KR101924808B1 - 극지 어류 유래의 신규한 항생 펩타이드 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 항균활성을 갖는 극지 어류 유래의 신규한 항생 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 식품 첨가제, 조성물 또는 항생용 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 항생 펩타이드는 다양한 병원성 미생물에 대하여 항균활성을 나타내고 세포독성이 낮으며 생체 내와 같은 높은 수준의 염 농도에서도 항균활성을 유지하므로, 인체에 안전한 식품 첨가제, 조성물 또는 항생용 약학적 조성물 분야에서 다양하게 사용될 수 있다.

Description

극지 어류 유래의 신규한 항생 펩타이드{Novel antimicrobial peptides from Antarctic fishes}
본 발명은 항균활성을 갖는 극지 어류 유래의 신규한 항생 펩타이드, 상기 펩타이드를 포함하는 식품 첨가제, 조성물 또는 항생용 약학적 조성물에 관한 것이다.
세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나이다. 현재까지는 감염성 질환을 치료하는데 항생제가 주로 사용되어 왔으나, 항생제의 오남용으로 인하여 많은 병원성 미생물이 항생제에 대해 저항성을 갖게 됨으로써 항생제 저항성을 갖는 세균을 죽일 수 있는 신규한 항생 물질에 대한 요구가 증가되어 왔다. 항생 펩타이드는 이러한 문제점에 대한 대안이 될 수 있으며 새로운 항생 펩타이드의 개발이 주목받고 있다.
항생 펩타이드는 살아있는 유기체 대부분에 의해 자연적으로 생성되며, 미생물에 대한 살균력을 지닌 크기가 작은 펩타이드를 지칭한다. 이러한 항생 펩타이드는 구조적으로 세 개의 그룹으로 나누어지는데, 첫 번째는 시스테인이 풍부한(cysteine-rich) β-시트 펩타이드이고, 두 번째는 α-나선 양친매성 분자이며, 세 번째는 프롤린이 풍부한(proline-rich) 펩타이드이다. 이들 항균 펩타이드들은 숙주 방어 및 선천적 면역계에 있어서 중요한 역할을 담당하는 것으로 알려져 있으며, 아미노산 서열에 따라 다양한 구조를 갖는데, 이들 구조 중 가장 많이 존재하는 것은 시스테인(cysteine) 잔기가 없고 양친화성 알파 나선형을 형성하는 구조이며, 곤충에서 발견된 항균 펩타이드인 세크로핀(cecropin)이 이러한 구조를 갖는다. 이러한 구조적 특성으로 인해 항균 펩타이드들은 미생물의 인지질 막 표면에 결합된 후, 막으로 삽입되어 구멍을 형성하게 된다. 항생 펩타이드는 세균의 세포막에 선택적으로 작용하여 세포막을 파괴함으로써 세균을 사멸시키는 작용기전을 가지고 있기 때문에, 기존 항생제들의 작용기전들과 전혀 다른 새로운 기전이므로, 내성균 극복의 대안으로서 가치가 높은 것이다. 일반적으로 항생 펩타이드들은 그램 양성 및 그램 음성균과 진균 및 바이러스를 비롯하여 암세포 등에 대해서까지 폭넓은 항생 작용을 나타내며, 자연 물질이므로 약으로 개발될 경우 부작용이 적을 것으로 예상되고 있다. 또한, 제제학적인 측면에서도 항생 펩타이드는 수용성과 지용성을 모두 가지는 양성 친화적 성질을 가지고 있기 때문에 약물로 개발시 흡수 및 약물수송 등에서도 매우 유리할 것으로 기대되고 있다.
한편, 어류는 다양한 병원체에 노출되는 환경에 서식하므로 새로운 항생 펩타이드를 발견하는데 중요한 자원으로 사용될 수 있고, 어류에서 발견된 항생 펩타이드에는 Pardaxin, misgurin, cathelicidin, defensin, NK-lysin, hepcidin, 및 piscidin 등이 있다. 현재 어류 중에서도 낮은 온도 환경에서 서식하는 극지 어류에서 유래한 항생 펩타이드에 대한 연구는 미비한 실정이다.
이에 본 발명자들은 극지 어류 유래의 신규한 항생 펩타이드를 동정하고 이들 항생 펩타이드의 항균활성을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 식품 첨가제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 항생 펩타이드는 다양한 병원성 미생물에 대하여 항균활성을 나타내고 세포독성이 낮으며 생체 내와 같은 높은 수준의 염 농도에서도 항균활성을 유지하므로, 인체에 안전한 식품 첨가제, 방부용 조성물 또는 항생용 약학적 조성물 분야에서 다양하게 사용될 수 있다.
도 1은 공지된 항생 펩타이드들과 본 발명의 펩타이드의 서열 비교 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 공지된 항생 펩타이드들과 본 발명의 펩타이드의 계통수 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 항생 펩타이드의 2차 구조를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4는 본 발명의 항생 펩타이드의 용혈활성을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 제공한다.
본 발명에서 용어 “항생 펩타이드(antimicrobial peptide)”는 동식물을 비롯한 대부분의 생명체들이 감염과 같은 외부 위험으로부터 스스로를 보호하기 위해 사용하는 면역 물질을 지칭하는 것으로, 항균 펩타이드로도 지칭될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드는 다양한 그람 음성균 및 그람 양성균에서 항균활성을 나타내고, 적혈구에 대한 용혈활성이 거의 없어 생체내에서 낮은 세포독성을 나타낸다. 또한 생체 내와 같은 높은 수준의 염 농도에서도 항균활성을 유지하므로, 기존의 항생제를 대체할 수 있는 항생 물질로 유용하게 사용될 수 있다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드는 극지 어류인 Notothenia coriiceps로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드는 극지 어류인 Parachaenichthys charcoti로부터 유래된 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 분자량이 2487.8인 것이 바람직하고, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 펩타이드는 분자량이 2419.8인 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항생 펩타이드는 C 말단이 아미드화(c-terminal amidation)된 형태일 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균, 항생제 내성 균주, 사상균 및 효모로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상에 대해 항균활성을 갖는다. 상기 그람 양성균은 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 또는 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)를 포함할 수 있다. 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사(Psedomonas aeruginosa), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 시겔라 소네이(Shigella sonnei), 사이크로박터 스피시스(Psychrobacter sp.), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 캄벨리(Vibrio campbellii), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii), 비브리오 불리리쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 또는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)를 포함할 수 있다.
본 발명에서 “항생제 내성 균주”는 항생제에 내성을 가지므로 기존의 항생제가 항균 활성을 갖지 않는 균주를 지칭한다. 본 발명의 항생 펩타이드는 기존 항생제들의 작용기전들과 전혀 다른 새로운 기전을 통해 항균활성을 나타내므로 항생제 내성 균주에 대한 항균활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드는 호냉성 미생물에 항균활성을 갖는 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 항생 펩타이드는 항미생물 제제, 항바이러스 제제 및 항진균제로서 광범위하게 사용될 수 있으며, 적용될 수 있는 범위로는 식물, 동물 및 인간에게 널리 해롭게 작용하고 있는 미생물, 예컨대 바이러스, 그람 양성균, 그람 음성균, 곰팡이, 효모 및 원생동물 등에 적용될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드는 단독으로 사용될 수도 있고, 용도에 따라 다른 항생제, 예를 들어 에리스로마이신(erythromycin), 테트라사이클린(tetracycline), 아지트로마이신(azithromycin), 반코마이신 및 세팔로스포린(cephalosporins) 등과 함께 사용될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드는 2011년부터 가축 항생제 사용이 금지됨에 따라, 천연유래의 항생제 대체물질의 개발이 절실한 상황에서 항생제 대체물질로서 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 식품 첨가제를 제공한다.
본 발명의 항생 펩타이드는 식품 첨가제뿐만 아니라 이를 유효성분으로 함유하는 사료 첨가제로도 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드가 사료 첨가제로 사용될 경우, 어류용인 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 과자류, 빵류, 면류 등과 같은 각종 식품류, 물, 청량음료, 과실음료 등의 드링크류, 껌, 차, 비타민 복합제, 조미료류, 건강기능 식품류 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함한다.
본 발명의 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합량은 그의 사용 목적(예방 또는 개선용)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강식품 중의 상기 펩타이드의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%, 바람직하게는 0.1 내지 5 중량%로 가할 수 있으며 건강음료 조성물에는 100 을 기준으로 0.01 내지 5.0 g, 바람직하게는 0.01 내지 1.0 g의 비율로 첨가할 수 있다. 그러나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 펩타이드를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어, 말토스, 수크로즈 등 및 폴리사카라이드, 예를 들어, 덱스트린, 사이클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리스리톨 등의 당알코올이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마킨, 스테비아 추출물 등), 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탄 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 당 일반적으로 약 0.1 내지 2.0 g, 바람직하게는 약 0.1 내지 1.0g이다.
본 발명의 건강기능식품은 기재로 되는 식품의 제조공정 중에 상술한 본 발명의 아미노산 서열로 구성되는 항생 펩타이드를 첨가하는 공정을 가함으로써 또는 기재로 되는 식품의 제조 후에 상술한 본 발명의 아미노산 서열로 구성되는 항생 펩타이드를 첨가하는 공정을 가함으로써 용이하게 얻을 수 있다. 이때 필요에 따라 맛과 냄새 교정제를 첨가하여도 좋다.
상기 외에 본 발명의 항생 펩타이드를 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 중점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 항생 펩타이드를 천연 과일 주스 및 과일 주스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 본 발명의 항생 펩타이드를 100 중량부 당 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 조성물은 방부용, 항생용 또는 항균용으로 사용될 수 있다.
상기 항생 펩타이드는 세포독성이 없고, 그람 음성균 및 그람 양성균 뿐만 아니라 사상균, 효모에 대해서도 우수한 항균활성을 가지므로, 미생물이 증식할 수 있는 모든 물질 및 식품에 있어서 방부용 조성물로 유용하게 이용될 수 있다. 상기 용도는 식품의 방부용 조성물에 한정되지 않으며, 화장품 보존제, 의약품 보존제, 식품 보존제 등 항균활성이 필요한 모든 물질에 미생물의 증식을 억제하는 보존제 등으로 사용이 가능하다.
또한, 상기 항생 펩타이드는 그람 음성균 및 그람 양성균 뿐만 아니라 다양한 미생물에 대해서 우수한 항균활성을 가지므로 항생용 또는 항균용도로 사용이 가능하다.
또한, 상기 항생 펩타이드를 포함하는 조성물은 화장료 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 화장료 조성물은 상기 항생 펩타이드 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예켠대 황산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.
본 발명의 화장료 조성물에 있어서, 통상적으로 함유되는 화장료 조성물에 본 발명의 펩타이드는 0.1 내지 50중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%의 양으로 첨가될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수(스킨), 영양 화장수(밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서 상기 항생 펩타이드는 그람 음성균과 그람 양성균을 포함하는 다양한 미생물에 대해 항균활성을 나타내므로, 세균 감염증(bacterial infection)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다. 본 발명에서 “세균 감염증”은 병원성 세균이 인체에 기생함으로써 생기는 질병의 총칭으로, 예컨대 콜레라균에 의한 콜레라, 이질균에 의한 세균성 이질, 백일해균에 의한 백일해, 패혈증, 결핵, 살모넬라균이나 비브리오균 등에 의한 세균성 식중독 등이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 펩타이드는 임상투여시 경구로 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있다.
비경구 투여는 직장, 정맥, 복막, 근육, 동맥, 경피, 비강(nasal), 흡입, 안구 및 피하와 같은 경구 이외의 투여경로를 통한 투여를 의미할 수 있다.
즉, 본 발명의 항생 펩타이드는 실제의 비경구의 여러가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 리우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 항생 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 황산화제(antioxidants), 킬레이트화제(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.
본 발명의 항생 펩타이드의 유효용량은 0.01 내지 100 mg/kg이고, 바람직하게는 0.1 내지는 10 mg/kg 이며, 하루 1 회 내지 3 회 투여될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규한 펩타이드의 총 유효량은 볼루스(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 주입(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법(fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규한 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.
본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 극지 어류 유래의 항생 펩타이드 동정
극지 어류 유래의 항생 펩타이드를 탐색하기 위하여 다음과 같이 수행하였다.
양이온성 펩타이드인 piscidin은 그람 양성균과 그람 음성균에 대하여 넓은 범위의 항균활성을 갖는 것으로 알려져 있으며, moronecidin은 배스에서 분리된 piscidin 패밀리 중 하나이다. BlastP를 이용하여 극지 어류인 Notothenia coriiceps(N. coriiceps)의 게놈을 분석하였고, moronecidin-유사 펩타이드를 암호화하는 유전자를 동정하였다. 동정한 N. coriiceps 유래의 moronecidin-유사 펩타이드를 암호화하는 유전자는 4개의 엑손을 포함하는데, 이는 77개의 아미노산을 암호화한다.
또한, N. coriiceps 유래의 moronecidin-유사 펩타이드의 간 내에서의 mRNA 서열로부터 콘티그(contig)를 얻고, 이로부터 또다른 극지 어류인 Parachaenichthys charcoti(P. charcoti) 유래의 moronecidin-유사 펩타이드의 cDNA 서열을 얻었다. 상기 cDNA 서열은 79개의 아미노산을 암호화한다.
실시예 2: 항생 펩타이드(antimicrobial peptide; AMP)의 합성
상기 실시예 1에서 동정한 신규한 항생 펩타이드 서열을 기초로 하여, C 말단이 아미드화 된 항생 펩타이드를 Peptron(Republic of Korea)으로부터 상업적으로 합성하였으며, 순도는 95%로 하였다. ExPASy 웹사이트 (http://web.expasy.org/protparam/) 상의 ProtParam을 사용해서 이론적인 등전점(pI) 및 분자량(MW)을 예측하였으며, 하기의 표 1에 합성한 펩타이드의 정보를 나타내었다.
명칭 서열 약어 pI 분자량 서열번호
Hybrid striped bass
(잡종 줄무늬 배스)		 FFHHIFRGIVHVGKTIHKLVTG moro-NH2 11.17 2544.0
Notothenia
coriiceps 		FFWHHIGHALDAAKRVHGMLSG moroNC-NH2 8.78 2487.8 1
Parachaenichthys charcoti FFGHLFRGIINVGKHIHGLLSG moroPC-NH2 11.00 2419.8 2
이하, N. coriiceps 유래의 항생 펩타이드를 moroNC-NH2로 지칭하고 P. charcoti 유래의 항생 펩타이드를 moroPC-NH2로 지칭한다.
합성한 항생 펩타이드는 사용하기 직전에 각각의 인산 완충액(pH7.4) 내에서 100 μM로 재구성하여 사용하였다.
실시예 3: 항생 펩타이드의 특성 분석
3.1 항생 펩타이드와 piscidin의 서열 비교
공지된 항생 펩타이드인 piscidin과 극지 어류로부터 동정한 항생 펩타이드(moroNC-NH2, moroPC-NH2)의 서열 비교를 위해서, ClustalW (http://www.genome.jp/tools/clustalw/)를 이용하였다. 서열 비교 결과를 도 1에 나타내었으며, 서열 비교에 사용된 piscidin의 서열 정보는 다음과 같다: Accession number: dicentracin (European seabass, Dicentrarchus labrax) AAP58960.1; moronecidin (Nile tilapia, Oreochromis niloticus) XP_003456662; dicentracin (Sablefish, Anoplopoma fimbria) ACQ58110.1; moronecidin (Mandarin fish, Siniperca chuatsi) AAV65044.1; moronecidin (Nile tilapia, Oreochromis niloticus) XP_003456661.1; moronecidin (Sablefish, Anoplopoma fimbria) ACQ57928.1; moronecidin (Striped seabass, Morone saxatilis) Q8UUG0; moronecidin (White bass, Morone chrysops) Q8UUG2.1; piscidin (Brown-marbled grouper, Epinephelus fuscoguttatus) ADE06665.1; piscidin (Duskytail grouper, Epinephelus bleekeri) ADY86110.1; piscidin (Hong Kong grouper, Epinephelus akaara) ACE78290.1; piscidin (Hybrid striped seabass, Morone chrysops ×Morone saxatilis) ADP37959.1; piscidin (Hybrid striped seabass, Morone chrysops ×Morone saxatilis) ADP37960.1; piscidin (Large yellow croaker, Larimichthys crocea) ACE78289.1; piscidin (Longtooth grouper, Epinephelus bruneus) AEM37732.1; piscidin (Malabar grouper, Epinephelus malabaricus) ADY86112.1; piscidin (Orange-spotted grouper, Epinephelus coioides) AFM37317.1; moronecidin (Antarctic black rockcod, Notothenia coriiceps) XP_010768425.1; moronecidin (Antarctic dragonfish, Parachaenichthys charcoti) XXXXXXXX; pleurocidin (Pleuronectes americanus) AAF17252.1; piscidin (Icefish, Chionodraco hamatus) CBX55949.1; piscidin (Atlantic cod, Gadus morhua) ACS91329.1.
도 1에 나타낸 바와 같이, moroPC-NH2의 아미노산 서열은 잡종 줄무늬 배스의 항생 펩타이드 서열과 64%의 상동성을 갖고, Chionodraco hamatus로부터 유래한 항생 펩타이드와 78%의 상동성을 나타내어 비교적 높은 수준의 서열 상동성을 보였다. moroNC-NH2의 서열은 잡종 줄무늬 배스 유래의 항생 펩타이드인 moronecidin과 43%의 상동성을 가지며, 공지된 항생 펩타이드의 서열과 비교시 낮은 수준의 서열 상동성을 나타냄을 확인하였다. 또한, moroNC-NH2, moroPC-NH2에서 신호 펩타이드(signal peptide)와 성숙 펩타이드(mature peptide)가 모두 보존되어 있음을 확인하였다.
3.2 항생 펩타이드의 계통학적 분석
moroNC-NH2, moroPC-NH2에 대한 계통학적 분석을 위하여, 상기 실시예　3.1에서 사용한 다른 piscidin의 NCBI 데이터베이스로부터 아미노산 서열을 얻었고, 전체 길이의 아미노산 서열에 대해 Mega 5 프로그램을 사용한 neighbor-joining법에 의해서 계통수 분석을 수행하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, moroPC-NH2는 C. hamatus 유래의 항생 펩타이드와 좀 더 연관되어 있는 반면, moroNC-NH2는 잡종 줄무늬 배스 유래의 piscidin-4 및 piscidin-5와 더욱 연관되어 있음을 확인하였다. moroNC-NH2 및 moroPC-NH2는 잡종 줄무늬 배스 유래의 piscidin-4 및 piscidin-5와 함께 단일 계통에 위치함을 확인하였다.
3.3 항생 펩타이드의 2차 구조 분석
moroNC-NH2, moroPC-NH2의 2차 구조를 분석하기 위해서, ExPASy 웹사이트 (http://expasy.org/tools/)의 HeliQuest를 사용하여 항생 펩타이드의 Schiffer-Edmundson wheel representation을 얻었다. 그 결과를 도 3에 나타내었다. moro-NH2의 구조를 도 3A에, moroNC-NH2의 구조를 도 3B에, moroPC-NH2의 구조를 도 3C에 나타내었고, 소수성 잔기를 노란색, 양으로 하전된 잔기를 파란색, 음으로 하전된 잔기를 붉은색으로 나타내었으며, 특정 극성 잔기 중 트레오닌 및 세린을 보라색, 아스파라긴 및 글루타민을 분홍색, 히스티딘을 하늘색으로 나타내었다. 화살표는 나선의 소수성 모멘트(helical hydrophobic moment)를 나타낸다.
도 3에 나타낸 바와 같이, moroNC-NH2, moroPC-NH2의 성숙 펩타이드는 양친매성 알파 나선 구조를 나타내며, 소수성 잔기와 친수성 잔기가 알파 나선의 반대 방향에 위치함을 확인하였다.
또한 pI를 분석한 결과, 잡종 줄무늬 배스 유래의 성숙 moronecidin(moro) 및 moroPC-NH2의 경우 pI 값이 각각 11.17과 11.0으로 pI 값이 8.77인 moroNC-NH2보다 상대적으로 높은 값을 갖는 것을 확인하였다.
또한 소수성 스코어(score)를 분석한 결과, moroNC-NH2는 0.449로 0.627인 moro 또는 0.617인 moroPC-NH2보다 상대적으로 낮은 값을 갖는 것을 확인하였다.
또한 HeliQuest를 사용하여 나선의 양친매성을 측정하는 소수성 모멘트를 분석한 결과, moro-NH2, moroPC-NH2, moroNC-NH2에서 각각 0.556, 0.559, 0.365로 측정됨을 확인하였다.
실시예 4: 항생 펩타이드의 항균활성 분석
4.1 미생물 종에 따른 항생 펩타이드의 항균활성 분석
미생물 종에 따른 항생 펩타이드의 항균활성을 분석하기 위하여, 공지된 방법으로 최소저지농도(minimal inhibitory concentration; MIC)를 측정하였다. 구체적으로는, MIC를 결정하기 위해서 하기 표 2에 나타낸 미생물을 18시간 동안 96-웰 플레이트(Bioneer, Republic of Korea)에서 항생 펩타이드와 함께 배양하였다. 각각의 웰에 90 μL의 미생물 세포 현탁액을 1 ×105 cfu/mL로 포함하게 하고, 배양 배지 내에서 연속적으로 희석된 10 μL의 각각의 항생 펩타이드를 포함하게 하였다. 사용된 미생물은 모두 KCTC, ATCC, PAMC로부터 분리되었고, 액체 배양액으로는 tryptic soy broth (BD Diagnostic Systems, Sparks, MD, USA) 및 nutrient broth (BD Diagnostic Systems)를 사용하였다.
명칭 미생물 유형 배양 배지 배양 온도(℃)
Enterobacter cloacae
(ATCC 13047)		 그람 음성균 Nutrient broth 30
Shigella sonnei
(ATCC 29930)		 그람 음성균 Nutrient broth 30
Psychrobacter sp.
(PAMC 21119)		 그람 음성균 Nutrient broth 25
Psychrobacter sp.
(PAMC 25501)		 그람 음성균 Nutrient broth 25
Escherichia coli DH5α 그람 음성균 Nutrient broth 30
Flavobacteria sp.
(PAMC 22217)		 그람 음성균 Nutrient broth 15
Lacinutrix algicola
(AKS293T)		 그람 음성균 Nutrient broth 15
Enterococcus faecalis
(ATCC 29212)		 그람 양성균 Tryptic soy broth 30
Streptococcus pyogenes
(ATCC 19615)		 그람 양성균 Tryptic soy broth 30
Staphylococcus aureus
(ATCC 33591)		 그람 양성균 Nutrient broth 30
Listeria monocytogenes
(ATCC 15313)		 그람 양성균 Nutrient broth 30
Aspergillus fumigatus
(ATCC 26430)		 사상균 Nutrient broth 30
Candida tropicalis
(ATCC 20115)		 효모 Nutrient broth 30
상기 방법으로 moroPC-NH2 및 moroNC-NH2의 항균활성을 측정한 결과를 표 3에 나타내었다.
　 　 항생 펩타이드 (μM)
moro-NH 2 moroNC-NH 2 moroPC-NH 2
그람 음성균 　 　 　
Enterobacter cloacae
(ATCC 13047)		 25 >50 25
Shigella sonnei (ATCC 29930) 5 12.5 5
Psychrobacter sp.
(PAMC 25501)		 2.5 5 2.5
E. coli DH5α 5 12.5 5
그람 양성균
Enterococcus faecalis
(ATCC 29212)		 5 >50 25
Streptococcus pyogenes
(ATCC 19615)		 2.5 25 2.5
Staphylococcus aureus
(ATCC 33591)		 2.5 25 5
Listeria monocytogenes
(ATCC 15313)		 2.5 12.5 5
효모균
Candida tropicalis
(ATCC 20115)		 5 5 5
표 3에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 극지 어류 유래의 항생 펩타이드는 그람 음성균, 그람 양성균 및 효모균에 대하여 높은 항균활성을 나타냄을 확인하였다. 또한, moroPC-NH2는 넓은 스펙트럼의 항균활성을 갖는 것으로 알려진 moro-NH2와 유사한 수준의 넓은 스펙트럼의 항균활성을 갖고, moroNC-NH2는 일부 미생물에 대하여 더욱 특이적인 항균활성을 갖는 것을 확인하였다.
4.2 온도에 따른 항생 펩타이드의 항균활성 분석
본 발명의 항생 펩타이드는 2℃ 이하의 낮은 온도 환경에서 생존하는 극지 어류에서 유래한 것이므로, 온도에 따라 항균활성이 변화하는지 여부를 확인하기 위해서, 25℃까지의 온도 범위에서는 Psychrobacter sp. PAMC 25501에 대하여, 15-37℃ 온도 범위에서는 E. coli DH5α에 대하여 항균활성 변화를 측정하였다. Psychrobacter sp. PAMC 25501에 대한 항균활성 측정 결과를 하기 표 4에, E. coli DH5α에 대한 항균활성 측정 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
Psychrobacter sp. (PAMC 25501) 　 항생 펩타이드 (μM)
moro-NH 2 moroNC-NH 2 moroPC-NH 2
5℃ 2.5 2.5 2.5
15℃ 2.5 2.5 2.5
25℃ 2.5 5 2.5
E. coli DH5α 　 항생 펩타이드 (μM)
moro-NH 2 moroNC-NH 2 moroPC-NH 2
15℃ 5 12.5 5
20℃ 5 12.5 5
30℃ 5 12.5 5
37℃ 5 12.5 5
표 4 및 표 5에 나타낸 바와 같이, 온도 변화에 따른 항균활성의 변화가 발견되지 않았다.
추가적인 검증을 위하여, 호냉성 세균인 Lacinutrix algicola AKS293T, Flavobacteria sp. PAMC 22217, Psychrobacter sp. PAMC 21119에 대한 항균활성을 측정하고 그 결과를 표 6에 나타내었다.
　 　 항생 펩타이드 (μM)
moro-NH 2 moroNC-NH 2 moroPC-NH 2
Psychrobacter sp. PAMC 21119 1.25 2.5 1.25
Psychrobacter sp. PAMC 25501 1.25 2.5 1.25
Flavobacteria sp. PAMC 22217 2.5 5 1.5
Lacinutrix algicola AKS293T 1.25 12.5 1.25
표 6에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 항생 펩타이드는 상기 확인한 세균 뿐만 아니라 호냉성 미생물에 대한 항균활성도 가지며, 이는 moro-NH2와 유사한 수준임을 확인하였다.
4.3 염에 따른 항생 펩타이드의 항균활성 분석
항생 펩타이드는 정전기적 인력에 의해서 미생물 막에 접근하는 것으로 알려져 있고, 정전기적 인력은 염이 막을 파괴시킴으로써 저해될 수 있다. 이러한 관점에서 항생 펩타이드는 생리학적 염 농도인 150 mM NaCl, 3 mM CaCl2, 및 2mM MgCl2[Blood Test Resultsnormal ranges (http://www.bloodbook.com/ranges.html)]에서 항균활성이 유지되어야 치료 용도로 사용될 수 있다.
항생 펩타이드의 항균활성에 대한 양이온의 효과를 확인하기 위해서, 염 없이 또는 NaCl(0-1000 mM), MgCl2(0-40mM), 또는 CaCl2(0-20mM)와 같이 다양한 농도의 염을 포함하는 변형 LB 배지 내에서 Psychrobacter sp. PAMC 25501와 항생 펩타이드를 20℃에서 24시간 동안 배양하였다. 상기 배양 후 항균활성을 측정한 결과를 표 7에 나타내었다.
Psychrobacter sp. PAMC 25501
　 　 Moronecidin (μM)
moro-NH 2 moroNC-NH 2 moroPC-NH 2
대조군 2.5 5 2.5
NaCl (mM)
50 2.5 5 2.5
100 2.5 6.25-12.5 2.5
500 2.55 12.5 2.55
1000 5 25 5
MgCl 2 (mM)
1 2.5 25 2.5
5 12.5 >50 12.5
10 12.5 >50 12.5
50 >50 >50 >50
100 >50 >50 >50
CaCl 2 ( mM )
1 2.5 5 2.5
5 5 25 5
10 6.25-12.5 50 12.5
50 50 >50 50
100 50 >50 >50
표 7에 나타낸 바와 같이, 세 가지 항생 펩타이드 모두 염 농도가 증가함에따라 항균활성이 감소하고, moroPC-NH2의 항균활성 변화는 moro-NH2와 유사한 수준임을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 항생 펩타이드는 생체 내와 유사한 수준(150 mM NaCl, 3 mM CaCl2, 및 2mM MgCl2) 및 그 이상의 높은 수준의 염 농도에서도 항균활성이 감소하지 않았으므로 생체 내에서 항생용 물질로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5: 항생 펩타이드의 세포독성 분석
항생 펩타이드의 세포독성을 분석하기 위해서, 일부 유형의 항생 펩타이드가 포유동물의 적혈구를 용혈시킬 수 있으므로 치료지수(therapeutic index)로서 용혈활성을 분석하였다. 임상에서 사용하기 위하여 낮은 용혈활성을 갖는 것이 중요하다.
항생 펩타이드의 용혈활성을 분석하기 위해서, 양 혈액 및 말 혈액(Oxoid Ltd., London, United Kingdom)을 사용하였다. 신선하게 포장된 양 및 말의 적혈구 1 mL을 인산 완충액 (pH 7.4)으로 세척하였다. 마이크로센트리퓨지 튜브 내에서 50, 25, 12.5, 6.25, 5, 2.5, 1.25, 0.625, 0.5, 0.25, 0.125, 0.0625 μM의 항생 펩타이드를 90 μL의 1% 적혈구 현탁액(1:10 희석)에 첨가하였다. 상기 시료를 37℃에서 30분 동안 배양한 후, 10분 동안 4000 rpm으로 상온에서 원심분리하였다. 상층액을 조심스럽게 96-웰 플레이트에 옮기고, 405 nm에서 O.D를 측정하였다. 용혈 비율은 100% 용해되는 0.1% SDS로 현탁한 적혈구를 처리함으로써 얻어진 경우와 비교하여 결정하였으며 용혈활성 분석 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, 극지 어류 유래의 항생 펩타이드의 경우 상대적으로 낮은 용혈활성을 나타내는 것을 확인하였다. moroNC-NH2의 용혈활성은 가장 높은 농도인 50 μM에서 10% 이하로 매우 낮았다. 25 μM 농도에서는 moroNC-NH2 및 moroPC-NH2 모두 10% 이하의 용혈활성을 나타내었다. 반면, moro-NH2는 양 적혈구의 경우 최대 25%, 말 적혈구의 경우 최대 62%의 용혈활성을 나타내는 것을 확인하였다.
따라서 본 발명의 극지 어류 유래의 항생 펩타이드는 대표적인 항생 펩타이드로 알려진 moronecidin에 비하여 매우 낮은 용혈활성을 가지므로 세포독성이 낮아 임상 치료에서 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.
상기 결과들을 종합해보면, 본 발명의 극지 어류 유래의 신규한 항생 펩타이드는 다양한 그람 음성균 및 그람 양성균에서 항균활성을 나타내고, 적혈구에 대한 용혈활성이 거의 없어 생체내에서 낮은 세포독성을 나타낸다. 또한 생체 내와 같은 높은 수준의 염 농도에서도 항균활성을 유지하므로, 기존의 항생제를 대체할 수 있는 항생 물질로 유용하게 사용될 수 있다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한 첨부된 청구 범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
<110> Korea Institute of Ocean Science & Technology <120> Novel antimicrobial peptides from Antarctic fishes <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> Notothenia coriiceps <400> 1 Phe Phe Trp His His Ile Gly His Ala Leu Asp Ala Ala Lys Arg Val 1 5 10 15 His Gly Met Leu Ser Gly 20 <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> Parachaenichthys charcoti <400> 2 Phe Phe Gly His Leu Phe Arg Gly Ile Ile Asn Val Gly Lys His Ile 1 5 10 15 His Gly Leu Leu Ser Gly 20

Claims (13)

  1. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드는 Parachaenichthys charcoti로부터 유래된 것인, 항생 펩타이드.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항생 펩타이드의 C 말단은 아미드화된 것인, 항생 펩타이드.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항생 펩타이드는 그람 양성균, 그람 음성균, 항생제 내성 균주, 사상균 및 효모로 구성된 군으로부터 선택된 1종 이상에 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항생 펩타이드.
  6. 제5항에 있어서, 상기 그람 양성균은 스태필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 엔테로코커스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes), 리스테리아 모노사이토게네스(Listeria monocytogenes), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 마이크로코커스 루테우스(Micrococcus luteus), 또는 스트렙토코커스 이니에(Streptococcus iniae)인, 항생 펩타이드.
  7. 제5항에 있어서, 상기 그람 음성균은 대장균(Escherichia coli), 슈도모나스 에루기노사(Psedomonas aeruginosa), 버크홀데리아 세파시아(Burkholderia cepacia), 시겔라 소네이(Shigella sonnei), 사이크로박터 스피시스(Psychrobacter sp.), 에어로모나스 하이드로필라(Aeromonas hydrophila), 엔테로박터 클로아케(Enterobacter cloacae), 에드워드시엘라 타르다(Edwardsiella tarda), 비브리오 알기노리티쿠스(Vibrio alginolyticus), 비브리오 캄벨리(Vibrio campbellii), 비브리오 하베이(Vibrio harveyi), 비브리오 오르달리(Vibrio ordalii), 비브리오 불리리쿠스(Vibrio vulnificus), 비브리오 파라헤모라이티쿠스(Vibrio parahaemolyticus), 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa), 살모넬라 엔테리카(Salmonella enterica), 또는 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri)인, 항생 펩타이드.
  8. 제1항에 있어서, 상기 항생 펩타이드는 호냉성 미생물에 항균활성을 갖는 것을 특징으로 하는, 항생 펩타이드.
  9. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 식품 첨가제.
  10. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 항균 또는 방부용 조성물.
  11. 삭제
  12. 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드를 포함하는 항생용 약학적 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 항생 펩타이드는 세균 감염증의 예방 또는 치료에 사용되는 것인, 항생용 약학적 조성물.
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