37℃培养箱内孵育16h，观察孔内液体浑浊情况，以能够完全抑制细菌生长的最低浓度为MIC值。从每孔中取出100μl培养物倍比稀释涂布固体培养基，37℃培养箱中过夜培养后，观察菌落生长情况，以细菌完全被杀死的最低浓度为MBC值。

1.2.4二级结构检测

将多肽26C和26M分别溶于纯水、10mM PBS(pH 7.4)、50％TFE及30mM SDS溶液中，配制成一定浓度的多肽溶液进样圆二色谱仪。在室温下进行CD谱测定，圆二色谱石英样品池的光程为0.1cm，扫描测定波长范围为198-260nm，每个样品扫描3次取平均值。

1.2.5热稳定性实验

将浓度为64μM的多肽溶液分别在17℃、27℃、37℃、47℃和57℃条件下作用1小时。将处于对数生长期的细菌用PBS清洗三次后重悬，调整菌数为2×10⁸CFU/ml。在96孔细胞培养板上加入100μl处理后的多肽26C和26M分别与100μl细菌悬液充分混匀，未加多肽的细菌作为对照，在37℃培养箱中孵育6小时后取出。每组做三个重复。用多功能酶标仪对各组样本的OD_600nm值进行检测。

1.2.6膜透化实验

挑取猪链球菌单菌落于TSB培养基中，37℃培养4小时。将在对数生长期的细菌用PBS清洗三次后用10mM PBS重悬，调整菌液浓度为10⁶CFU/ml。然后加入终浓度为0.5μM的SYTOX Green溶液在黑暗中孵育15min，再加入终浓度为8μM的多肽。用多功能酶标仪在不同的时间段进行检测，激发波长和发射波长分别为485nm和520nm。阴性对照用PBS代替多肽溶液。

1.2.7透射电镜实验

将处于对数生长期的细菌用PBS清洗三次并用PBS重悬，将菌量调整为约2×10⁸CFU/ml。加入终浓度为8μM的多肽溶液，在37℃培养箱孵育1小时。阴性对照为不加入多肽的菌液。以3500rpm离心10min后制备电镜样本进行透射电镜拍摄。

1.2.8小鼠毒性试验

选取6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，标准条件下饲养适应3天，随机分成3组：PBS组、26C组、26M组，每组5只。将多肽26C和26M用PBS配置成浓度为256μM的溶液，每只小鼠腹腔注射200μl，连续饲养7天，每天观察并记录小鼠的健康状态、精神状态。第7天脱颈椎处死小鼠，采集肝、脾、肾组织观察，在10％福尔马林溶液中固定过夜，制备病理切片并HE染色，拍摄图片。

1.2.9小鼠治疗实验

选取6周龄SPF级雌性BALB/c小鼠，标准条件下饲养适应3天。将处于对数生长期的细菌用PBS清洗三次，3500rpm离心后用PBS重悬并将菌量调整为2×10⁷CFU/ml。每只小鼠腹腔注射200μl菌液。将多肽配置成32μM的PBS溶液，1小时后腹腔注射200μl多肽或PBS，分组如下：26C治疗组、26M治疗组、未治疗组、PBS对照组，每组10只。每天观察小鼠状态并记录小鼠的生存情况连续一周。

参照上述试验分组和治疗方案进行体内荷菌数的测定，每组5只小鼠，在治疗48h后，将小鼠脱颈椎处死，用医用酒精后进行皮肤消毒。在无菌条件下取出肝、脾、肾，加入1mlPBS研磨，制备成匀浆液，将匀浆液倍比稀释后，取100μl稀释液均匀涂布于TSA平板上，置于37℃培养箱内过夜培养，第二天进行菌落计数。

2.结果

2.1多肽的性质

多肽26C分子量为2257.79Da，等电点10.68，正电荷为+6；多肽26M分子量为2475.16Da，等电点12.03，正电荷为+11。

2.2MIC和MBC的测定

MIC和MBC的测定结果如表1所示，多肽26M对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌活性和杀菌活性较原始肽26C显著提高。

表1多肽26C和26CM对不同菌株的MIC值和MBC值

2.3多肽的二级结构

圆二色谱结果显示，在10mM PBS缓冲液和去离子水中，多肽26C和26M在200nm波长附近都呈现负的特征性尖峰，这表明多肽26C和26M在此条件下形成无规卷曲结构；而在模拟细菌细胞膜的条件下，如50％TFE和30mM SDS溶液中，多肽26C和26M在200到210nm之间显示负峰，在222nm处也出现一个负峰，这表明多肽26C和26M均有α螺旋结构，且26M呈现更大的负峰，说明多肽26M比改造前的原始肽26C的具有更多的α螺旋。结果如图1所示。

2.4多肽26M的热稳定性检测

分别于17℃、27℃、37℃、47℃、57℃条件下处理多肽26M并作用于猪链球菌后，样品的OD₆₀₀nm值分别为0.021、0.014、0.015、0.028、0.045。经统计学分析发现，热处理后的多肽26M的抗菌活性没有显著变化，如图2所示。

2.5多肽26C和26M对猪链球菌的膜透化

用SYTOX染色法测量不同作用时间点多肽26C和26M对猪链球菌的膜透化效率。结果如图3所示，改造后的多肽26M比原始肽26C破坏细菌细胞膜的能力增强。

2.6多肽作用后猪链球菌的透射电镜结果

多肽26M与猪链球菌作用1小时后，近2/3的细菌被杀灭，其细胞膜发生明显损伤，细胞内容物外渗；多肽26C组仅能观察到少数菌体裂解现象。结果如图4所示。

2.7小鼠毒性试验

腹腔注射多肽7天内，多肽26C组和26M组小鼠健康状态良好，采食和饮水正常，与对照组相比均无明显差异。第7天采集肝、脾、肾组织未呈现明显的眼观变化，进行HE染色，病理切片结果显示均未出现组织病理学变化，如图5所示。

2.8小鼠生存率曲线

感染后第1天，未治疗组和多肽26C组开始出现小鼠死亡，生存率随感染天数呈下降趋势。感染后第3天，未治疗组已90％小鼠死亡；多肽26M组仅在第4天和第6天各死亡1只，生存率为80％，而26C组生存率为20％，未治疗组生存率为10％，如图6所示。该结果表明多肽26M对猪链球菌感染具有良好的治疗效率。

2.9各脏器荷菌数

在小鼠感染后48h后采集肝、脾和肾组织，检查各脏器的荷菌数。与多肽26C组相比，多肽26M组各脏器荷菌数均有明显下降，多肽26C组与未治疗组的荷菌数未有明显差异，结果如图7所示。

序列表

<110> 中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）

<120> 一种广谱型抗菌肽及其应用

<160>2

<170>Patent-In 3.5

<210>1

<211>18

<212>PRT

<213> artificial sequence

<400>1

Arg Lys Lys Trp Arg Lys Val Tyr Lys Arg Leu Lys Arg Leu Phe 15

Lys Lys Leu 18

<210>2

<211>18

<212>PRT

<213>CCL26

<400>2

Arg Lys Lys Trp Val Gln Lys Tyr Ile Ser Leu Leu Lys Thr Pro 15

Lys Gln Leu 18

Claims

1.一种广谱型抗菌肽，命名为26M，其特征在于，所述的抗菌肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.编码权利要求1所述的广谱型抗菌肽的核苷酸序列。

3.权利要求1所述的广谱型抗菌肽在制备抗菌剂中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的抗菌剂具有抑制以下病原菌生长和繁殖的作用：大肠埃希菌、沙门菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和耐万古霉素屎肠球菌。